Đang tải... (xem toàn văn)
Nhằm nâng cao hiệu suất thu nhận cũng như hoạt tính của enzyme BuChE tái tổ hợp, nghiên cứu này tiến hành tối ưu hóa các điều kiện tinh sạch, gồm có tối ưu hóa dịch tế bào chứa enzyme thô, lựa chọn màng lọc, lựa chọn các loại gel tinh sạch.
Hóa học – Sinh học – Mơi trường NGHIÊN CỨU HỒN THIỆN CƠNG NGHỆ TINH SẠCH ENZYME BUTYRYLCHOLINESTERASE (EC 3.1.1.8) TÁI TỔ HỢP Nghiêm Ngọc Hoa1, Nguyễn Hà Trung1, Nguyễn Duy Hưng2, Nguyễn Vũ Minh Hạnh3, Phạm Kiên Cường1* Tóm tắt: Butyrylcholinesterase (BuChE) esterase serine Tác dụng BuChE xúc tác trình thủy phân este cholin tạo thành cholin axit cacboxylic Enzyme bị ức chế mạnh hợp chất phospho tác nhân thần kinh Trong nghiên cứu trước đó, chúng tơi biểu thành cơng protein BuChE tái tổ hợp vi khuẩn E coli BL21 DE3 điều kiện cảm ứng với IPTG 0,25 mM, sau thời gian 37oC BuChE tái tổ hợp có kích thước khoảng 70 kDa có hoạt độ 3,58 U/mg protein Nhằm nâng cao hiệu suất thu nhận hoạt tính enzyme BuChE tái tổ hợp, chúng tơi tiến hành tối ưu hóa điều kiện tinh sạch, gồm có tối ưu hóa dịch tế bào chứa enzyme thô, lựa chọn màng lọc, lựa chọn loại gel tinh Dịch enyzme thô chiết đệm phosphate 20 mM, pH 8, lọc qua màng lọc có kích thước 100 kDa Dịch màng tinh phương pháp sắc ký khác nhau: sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực Kết kiểm tra độ tinh protein BuChE cho thấy, việc s dụng cột trao đổi ion để tinh protein BuChE cho hiệu suất cao Các phân đoạn có hoạt tính qua màng 100 kDa, enyzme sau tinh có hoạt tính riêng 120 U/mg pr Từ khóa: Enzyme; Butyrylcholinesterase; Tinh MỞ ĐẦU Nhằm thu nhận lượng lớn enzyme butyrylcholinesterase dùng cho mục đích phân tích trị liệu nghiên cứu nhiều thông tin cấu trúc chức enzyme, nhà khoa học tập trung nghiên cứu biểu enzyme dạng tái tổ hợp [4, 6, 7] Năm 2012, Brazzolotto cộng tiến hành biểu gen mã hóa cho butyrylcholinesterase người Drosophila melanogaster Protein tạo có khả glycosyl hóa cao với suất cao lần so với biểu tế bào CHO (tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc) Nhóm tác giả đưa phương pháp tinh protein dựa sắc ký lực huprine nhằm thu protein tinh khiết với hiệu suất cao Năm 2015, Tian cộng biểu thành công butyrylcholinesterase người (hBuChE) sau tối ưu hóa codon nấm men Pichia pastoris dịng GS115 hBuChE tái tổ hợp thu có nồng độ protein tổng số đạt 292 mg/ml với hoạt độ 14,7 U/ml; sau tinh thu enzyme có hoạt độ riêng 8,1 U/mg với hiệu suất 68% [7] Trong nghiên cứu trước đó, chúng tơi biểu thành cơng protein BuChE tái tổ hợp vi khuẩn E coli BL21 DE3 điều kiện cảm ứng với IPTG 0,25mM, sau thời gian 37oC BuChE tái tổ hợp có kích thước khoảng 70 kDa có hoạt độ 3,58 U/mg protein Nhằm nâng cao hiệu suất thu nhận hoạt tính enzyme BuChE tái tổ hợp, nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành tối ưu hóa điều kiện tinh sạch, gồm có tối ưu hóa dịch tế bào chứa enzyme thô, lựa chọn màng lọc, lựa chọn loại gel tinh VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu hóa chất Chủng vi khuẩn BL21- CodonPlus (DE3)- RIL mang vector