Khảo Sát Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Khả Năng Sinh Protease Của Các Dòng Nấm Mốc Aspergillus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NC&PT CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CỦA CÁC DỊNG NẤM MỐC ASPERGILLUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP NI CẤY BỀ MẶT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS NGUYỄN VĂN THÀNH NGUYỄN THỊ BẢO NGỌC VIỆN NC & PT CNSH MÃ SỐ SINH VIÊN: 3064466 LỚP CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 05/2010 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Nguyễn Văn Thành Nguyễn Thị Bảo Ngọc DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người thân yêu quan tâm, dìu dắt giúp đỡ tơi hơm Con biết ơn cha mẹ nuôi nấng, yêu thương dạy dỗ với bao gian lao khó nhọc Cảm ơn ngơi trường u dấu thầy cô truyền đạt cho em nhiều kiến thức để em hồn thành tốt luận văn chuẩn bị cho em hành trang để bước vào đời Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Văn Thành Thầy truyền dạy cho em kiến thức quý báu nhiệt tình hướng dẫn em hồn thành tốt luận văn Em cảm ơn cô chủ nhiệm Trần Thị Xuân Mai Cô quan tâm nhiều đến chúng em suốt năm qua Cảm ơn tất anh chị bạn phịng thí nghiệm giúp đỡ nhiều thời gian thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bạn lớp Cơng nghệ sinh học Khóa 32 Những người bạn học tập chia sẻ niềm vui nỗi buồn suốt năm tháng Đại học Cuối cùng, xin gửi đến tất thầy cô, bạn bè Viện NC&PT Công nghệ Sinh học lời cảm ơn chân thành Cảm ơn tạo cho môi trường học tập thật tốt thật thật ấm áp với kỷ niệm quên Cần Thơ, ngày 10 tháng 05 năm 2010 Nguyễn Thị Bảo Ngọc Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC KẾT QUẢ Đề tài tiến hành khảo sát yếu tố (ẩm độ, thời gian, mật số bào tử, đạm vô cơ, đạm hữu cơ) ảnh hưởng đến khả sinh protease nấm mốc Aspergillus dựa hoạt tính enzyme sinh Trong năm dịng nấm mốc Aspergillus sử dụng, dòng Aspergillus oryzae Đại Học Khoa học Tự nhiên TP HCM (dịng A3) có khả sinh protease cao Ẩm độ ban đầu thích hợp 45%, chủng ml bào tử có mật số 106 bào tử/gck ni 96 cho hoạt tính đặc hiệu cao (16,158 U/gck) Trong nguồn đạm protein bổ sung, bột đậu tương có khả chất cảm ứng cho hoạt tính enzyme cao (15,875 U/gck, tăng 25,938 % so với nghiệm thức đối chứng) Trong loại đạm phi protein bổ sung, diammonium phosphat (DAP) cho hoạt tính enzyme cao (16,988 U/gck, tăng 136,833% so với nghiệm thức đối chứng) Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT MỤC LỤC DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC KẾT QUẢ DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .1 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU I ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MỐC I.1 Dinh dưỡng tăng trưởng nấm mốc I.2 Giống Aspergillus: II ĐẠI CƯƠNG VỀ ENZYME PROTEASE .4 III CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME .5 III.1 Ảnh hưởng nhiệt độ III.2 Ảnh hưởng pH môi trường .5 III.3 Ảnh hưởng chất hoạt hoá IV THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM MỐC SINH PROTEASE IV.1 Nguồn Carbon IV.2 Nguồn đạm V SINH TỔNG HỢP ENZYME CẢM ỨNG VI PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY BỀ MẶT CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 11 I Phương tiện .11 II Phương pháp nghiên cứu 12 II.1 Chuẩn bị mốc giống 12 II.2 Phương pháp nuôi cấy nấm mốc sinh enzyme protease 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT II.3 Phương pháp ly trích enzyme 13 II.4 Xác định ẩm độ môi trường nuôi cấy 14 II.5 Xác định mật số bào tử trước chủng vào môi trường 14 II.6 Xác định hoạt tính chế phẩm protease từ nấm mốc phương pháp Anson cải tiến .14 III Thí nghiệm .14 III.