Bài viết tìm hiểu sự lưu hành cũng như các đặc điểm dịch tễ học phân tử của MRV tại Việt Nam thông qua đánh giá tỷ lệ lưu hành MRV trên nhóm chó khỏe và chó bệnh tiêu chảy; phân lập và xác định genotype các chủng MRV phân lập được trên chó nuôi.
KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA MAMMALIAN ORTHOREOVIRUS (MRV) TRÊN CHÓ NUÔI TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Nguyễn Văn Dũng1, Lê Việt Bảo1, Ken Maeda2 TÓM TẮT Mammalian orthoreovirus (MRV) gây bệnh người nhiều lồi động vật, đó, chó lồi vật nuôi thường tiếp xúc với người nên nguy lây bệnh từ loài vật cao Bệnh MRV chó báo cáo nhiều nước, nhiên Việt Nam thiếu thông tin MRV Mục tiêu nghiên cứu đánh giá lưu hành phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử MRV Qua kiểm tra 80 mẫu swab phân chó (30 chó tiêu chảy, 50 chó khỏe) RT-PCR, cho thấy tỷ lệ lưu hành MRV nhóm chó bệnh (50%) cao nhóm chó khỏe (2%), chứng tỏ MRV tác nhân gây tiêu chảy chó Tổng cộng có chủng MRV phân lập thành công môi trường tế bào A72/cSLAM Kết định genotype cho thấy chủng thuộc genotype chủng thuộc genotype Các chủng genotype phân lập có độ tương đồng cao so với chủng MRV phân lập heo từ Trung Quốc Chủng MRV-2 có độ tương đồng cao với chủng gây bệnh phân lập người từ Trung Quốc Điều cho thấy có truyền lây MRV loài động vật khác nhau, lây lan động vật người Các chủng MRV phân lập ứng viên tiềm cho việc nghiên cứu sản xuất vacxin chế phẩm sinh học khác Từ khóa: Chó, Mammalian orthoreovirus, genotype, Tp Hồ Chí Minh Molecular epidemiology of Mammalian orthoreovirus from domestic dogs in Ho Chi Minh City, Viet Nam Nguyen Van Dung, Le Viet Bao, Ken Maeda SUMMARY Mammalian orthoreovirus (MRV) is a pathogen which can cause diseases in human and many species of animals Dogs are companion animals which often expose to human, so infection risks from this species is very high The prevalence of MRV in dogs has been reported in many countries However, there is currently lack of MRV information in dogs in Viet Nam The objective of this study was to investigate and characterize MRV circulating in Viet Nam A total of 80 fecal swab samples from dogs (30 samples from diarrheic dogs, 50 samples from healthy dogs) were detected for MRV by RT-PCR The studied result showed that prevalence of MRV in the diarrheic dogs was higher than prevalence of MRV in the healthy dogs A total of four MRV strains were successfully isolated on cell A72/cSLAM Phylogenic analysis showed that one Vietnamese MRV strain belonged to genotype (MRV-1) and three Vietnamese MRV strains belonged to genotype (MRV-3) Vietnamese isolates - MRVs-3 were high identity in comparison to the Chinese MRV isolated from pigs The Vietnamese isolates - MRV-2 was high identity in comparison to the Chinese isolates - MRV, which caused disease in human These results indicated that there was transmission of MRV among different animals, also spread between animals and human The Vietnamese isolates – MRV can be potential candidates for development of vaccine or probiotics in Viet Nam Keywords: Dogs, Mammalian orthoreovirus, genotype, Ho Chi Minh City Chi cục Chăn nuôi Thú y Thành phố Hồ Chí Minh Phịng thí nghiệm Vi sinh vật Thú y, Đại học Yamaguchi, Nhật Bản 32 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 I ĐẶT VẤN ĐỀ 2.2 Nguyên liệu Trong năm gần đây, nhiều loại virus gây bệnh chung người động vật có xu hướng ngày gia