pET43a-BuChE; IPTG, Butyrylthiocholine Iodide từ hãng Sigma-Aldrich; thang chuẩn protein nhuộm sẵn dùng 414 N N Hoa, …, P K Cường, “Nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ … (EC 3.1.1.8) tái tổ hợp.” Nghiên cứu khoa học công nghệ cho SDS-PAGE mua từ hãng Enzynomics; thang chuẩn protein nhuộm sẵn dùng cho thẩm tách miễn dịch, NBT, BCIP màng SnakeSkin hãng Thermo Fisher Scientific, màng PVDF, kháng thể đơn dòng kháng BuChE chuột hãng Millipore; kháng thể thứ cấp kháng IgG chuột hãng Promega; gel Ni-sepharose hãng Qiagen; gel DEAEsepharose, gel sephadex G75, G100 hãng GE; màng lọc tiếp tuyến kích thước 50 kDa, 100 kDa; 0,2 µm số hóa chất cần thiết khác dùng nghiên cứu mua từ hãng hóa chất uy tín giới 2.2 Thiết bị Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn, máy lắc ổn nhiệt, máy phá tế bào, thiết bị điện di đứng, máy điện chuyển ướt, máy ly tâm Sigma 3K, máy ly tâm 5417 R, máy khuấy từ, máy đo quang phổ kế, máy Nanodrop Hệ thống lọc tiếp tuyến hệ thống máy sắc ký tự động AKATA Prime Plus GE 2.3 Phương pháp, kĩ thuật nghiên cứu 2.3.1 Xác định hàm lượng protein Hàm lượng protein xác định theo phương pháp đo mật độ quang bước sóng λ=280 nm theo phương pháp Lowry cộng [5] với tinh thể albumin huyết bò làm đường chuẩn 2.3.2 Xác định hoạt độ Enzyme butyrylcholinesterase Hoạt tính enzyme butyrylcholinesterase xác định theo phương pháp Ellman cộng (1961) [3] 2.3.3 Thu dịch chiết tế bào kiểm tra biểu enzyme butyrylcholinesterase E coli Một khuẩn lạc dương tính chứa vector tái tổ hợp pET43a-BuChE đĩa LB đặc cho vào 50ml mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin (Amp) 50 µg/ml chloramphenicol (Cm) 34 µg/ml, ni lắc qua đêm với tốc độ 200 vịng/phút 37 oC 10ml dịch ni trẻ hóa 50 lần 500ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp 50 µg/ml Cm 34 µg/ml Vi khuẩn ni OD600 đạt 0,6 ÷ 0,8; bổ sung 125µl IPTG 1M đem ni 37oC, 200 vòng/phút, Sinh khối tế bào thu sau nuôi cấy cách li tâm 9000 vòng/phút, 10 phút 4oC Tủa hòa đệm Phosphate 20mM, pH 8, thu dịch sau hòa tủa Bảo quản dịch sau hòa tủa -20oC Dịch sau hòa tủa đem phá vỡ tế bào siêu âm lần đá, lần 30 giây Dịch sau phá tế bào đem li tâm 13000 vòng/phút, 20 phút 4oC, thu dịch Khi đó, dịch chứa enzyme bảo quản -20oC cho bước Sự có mặt enzyme butyrylcholinesterase đánh giá phương pháp điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) khẳng định thẩm tách miễn dịch, sử dụng kháng thể sơ cấp kháng thể kháng enzyme butyrylcholinesterase gây chuột kháng thể thứ cấp kháng thể kháng IgG chuột có gắn phosphatase kiềm với chất p-nitro blue tetrazolium chloride 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP) 2.3.4 Phương pháp lọc tiếp tuyến Dịch chiết tế bào chứa enzyme BuChE thô lọc qua màng lọc có kích thước 0,2 µm, 100 kDa 50 kDa máy lọc tiếp tuyến AKTA flux, thu dịch 2.3.5 Phương pháp tinh protein sắc ký lọc gel Tiến hành tinh dịch chiết tế bào chứa enzyme thô loại gel: sephadex G75, sephadex G100 Cột gel có đường kính 1cm chiều dài 80 cm, cân với đệm phosphate 20mM, pH Mẫu cho lên cột với tổng thể tích ml Sau đó, rửa