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả sinh protease dịng nấm mốc 14 III.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng ẩm độ lên khả sinh enzyme protease nấm mốc .15 III.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy mật số bào tử mốc đến hoạt tính protease sinh 16 III.4 Thí nghiệm 4: Thí nghiệm ảnh hưởng đạm protein bổ sung .17 III.5 Thí nghiệm 5: Thí nghiệm ảnh hưởng bổ sung đạm phi protein 18 IV Phương pháp phân tích kết .19 V Địa điểm thời gian thực đề tài 19 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 I Thí nghiệm 1: Khảo sát khả sinh enzyme protease dòng Aspergillus .20 II Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng ẩm độ đến khả sinh protease nấm mốc .21 III Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy mật số bào tử chủng đến khả sinh protease nấm mốc 22 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng đạm protein bổ sung đến hoạt tính enzyme sinh 25 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng đạm phi protein bổ sung đến hoạt tính enzyme sinh .26 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 I.Kết luận .29 II.Kiến nghị 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO .30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT PHỤ LỤC PHẦN 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Xác định trực tiếp số lượng bào tử mốc Asp oryzae buồng đếm hồng cầu Xác định hoạt tính chế phẩm protease từ nấm mốc phương pháp Anson cải tiến Phương pháp xác định ẩm độ nguyên liệu PHẦN 2: BẢNG GIÁ TRỊ OD VÀ VẬT CHẤT KHƠ Ở CÁC THÍ NGHIỆM Ẩm độ mơi trường trước sau khử trùng Thí nghiệm 1: Khảo sát khả sinh protease dòng nấm mốc Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng ẩm độ đến khả sinh protease Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng thời gian mật số đến khả sinh protease Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng đạm protein bổ sung đến hoạt tính protease Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng đạm phi protein bổ sung đến hoạt tính protease PHẦN 3: PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Thí nghiệm 1: Khảo sát khả sinh protease dịng nấm mốc Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng ẩm độ đến khả sinh protease Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng thời gian mật số đến khả sinh protease Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng đạm protein bổ sung đến hoạt tính protease Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng đạm phi protein bổ sung đến hoạt tính protease Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Sinh tổng hợp enzyme nấm mốc phụ thuộc vào chất cảm ứng Bảng 2: Hoạt tính protease sinh bời dòng nấm mốc 20 Bảng 3: Hoạt tính protease theo ẩm độ 21 Bảng 4: Hoạt tính protease theo thời gian mật số bào tử 22 Bảng 5: Hoạt tính protease bổ sung loại đạm protein khác 25 Bảng 6: Hoạt tính enzyme bổ sung loại đạm phi protein 27 Bảng 7: Kết đo OD dựng đường chuẩn Tyrosin Phụ lục Bảng 8: So sánh ẩm độ dự kiến ẩm độ thực tế Phụ lục Bảng 9: Bảng giá trị OD %vck thí nghiệm Phụ lục Bảng 10: Bảng giá trị OD %vck thí nghiệm ảnh hưởng ẩm độ Phụ lục Bảng 11: Bảng giá trị OD %vck thí nghiệm ảnh hưởng thời gian mật sốPhụ lục Bảng 12: Bảng giá trị OD %vck thí nghiệm bổ sung đạm protein Phụ lục Bảng 13: Bảng giá trị OD %vck thí nghiệm bổ sung đạm phi protein Phụ lục Bảng 14: Phân tích ANOVA hoạt tính protease dịng Aspergillus Phụ lục Bảng 15: Phân tích LSD so sánh khác biệt nghiệm thức TN1 Phụ lục Bảng 16: Phân tích ANOVA hoạt tính protease ẩm độ khác Phụ lục Bảng 17: Phân tích LSD so sánh khác biệt nghiệm thức TN2 Phụ lục Bảng 18: Phân tích ANOVA hoạt tính protease theo thời gian mật số bào tử chủng Phụ lục Bảng 19: Phân tích LSD so sánh khác biệt nghiệm thức TN3 Phụ lục Bảng 20: Phân tích ANOVA hoạt tính protease với loại đạm protein bổ sung Phụ lục Bảng 21: Phân tích LSD so sánh khác biệt nghiệm thức TN4 Phụ lục Bảng 22: Phân tích ANOVA hoạt tính protease với loại đạm phi protein bổ sung Phụ lục Bảng 23: Phân tích LSD so sánh khác biệt nghiệm thức TN5 Phụ lục Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Biểu đồ hoạt tính enzyme sinh dịng mốc Aspergillus 20 Hình 2: Biểu đồ hoạt tính enzyme sinh ẩm độ 21 Hình 3: Biểu đồ hoạt tính enzyme sinh ni mốc Aspergillus mốc thời gian mật số bào tử chủng khác 23 Hình 4: Biểu đồ tương tác thời gian mật số bào tử chủng 25 Hình 5: Biểu đồ hoạt tính enzyme sinh bổ sung loại đạm protein 26 Hình 6: Biểu đồ hoạt tính enzyme bổ sung loại đạm phi protein 27 Hình 7: Biểu đồ đường chuẩn Tyrosin Phụ lục Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Enzyme protein có chức sinh học quan trọng, chất xúc tác phản ứng chuyển hóa chất thể sống Tuy nhiên, enzyme khơng có ý nghĩa cho q trình sống sinh vật mà cịn đóng vai trị quan trọng cơng nghệ chế biến thực phẩm, y dược học, công nghệ gen, xử lý chất thải… Enzyme có nguồn thực vật, động vật vi sinh vật (amylase mầm thóc, bromelin khóm, papain đu đủ, pepsin tripsin gan heo, rennin dày…) Tuy nhiên, thể động vật thực vật, số lượng enzyme cần tổng hợp gắn liền với nhu cầu sống thể phận thể lượng enzyme không đồng thấp Sản xuất enzyme từ động vật thực vật có hạn chế cần nguồn nguyên liệu lớn qui trình sản xuất phức tạp Vì vậy, nguồn enzyme chủ yếu sản suất từ vi sinh vật chúng có ưu điểm tốc độ sinh sản nhanh, sinh khối cao, hệ enzyme nấm mốc phong phú, sản xuất theo qui mơ cơng nghiệp dễ dàng giới hóa, tự động hóa Trên thị trường, nguồn enzyme vi sinh vật chiếm 40% tổng sản lượng enzyme giới (Godfrey & West, 1996) Trong vài thập kỷ gần đây, công nghiệp sản xuất chế phẩm enzyme có bước phát triển mạnh mẽ, số lượng enzyme sản xuất ngày tăng, phương pháp tinh chế ly trích ngày hoàn thiện, lĩnh vực ứng dụng enzyme vào sống mở rộng Trong số enzyme ứng dụng công nghiệp, protease chiếm khoảng 60% thị trường enzyme giới ứng dụng rộng rãi chế biến thực phẩm, công nghiệp thuộc da, sản xuất bánh mì…(Sangeeta Negi and R Banerjee, 2006) Tuy nhiên, protease nấm mốc chiếm tỉ lệ thấp giá thành sản phẩm cịn cao Do cần phải nghiên cứu để gia tăng suất, sản lượng giảm giá thành sản phẩm, nhằm đáp ứng nhu cầu ngày tăng chế phẩm enzyme cho kinh tế phát triển nước ta Có nhiều chủng vi khuẩn nấm mốc sản sinh protease, loài sản xuất quan trọng Bacillus, Streptomyces, Aspergillus