tăng, đặc biệt mầm bệnh từ vật nuôi thường xuyên tiếp xúc với người chó, mèo; đó, Mammalian orthoreovirus (MRV) ghi nhận nguyên gây bệnh viêm dày-ruột gây viêm não người (Steyer ctv., 2013), chó ghi nhận gây triệu chứng chảy nước bọt, ói, tiêu chảy gây hội chứng hệ thống hô hấp (Lou ctv., 1963) Mẫu xét nghiệm: Tổng cộng 80 mẫu swab trực tràng (30 chó có triệu chứng viêm ruột, tiêu chảy 50 mẫu chó khỏe mạnh, khơng có biểu lâm sàng bệnh) thu thập khu vực Thành phố Hồ Chí Minh Các mẫu bệnh phẩm bảo quản dung dịch PBS nhiệt độ -800C thực phân tích xét nghiệm MRV có cấu trúc di truyền RNA sợi đơi, thuộc giống Orthoreovirus họ Reoviridae MRV có cấu trúc gồm 10 đoạn gen đặt tên theo kích thước gen gen “lớn” (Large) L1, L2, L3; gen “vừa” (Medium), M1, M2 M3; gen “nhỏ” (Small), S1, S2, S3 S4 Trong đó, gen S1 mã hóa protein σ1, protein nằm vỏ virus có vai trị quan trọng việc công vào thụ thể bề mặt tế bào Vì protein σ1 yếu tố xác định serotype virus (Decaro ctv., 2005) MRV phân chia thành serotype bao gồm serotype (Lang), serotype (D5/Jones), serotype (Dearing) serotype (Ndelle) phản ứng trung hòa virus ức chế ngưng kết hồng cầu (Sabin ctv., 1959) Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử, phân tích trình tự nucleotide S1 xác định genotype virus có tương đồng với serotype virus Bệnh MRV gây chó báo cáo số nước Ý, Mỹ (Lou ctv., 1963; Decaro ctv., 2005) Tuy nhiên, thiếu thông tin bệnh MRV chó Việt Nam, đặc biệt Thành phố Hồ Chí Minh Vì mục tiêu nghiên cứu tìm hiểu lưu hành đặc điểm dịch tễ học phân tử MRV Việt Nam II NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu - Đánh giá tỷ lệ lưu hành MRV nhóm chó khỏe chó bệnh tiêu chảy - Phân lập xác định genotype chủng MRV phân lập chó ni Bộ kít ly trích RNA kít sử dụng phản ứng RT-PCR: sử dụng kít thương mại Viral RNA mini kit One step RT-PCR kit (Qiagen, Đức) Tinh sản phẩm PCR dùng cho giải trình tự nucleotide sử dụng QIAquick PCR Purification (Qiagen) Tế bào nuôi cấy virus: tế bào A72cSLAM nuôi cấy môi trường DMEM với10% FCS Thiết bị: máy luân nhiệt Real-time RT-PCR, điện di, kính hiển vi đảo ngược, tủ ấm, máy ly tâm lạnh, máy giải trình tự nucleotide tự động ABI-PRISM 310 (Applied Biosystem, USA) dụng cụ thường quy khác phịng thí nghiệm 2.3 Phương pháp nghiên cứu RT-PCR phát RNA virus: Để phát lưu hành MRV đàn chó, RT-PCR thực với cặp mồi L1-RV5, 5’- GCA TCC ATT GTA AAT GAC GAG TCT G-3’ L1-RV6, 5’CTT GAG ATT AGC TCT AGC ATC TTC TG-3 (Leary ctv., 2002), khuếch đại vùng gen L1 với sản phẩm PCR có kích cỡ 416bp Bộ kit Viral RNA mini kit (Qiagen) sử dụng cho việc ly trích RNA virus từ mẫu bệnh phẩm, kít One step RT- PCR (Qiagen) sử dụng cho việc khuếch đại gen L1, phản ứng thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm PCR có kích cỡ 416bp phát kỹ thuật điện di gel agarose 2% Sản phẩm PCR mẫu dương tính đựợc tinh kit QIAquick PCR Purification (Qiagen) dùng cho việc giải trình tự Phân lập virus: mẫu dịch swab lọc qua lọc 0,22nm gây nhiễm tế bào A72cSLAM/ DMEM 10% FCS, ủ nhiệt độ 370C, theo dõi quan sát bệnh tích tế bào hàng ngày, ngày cấy chuyển tế bào lần, qua lần cấy chuyển không quan sát thấy bệnh 33 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXVI SỐ - 2019 tích tế bào nào, mẫu xem âm tính Đối với mẫu xuất bệnh tích tế bào, sử dụng RT-PCR để xác định diện virus phân lập 1000 lần lặp lại Trắc nghiệm Chi bình phương dùng phân tích so sánh tỷ lệ, giá trị P