chiết đệm phosphate 20mM, pH 8, thu phân đoạn, phân đoạn ml Các phân đoạn phân tích nồng độ protein kiểm tra hoạt độ enzyme butyrylcholinesterase Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Hội thảo Quốc gia FEE, 10 - 2020 415 Hóa học – Sinh học – Môi trường 2.3.6 Phương pháp tinh protein sắc ký lực Tiến hành tinh dịch chiết tế bào chứa enzyme thô gel Ni-sepharose Gel Nisepharose nhồi vào cột XK 16/20 để tích cột gel 5ml 15 ml NiSO4 50 mM cho chảy qua với tốc độ 15-20 ml/giờ để đảm bảo bão hòa ion Ni2+ cho gel Cột gel cân với đệm phosphate 20 mM; pH 8; NaCl 100 mM; PMSF mM (đệm A) có bổ sung imidazol mM cách cho 15 ml đệm A chảy qua với tốc độ 20-30 ml/giờ Mẫu cho lên cột với tổng thể tích ml Sau đó, rửa chiết đệm A có bổ sung imidazol 5mM, 80mM, 100mM nhằm loại bỏ protein gắn không đặc hiệu với cột gel Protein gắn cột rửa chiết đệm A có bổ sung imidazol 250mM Các phân đoạn phân tích nồng độ protein kiểm tra hoạt độ enzyme butyrylcholinesterase 2.3.7 Phương pháp tinh protein sắc ký trao đổi ion Gel trao đổi anion DEAE- sepharose fast flow ngâm trương hoàn toàn đệm phosphate 20 mM, pH 8; sau nhồi vào cột XK 26/70 Cột gel cân đệm cách cho khoảng 100 ml đệm chảy qua cột Dịch chiết tế bào cho lên cột với tổng thể tích ml Sau cho dịch chiết chạy qua, cột rửa đệm phosphate 20 mM, pH 8; cho đẩy gradient NaCl từ 20-1000 mM pha 500 ml đệm với tốc độ 20 ml/giờ; tiến hành thu phân đoạn, phân đoạn 2ml Các phần dịch không hấp thụ phân đoạn thu từ bước đẩy gradient NaCl phân tích protein kiểm tra hoạt tính enzyme butyrylcholinesterase KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết kiểm tra biểu hoạt tính enzyme thô tái tổ hợp Dịch chiết tế bào kiểm tra hoạt tính theo phương pháp Ellman cộng [3] Theo đó, dịch chiết tế bào chứa enzyme có hoạt độ riêng 3,58 U/mg Kết biểu gen BuChE kiểm tra SDS-PAGE thẩm tách miễn dịch (hình 1) cho thấy, dịch chiết tế bào BL21-RIL mang vector pET43a-BuChE có chứa băng protein 70kDa (đường chạy 4,5,6 hình 1A) Trong đó, mẫu đối chứng âm (tế bào BL21-RIL (1,2,3) không mang vector pET43a-BuChE) khơng có băng protein Kết thẩm tách miễn dịch, sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng BuChE cho thấy có mặt băng protein 70 kDa mẫu tương ứng với mẫu SDS-PAGE (đường chạy 4,5,6 hình 1B) Từ đó, chúng tơi kết luận biểu BuChE E coli Hình SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu BuChE E Coli M: Thang chuẩn protein; 1: Dịch đồng tủa tế bào BL21-RIL; 2: Dịch chiết protein tổng số tế bào BL21-RIL; 3: Dịch hòa phân đoạn tủa tế bào BL21-RIL; 4: Dịch đồng tủa tế bào BL21-RI mang pET43a-BuChE; 5: Dịch chiết protein tổng số tế bào BL21-RIL mang pET43a-BuChE; 6: Dịch hòa phân đoạn tủa tế bào BL21-RIL mang pET43a-BuChE 416 N N Hoa, …, P K Cường, “Nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ … (EC 3.1.1.8) tái tổ hợp.” Nghiên cứu khoa học công nghệ Kết xác định hoạt tính protein BuChE tái tổ hợp thu dịch chiết protein tổng số có hoạt độ riêng 3,58 U/mg 3.2 Kết lọc tiếp tuyến Dịch sau màng 0,2 µm lọc qua hai màng lọc với kích thước 50 