niger, Asp sojae Asp oryzae Nấm mốc Aspergillus không sử dụng từ lâu chế biến sản phẩm truyền 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT Tuy nhiên, cần đếm số tế bào ô vuông lớn đại diện cho 25 ô vuông lớn ô trung tâm Khi đó, số lượng tế bào ml mẫu nghiên cứu tính cơng thức sau N=[ (a/b) x (400/0,1) ] x 103x10 n Trong đó: N: số lượng tế bào ml nghiên cứu a: số tế bào ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ) b: số ô vuông nhỏ ô vuông lớn (16 x = 80 ô vuông nhỏ) 400: tổng số ô vuông nhỏ ô trung tâm 0,1: thể tích dịch tế bào chứa trung tâm 103: số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = ml ) n 10 : độ pha loãng mẫu Xác định hoạt tính chế phẩm protease từ nấm mốc phương pháp Anson cải tiến a Nguyên tắc Cơ chất sử dụng phương pháp casein hemoglobin Phương pháp dựa sở xác định lượng sản phẩm tạo thành phản ứng tạo màu protein thuốc thử Folin-ciocalteu Căn vào đường chuẩn đồ thị biểu diễn phụ thuộc độ hấp thu theo hàm lượng tyrosin để tính lượng tyrosin sinh sản phẩm thủy phân tác dụng protease Hoạt độ chế phẩm enzyme biểu diễn đơn vị hoạt tính chế phẩm Một đơn vị hoạt tính lượng enzyme có khả thủy phân protein phút 45°C để tạo lượng sản phẩm tương đương với µmol tyrosin Hoạt độ riêng chế phẩm biểu diễn số đơn vị hoạt tính chế phẩm gam chất khô (U/gck) nuôi cấy bề mặt, đơn vị hoạt tính chế phẩm hàm lượng protein (U/mg protein) ni cấy chìm b Hoá chất -Dung dịch đệm Phosphat pH=7,5 gồm: NaH2PO4 (Na)2HPO4 -Dung dịch casein 1% pha dung dịch đệm đun 43 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT -Dung dịch chứa enzyme protease -TCA (CCl3COOH) 10% -Na2CO3 5% pha NaOH 0,1N -Thuốc thử Folin 1N c Cách tiến hành Dựng đường chuẩn Tyrosin Ống nghiệm [Tyr] (µmol/ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 VTyr (µl) 300 600 900 1200 1500 VHCl 0,1N (µl) 1500 1200 900 600 300 Lắc để yên 30 phút, đem đo mật độ quang λ=750 nm Dựng đường chuẩn tyrosin biểu diễn tương quan hàm lượng tyrosin OD Bảng 7: Kết đo OD dựng đường chuẩn Tyrosin [Tyr] µmol/ml 0,2 0,4 0,6 0,8 OD trung bình 0,2905 0,648 0,8885 1,0825 1,426 OD Lần 0,2895 0,6515 0,9165 1,0855 1,4315 OD Lần 0,2915 0,6445 0,8605 1,0795 1,4205 44 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT Giá trị OD buớc sóng 750nm Phương trình đường chuẩn Tyrosin y = 1.3924x + 0.0264 R = 0.9933 1.6 1.426 1.4 1.2 1.0825 0.8885 0.8 0.648 0.6 0.4 0.2905 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 [Tyrosin] Hình 7: Biểu đồ đường chuẩn Tyrosin Định lượng Tyrosin: lấy ống nghiệm sạch, khô Ống 1(ống kiểm tra): 0,4 ml dung dịch đệm Phosphat pH=7,5, bổ sung 0,2 ml dịch enzyme ủ nhiệt độ tối ưu (45°C), sau cho 0,6 ml dung dịch TCA 10%, lắc để bất hoạt enzyme Thêm 0,2 ml casein 1% lắc máy ủ lắc eppendorf 10 phút nhiệt độ Sau đem ly tâm 13000 vịng/phút 10 phút, xác định hàm lượng sản phẩm tạo thành sau trình phân giải protease phản ứng màu Phản ứng màu: lấy 0,2 ml dịch ly tâm, thêm 1ml NaCO3 5% pha NaOH 0,1N, lắc đều, thêm 0,1 ml thuốc thử Folin 1N, lắc Đặt nhiệt độ phịng 30 phút, sau đem so màu bước sóng 750 nm Ống (ống thí nghiệm): 0,4 ml dung dịch đệm Phosphat pH=7,5, cho thêm vào 0,2 ml dung dịch enzym ổn định 45°C Thêm 0,2 ml casein 1% lắc 10 phút nhiệt độ Sau cho vào 0,6 ml TCA 10%, lắc tiếp tục làm ống 45 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT (Ống thử thật) (Ống đối chứng) 0,05mM Phosphat, pH=7,5 0,05mM Phosphat, pH=7,5 (0,4ml) (0,4ml) Dịch trích enzym Dịch trích enzym (0,2ml) (0,2ml) Ủ 45°C, 10 phút Thêm casein1% Thêm TCA 10% ( 0,2ml) ( 0,6ml) Lắc ủ 45°C , 10 phút Thêm TCA 10% Thêm casein 1% (0,6ml) (0,2ml) Ly tâm 13000 vòng,10 phút Thu dịch lọc (0,2ml) Thêm Na2CO3 2%, pha NaOH 0,1 N (1ml) Lắc Thuốc thử Folin (0,1ml) Lắc đều, để yên 30 phút Đo OD 750 nm d Tính kết quả: 46 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT Hoạt tính ml dung dịch enzyme tính theo cơng thức sau: U / ml  a.b.7 t Trong đó: U/ml: số đơn vị hoạt tính ml dung dịch enzyme a: số µmol tyrosin tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quang học ống nghiệm ống kiểm tra b: Độ pha lỗng dung dịch enzyme có t: thời gian phản ứng (10 phút) 7: tỉ lệ thể tích hỗn hợp phản ứng với dung dịch enzyme sau thêm acid trichloroacetic (TCA) tính theo cơng thức sau: 0,4 ml dung dịch đệm +0,2 ml enzyme +0,2 ml casein + 0,6 ml TCA = 0,2 ml enzyme Cách tính U/gck: U/gck = (U/ml* Vpha lỗng)/Mchất khơ U/ml: đơn vị hoạt tính tính theo cơng thức V: thể tích đệm dung pha lỗng mẫu tỉ lệ 1:6 (18ml) M: số gam chất khô mẫu đem ly trích enzyme Phương pháp xác định ẩm độ nguyên liệu 47 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT x: lượng nước thêm vào 10 gam chất xa h 10  x h: ẩm độ mong muốn a: khối lượng nước có ngun liệu Từ cơng thức tính ẩm độ ta tìm lượng nước cần thêm vào để đạt ẩm độ môi trường mong muốn Đồng thời, ta biết % vật chất khô hay %ẩm độ nguyên liệu ban đầu %vật chất khô + %nước nguyên liệu = 100% Cơng thức tính ẩm độ ngun liệu: Y = (m1 – m2)/m1*100 Y: ẩm độ nguyên liệu (%) m1: khối lượng mẫu trước sấy m2: khối lượng mẫu sau sấy 1050C, ngày 48 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT PHẦN 2: BẢNG GIÁ TRỊ OD VÀ VẬT CHẤT KHƠ Ở CÁC THÍ NGHIỆM Ẩm độ môi trường trước sau khử trùng Bảng 8: So sánh ẩm độ dự kiến ẩm độ thực tế Cơ chất Cám mì Ẩm độ dự kiến (%) Ẩm độ thực tế (%) 40 39,6 45 44,44 50 49,23 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả sinh protease dòng nấm mốc Ghi chú: Mẫu đo OD pha lỗng lần ni cấy bề mặt Cách tính U/gck: U/ml * V nước mẫu /vật chất khơ mẫu Trong đó: gam mẫu nuôi cấy bề mặt + 18 ml nước cất theo tỉ lệ (1:6) Sau tiến hành trích enzyme Bảng 9: Bảng giá trị OD %vck thí nghiệm Chủng Asp, A1 A2 A3 A4 A5 Lập lại OD % vật chất khô 0,262 47,497 0,253 47,100 0,251 43,280 0,283 49,143 0,330 47,767 0,301 47,200 0,470 50,660 0,496 47,260 0,453 48,587 0,436 48,893 0,428 49,737 0,444 49,550 0,437 49,057 0,425 47,277 0,397 46,677 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng ẩm độ đến khả sinh protease Bảng 10: Bảng giá trị OD %vck thí nghiệm ảnh hưởng ẩm độ 49 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Ẩm độ Trường ĐHCT Lập lại OD % vật chất khô 0,404 50,863 0,433 48,760 0,417 52,947 0,451 40,077 0,506 46,613 0,421 38,163 0,373 43,557 0,404 45,077 0,360 42,747 40% 45% 50% Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng thời gian mật số đến khả sinh protease Bảng 11: Bảng giá trị OD %vck thí nghiệm ảnh hưởng thời gian mật số Giá trị OD Mật số (bt/gck) Lập lại 48 72 96 0,204 0,354 0,444 0,201 0,376 0,462 0,180 0,342 0,388 0,202 0,470 0,477 0,198 0,475 0,509 0,269 0,521 0,490 0,306 0,417 0,461 0,289 0,439 0,418 0,268 0,479 0,438 10 