kDa 100 kDa Dịch màng 50 kDa dịch cô màng 100 kDa kiểm tra hoạt tính [3] Kết thể bảng 1: Bảng Hoạt tính dịch lọc qua loại màng STT Màng 0,2 µm Màng 50 kDa Màng 100 kDa 4,38 7,64 8,32 4,2 7,5 8,01 4,6 7,8 8,27 TB 4,39 7,65 8,20 Kết bảng cho thấy, hoạt tính enyzme BuChE tăng sau bước sử dụng màng lọc Hoạt tính enzyme dịch chiết tế bào trước lọc qua màng 0,2 µm 3,58 U/mg Sau lọc qua màng 0,2 µm; hoạt tính tăng lên 1,23 lần (đạt 4,39 U/mg) Dịch lọc qua màng 0,2 µm sau qua màng 50 kDa đạt hoạt tính 7,65 U/mg (tăng 1,74 lần) Dịch lọc qua màng 0,2 µm sau qua màng 100 kDa đạt hoạt tính 8,2 U/mg (tăng 1,87 lần) Kết rằng, việc sử dụng màng 100 kDa sau bước lọc qua màng 0,2 µm cho hiệu tinh cao so với việc sử dụng màng 50 kDa Do đó, chúng tơi sử dụng màng lọc 100 kDa để cô dịch tế bào chứa enzyme BuChE 3.3 Kết tinh protein phương pháp sắc ký Dịch lọc qua màng nghiên cứu tinh phương pháp sắc ký: Sắc ký lọc gel (sephadex G75 sephadex G100), Sắc ký lực Sắc ký trao đổi ion Kết tinh sử dụng gel sephadex G75 trình bày hình sử dụng gel sephadex G100 trình bày hình Hình Sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G75 tinh BuChE tái tổ hợp Qua đây, sắc ký đồ cho thấy có đỉnh protein trải rộng từ phân đoạn đến phân đoạn 18 Hoạt độ BuChE xuất giải phân đoạn đến phân đoạn Tổng lượng protein hoạt độ BuChE phần tương ứng 19,95 mg protein 235,41 U, hoạt độ riêng chế phẩm BuChE thu 11,8 U/mgpr Từ hình cho thấy, sắc ký đồ có đỉnh protein trải rộng từ phân đoạn đến phân đoạn 16 Hoạt độ BuChE xuất giải phân đoạn đến phân đoạn Tổng lượng protein hoạt độ BuChE phần tương ứng 20,53 mg protein 271 U, hoạt độ riêng chế phẩm BuChE thu 13,2 U/mg pr Tạp chí Nghiên cứu KH&CN quân sự, Số Đặc san Hội thảo Quốc gia FEE, 10 - 2020 417 Hóa học – Sinh học – Mơi trường Hình Sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G100 tinh BuChE tái tổ hợp Qua bước thí nghiệm này, chúng tơi thấy rằng, sử dụng sắc ký qua cột lọc gel sephadex G75, G100 cho chưa thực loại bỏ protein không mong muốn chế phẩm Đồng thời, hoạt độ riêng chế phẩm BuChE sau qua bước tăng lên khơng đáng kể so với ban đầu Vì vậy, kết luận tinh lọc gel cột sephadex G75, G100 không phù hợp việc tinh BuChE tái tổ hợp Kết tinh sử dụng sắc ký lực trình bày hình Hình Sắc ký lực qua cột Ni- sepharose tinh BuChE tái tổ hợp Từ hình chúng tơi thấy, sắc ký đồ có đỉnh protein từ phân đoạn đến phân đoạn 31 Hoạt độ BuChE xuất phân đoạn đến phân đoạn 13 Tổng lượng protein hoạt độ BuChE phần tương ứng 22,28 mg protein 308,13 U Hoạt độ riêng chế phẩm BuChE thu 13,83U/mg pr Điều cho thấy, enzyme chưa gắn đặc hiệu vào cột lực Qua bước thí nghiệm này, chúng tơi thấy rằng, sử dụng sắc ký qua cột lực cho chưa thực loại bỏ protein không mong muốn chế phẩm Đồng thời, hoạt độ riêng chế phẩm BuChE sau qua bước tăng lên không đáng kể so với ban đầu Vì vậy, kết luận tinh lọc gel cột Ni-sepharose không phù hợp việc tinh BuChE tái tổ hợp Kết tinh sử dụng Sắc ký trao đổi ion trình bày hình Kết phân tích protein phân đoạn rửa chiết thể hình cho thấy, có hai đỉnh protein tách biệt rõ ràng Kết xác định hoạt độ BuChE cho thấy, có đỉnh hoạt độ BuChE đẩy giải từ phân đoạn đến phân đoạn tương ứng với nồng độ NaCl khoảng 100-250 mM Điều cho thấy pH 8, BuChE gắn vào cột sepharose với lực yếu; đẩy sau rửa chiết đệm chứa NaCl Tổng lượng protein hoạt độ BuChE phần tương ứng 4,27 mg protein 515,43U; hoạt độ riêng chế phẩm BuChE thu 120,71U/mg pr Đỉnh hoạt độ đẩy trùng với 418 N N Hoa, …, P K Cường, “Nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ … (EC 3.1.1.8) tái tổ hợp.” Nghiên cứu khoa học cơng nghệ phân đoạn có hàm lượng protein thấp Hoạt độ riêng BuChE tăng lên rõ rệt so với dịch chiết ban đầu Vì vậy, nhận thấy, sử dụng sắc ký trao đổi ion phù hợp để tinh BuChE tái tổ hợp Hình Sắc ký trao đổi ion qua cột DEAE- sepharose tinh BuChE tái tổ hợp Hình Điện di gel polyacrylamide có SDS (A) kiểm tra BuChE tái tổ hợp tinh (B) (1): Dịch lên cột; (2): Dịch qua cột; (3): Dịch r a đệm phosphate 20 mM, pH 8; (4): Thang chuẩn protein nhuộm sẵn dùng cho SDS-PAGE; (5),(6), (7), (8) phân đoạn 4, 5, 6, r a đệm phosphate 20 mM pH có bổ sung NaCl 1M Kết kiểm tra độ tinh BuChE (hình 6) cho thấy, việc sử dụng cột DEAESepharose để tinh BuChE thu hiệu tốt hầu hết thành phần protein phức tạp bị loại bỏ hết Trong phân đoạn tinh sạch, chúng tơi thu băng protein có kích thước khoảng 70 kDa, tương ứng với kích thước protein BuChE So sánh kết thẩm tách miễn dịch (hình 6B) với kết SDS-PAGE cho thấy, băng protein xuất màng PDVF có kích thước 70 kDa trùng với phân đoạn tinh điện di SDS-PAGE cho phép khẳng định tinh thành công protein BuChE KẾT LUẬN Đã hoàn thiện điều kiện tinh enzyme Butyrylcholinesterase tái tổ hợp Dịch chiết tế bào chứa enzyme thô lọc qua màng 0,2 µm lại màng 100 kDa Dịch cô chứa enzyme BuChE tái tổ hợp tinh tốt cột trao đổi ion DEAE-sepharose fast flow đệm phosphate 20 mM, pH 8; NaCl 1M Enyzme sau tinh có hoạt tính riêng khoảng 120 U/mg pr Lời cảm ơn: Cơng trình hồn thành với hỗ trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Viện Khoa học Công nghệ quân với tên gọi “Nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ sản xuất enzym butyrylcholinesterase (EC 3.1.1.8) công nghệ ADN tái tổ hợp phục vụ mục đích trinh sát phát chất độc hóa học” Tạp chí Nghiên cứu KH&CN qn sự, Số Đặc san Hội thảo Quốc gia FEE, 10 - 2020 419 Hóa học – Sinh học – Mơi trường TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ahmed M, Rocha J B T, Correa M, Mazzanti C M, Zanin R F, Morsch A L B,“Inhibition of two different cholinesterases by tacrine”, Chemico-Biological Interactions, 162, 165–171, 2006 [2] Bhagat, Kaur A, Yadav A.K, Chadha B.S, “Cholinesterase inhibitor (Altenuene) from an endophytic fungus Alternaria alternata: optimization, purification and characterization”, Journal of Applied Microbiology ISSN, 1364-5072, 2015 [3] Ellman G, Courtney K, Andres V, Featherstone R, “A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity”, Biochemical Pharmacology, Vol 7, pp 88-95, 1961 [4] Hossein Mehrani, “Simplified procedures for purification and stabilization of human plasma butyrylcholinesterase”, Process Biochemistry 39, 877-882, 2003 [5] Lowry O H, Rosbrough J R, Farr AL, Randall RJ, “Protein Measurement With the Folin Phenol Reagent”, J Biol Chem, 193-265, 1951 [6] Tham L.G, Shukor M.Y, Syed M.A, Shamaan N.A,“Partial purification of cholinesterase from Pangasius pangasius using affinity chromatography”, JEMAT, Vol 5, No 2, 14-18, 2017 [7] Tian J, Xie Y, Chen X, “The progress in Cloning, expression and purification of cholinesterase in Pichia Pastoris: one kind of biomaterial for the detection of Residual Insecticide Contamination”, Advanced Materials Research, Vol.1120-1121, pp 847852, 2015 ABSTRACT STUDY ON COMPLETING THE PURIFICATION PROCESS OF RECOMBINANT ENZYME BUTYRYLCHOLINESTERASE (EC.3.1.1.8) Butyrylcholinesterase is a serine esterase The main effect of BuChE is catalyzing the hydrolysis of Choline esters to choline and carboxylic acids This enzyme is strongly inhibited by organophosphate compounds and neurological agents In the previous study, we successfully expressed recombinant protein BuChE in E coli BL21 DE3 under 0.25 mM IPTG, after hours at 37°C The recombinant BuChE is about 70 kDa with specific activity is 3.58 U/mg protein In order to improve the acquisition efficiency as well as the activity of a recombinant enzyme, we proceed to optimize the purification conditions, including optimizing the cell lysis solution, containing the crude enzyme, selecting the membrane filtration, selecting the gel filtration The crude enzyme solution is extracted in phosphate buffer pH 8, filtered through a membrane filter 100 kDa The fluid on the membrane is purified by various chromatography methods: gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography The results show that the use of ion exchange column to purify BuChE protein has the highest efficiency The active fractions are concentrated through 100kDa membrane, the purified enzyme has specific activity 120 U/mg pr Keywords: Enzyme; Butyrylcholinesterase; Purified Nhận ngày 02 tháng năm 2020 Hoàn thiện ngày 05 tháng 10 năm 2020 Chấp nhận đăng ngày 05 tháng 10 năm 2020 Địa chỉ: 1Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học Công nghệ quân sự; Nhà máy X61/BTL Hóa học; Trường Đại học Khoa học tự nhiên/Đại học Quốc gia Hà Nội *Email: phamkiencuong83@gmail.com 420 N N Hoa, …, P K Cường, “Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ … (EC 3.1.1.8) tái tổ hợp.” ... đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Viện Khoa học Công nghệ quân với tên gọi ? ?Nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ sản xuất enzym butyrylcholinesterase (EC 3.1.1.8) công nghệ ADN tái tổ hợp phục... …, P K Cường, ? ?Nghiên cứu hồn thiện cơng nghệ … (EC 3.1.1.8) tái tổ hợp. ” Nghiên cứu khoa học công nghệ Kết xác định hoạt tính protein BuChE tái tổ hợp thu dịch chiết protein tổng số có hoạt... đổi ion phù hợp để tinh BuChE tái tổ hợp Hình Sắc ký trao đổi ion qua cột DEAE- sepharose tinh BuChE tái tổ hợp Hình Điện di gel polyacrylamide có SDS (A) kiểm tra BuChE tái tổ hợp tinh (B) (1):