10 107 vật chất khô (%) Mật số 105 10 107 Lập lại 48 72 96 52,477 52,637 45,367 48,890 56,237 49,743 50,550 48,097 49,053 47,980 48,450 43,163 47,207 52,487 44,487 48,880 53,133 42,860 44,517 51,150 53,553 50 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT 46,663 45,483 44,240 45,930 47,267 45,400 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng đạm protein bổ sung đến hoạt tính protease Bảng 12: Bảng giá trị OD %vck thí nghiệm bổ sung đạm protein Đạm bổ sung (1%) Đối chứng Casein Bột đậu tương Yeast extract Pepton Lập lại OD % vật chất khô 0,439 47,173 0,4205 48,307 0,4295 49,537 0,4285 44,723 0,4935 48,367 0,497 49,910 0,484 43,273 0,5 46,580 0,532 46,813 0,4605 45,397 0,49 49,383 0,482 50,520 0,4465 45,733 0,455 46,670 0,447 43,480 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng đạm phi protein bổ sung đến hoạt tính protease Bảng 13: Bảng giá trị OD %vck thí nghiệm bổ sung đạm phi protein 51 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Đạm bổ sung (1%) Trường ĐHCT Lập lại OD % vật chất khô 0,439 47,173 0,4205 48,307 0,4295 49,537 0,4285 44,723 0,4935 48,367 0,497 49,910 0,484 43,273 0,5 46,580 0,532 46,813 0,4605 45,397 0,49 49,383 0,482 50,520 0,4465 45,733 0,455 46,670 0,447 43,480 Đối chứng Diammoniun sunfat Triammonium citrat Ammonium nitrat Diammonium phosphat (DAP) PHẦN 3: PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Thí nghiệm 1: Khảo sát khả sinh protease dòng nấm mốc Bảng 14: Phân tích ANOVA hoạt tính protease dòng Aspergillus Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 61,2931 15,3233 52,86 0,0000 Within groups 2,89901 10 0,289901 Total (Corr.) 64,1921 14 CV(%) = 5,296 % Bảng 15: Phân tích LSD so sánh khác biệt nghiệm thức Method: 95,0 percent LSD Dòng Asp Count Mean A1 6,27133 A2 7,29133 Homogeneous Groups X X 52 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT A5 10,3653 X A4 10,4323 X A3 11,5103 Contrast Sig Difference A1 - A2 * -1,02 0,97954 A1 - A3 * -5,239 0,97954 A1 - A4 * -4,161 0,97954 A1 - A5 * -4,094 0,97954 A2 - A3 * -4,219 0,97954 A2 - A4 * -3,141 0,97954 A2 - A5 * -3,074 0,97954 A3 - A4 * 1,078 0,97954 A3 - A5 * 1,145 0,97954 0,067 0,97954 A4 - A5 X +/- Limits * Khác biệt có ý nghĩa Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng ẩm độ đến khả sinh protease Bảng 16: Phân tích ANOVA hoạt tính protease ẩm độ khác Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 29,4478 14,7239 48,41 0,0002 Within groups 1,82507 0,304179 Total (Corr.) 31,2728 CV(%)= 4,047 Bảng 17: Phân tích LSD so sánh khác biệt nghiệm thức Method: 95,0 percent LSD Ẩm độ Count Mean 40% 11,6387 Homogeneous Groups X 53 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT 50% 12,147 45% 15,7047 Contrast Sig Difference 40% - 45% * -4,066 1,10189 -0,508333 1,10189 3,55767 1,10189 40% - 50% 45% - 50% * X X +/- Limits * Khác biệt có ý nghĩa Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng thời gian mật số đến khả sinh protease Bảng 18: Phân tích ANOVA hoạt tính protease theo thời gian mật số bào tử chủng Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:Thoi gian (ngay) 265,123 132,562 156,98 0,0000 B:Mat so (bao tu/gck) 44,1229 22,0615 26,13 0,0000 AB 27,2343 6,80857 8,06 0,0007 RESIDUAL 15,1999 18 0,844439 TOTAL (CORRECTED) 351,68 26 MAIN EFFECTS INTERACTIONS CV(%)= 8,42 Bảng 19: Phân tích LSD so sánh khác biệt nghiệm thức Method: 95,0 percent LSD Thoi gian (ngay) Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 6,61511 0,306311 X 12,1222 0,306311 13,9991 0,306311 X X 54 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT Contrast Sig Difference +/- Limits 2-3 * -5,50711 0,910099 2-4 * -7,384 0,910099 3-4 * -1,87689 0,910099 * Khác biệt có ý nghĩa Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng đạm protein bổ sung đến hoạt tính protease Bảng 20: Phân tích ANOVA hoạt tính protease với loại đạm protein bổ sung Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 16,1071 4,02676 17,89 0,0001 Within groups 2,25035 10 0,225035 Total (Corr.) 18,3574 14 CV(%)= 3,361 Bảng 21: Phân tích LSD so sánh khác biệt nghiệm thức Method: 95,0 percent LSD Đạm bổ sung Count Mean Doi chung 12,6053 Yeast extract 14,077 X Pepton 14,1153 X Casein 14,132 X Dau tuong 15,8753 X Contrast Sig Difference +/- Limits Casein - Dau tuong * -1,74333 0,863023 Casein - Doi chung * 1,52667 0,863023 0,0166667 0,863023 Casein - Pepton Homogeneous Groups X 55 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT Casein - Yeast extract 0,055 0,863023 Dau tuong - Doi chung * 3,27 0,863023 Dau tuong - Pepton * 1,76 0,863023 Dau tuong - Yeast extract * 1,79833 0,863023 Doi chung - Pepton * -1,51 0,863023 Doi chung – Yeast extract * -1,47167 0,863023 0,0383333 0,863023 Pepton - Yeast extract * Khác biệt có ý nghĩa Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng đạm phi protein bổ sung đến hoạt tính protease Bảng 22: Phân tích ANOVA hoạt tính protease với loại đạm phi protein bổ sung Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 163,616 40,9039 89,97 0,0000 Within groups 4,5463 10 0,45463 Total (Corr.) 168,162 14 CV(%)= 5,524 Bảng 23: Phân tích LSD so sánh khác biệt nghiệm thức Method: 95,0 percent LSD Dam phi protein Count Mean Homogeneous Groups Doi chung 7,17267 (NH4)2SO4 11,2247 NH4NO3 13,689 X C6H17N3O7 14,2663 X (NH4)2HPO4 16,9877 X X X 56 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 -2010 Trường ĐHCT Contrast Sig Difference (NH4)2HPO4 - (NH4)2SO4 * 5,763 1,22667 (NH4)2HPO4 – C6H17N3O7 * 2,72133 1,22667 (NH4)2HPO4 - Doi chung * 9,815 1,22667 (NH4)2HPO4 - NH4NO3 * 3,29867 1,22667 (NH4)2SO4- C6H17N3O7 * -3,04167 1,22667 NH4)2SO4- Doi chung * 4,052 1,22667 (NH4)2SO4- NH4NO3 * -2,46433 1,22667 C6H17N3O7 - Doi chung * 7,09367 1,22667 0,577333 1,22667 -6,51633 1,22667 C6H17N3O7 - NH4NO3 Doi chung - NH4NO3 * +/- Limits * Khác biệt có ý nghĩa 57 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ... nghiệm 1: Khảo sát khả sinh protease dòng nấm mốc Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng ẩm độ đến khả sinh protease Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng thời gian mật số đến khả sinh protease Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng đạm... nghiệm 1: Khảo sát khả sinh enzyme protease dòng Aspergillus .20 II Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng ẩm độ đến khả sinh protease nấm mốc .21 III Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng. .. mốc phương pháp Anson cải tiến (xem phụ lục) III Thí nghiệm III.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả sinh protease dịng nấm mốc III.1.1 Mục đích: Khảo sát khả sinh protease dòng nấm mốc để lựa chọn dòng