Nhằm nâng cao hiệu suất thu nhận cũng như hoạt tính của enzyme BuChE tái tổ hợp, nghiên cứu này tiến hành tối ưu hóa các điều kiện tinh sạch, gồm có tối ưu hóa dịch tế bào chứa enzyme thô, lựa chọn màng lọc, lựa chọn các loại gel tinh sạch.
Trang 1NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ TINH SẠCH
ENZYME BUTYRYLCHOLINESTERASE (EC 3.1.1.8) TÁI TỔ HỢP
Nghiêm Ngọc Hoa1, Nguyễn Hà Trung1, Nguyễn Duy Hưng2
, Nguyễn Vũ Minh Hạnh3
, Phạm Kiên Cường1*
Tóm tắt: Butyrylcholinesterase (BuChE) là một esterase serine Tác dụng chính
của BuChE là xúc tác quá trình thủy phân các este cholin tạo thành cholin và axit cacboxylic Enzyme này bị ức chế mạnh bởi các hợp chất cơ phospho và các tác nhân thần kinh Trong nghiên cứu trước đó, chúng tôi đã biểu hiện thành công protein BuChE tái tổ hợp trong vi khuẩn E coli BL21 DE3 trong điều kiện cảm ứng với IPTG 0,25 mM, sau thời gian 3 giờ ở 37 o C BuChE tái tổ hợp có kích thước khoảng 70 kDa có hoạt độ là 3,58 U/mg protein Nhằm nâng cao hiệu suất thu nhận cũng như hoạt tính của enzyme BuChE tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa các điều kiện tinh sạch, gồm có tối ưu hóa dịch tế bào chứa enzyme thô, lựa chọn màng lọc, lựa chọn các loại gel tinh sạch Dịch enyzme thô được chiết trong đệm phosphate 20 mM, pH 8, được lọc qua màng lọc có kích thước 100 kDa Dịch trên màng được tinh sạch bằng các phương pháp sắc ký khác nhau: sắc ký lọc gel, sắc
ký trao đổi ion, sắc ký ái lực Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của protein BuChE cho thấy, việc s dụng cột trao đổi ion để tinh sạch protein BuChE cho hiệu suất cao nhất Các phân đoạn có hoạt tính được cô qua màng 100 kDa, enyzme sau tinh sạch
có hoạt tính riêng 120 U/mg pr
Từ khóa: Enzyme; Butyrylcholinesterase; Tinh sạch
1 MỞ ĐẦU
Nhằm thu nhận được một lượng lớn enzyme butyrylcholinesterase dùng cho mục đích phân tích hoặc trị liệu cũng như nghiên cứu rất nhiều thông tin về cấu trúc và chức năng của enzyme, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu biểu hiện enzyme này dưới dạng tái
tổ hợp [4, 6, 7] Năm 2012, Brazzolotto và cộng sự đã tiến hành biểu hiện gen mã hóa cho
butyrylcholinesterase của người trong Drosophila melanogaster Protein tạo ra có khả
năng glycosyl hóa cao với năng suất cao hơn 4 lần so với biểu hiện trong tế bào CHO (tế bào buồng trứng của chuột đồng Trung Quốc) Nhóm tác giả cũng đưa ra phương pháp tinh sạch protein dựa trên sắc ký ái lực huprine nhằm thu được protein tinh khiết với hiệu suất cao hơn Năm 2015, Tian và cộng sự đã biểu hiện thành công butyrylcholinesterase
của người (hBuChE) sau tối ưu hóa codon trên nấm men Pichia pastoris dòng GS115
hBuChE tái tổ hợp thu được có nồng độ protein tổng số đạt 292 mg/ml với hoạt độ 14,7
U/ml; sau tinh sạch thu được enzyme có hoạt độ riêng 8,1 U/mg với hiệu suất 68% [7]
Trong nghiên cứu trước đó, chúng tôi đã biểu hiện thành công protein BuChE tái tổ hợp
trong vi khuẩn E coli BL21 DE3 trong điều kiện cảm ứng với IPTG 0,25mM, sau thời
gian 3 giờ ở 37oC BuChE tái tổ hợp có kích thước khoảng 70 kDa có hoạt độ là 3,58 U/mg protein
Nhằm nâng cao hiệu suất thu nhận cũng như hoạt tính của enzyme BuChE tái tổ hợp, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa các điều kiện tinh sạch, gồm có tối ưu hóa dịch tế bào chứa enzyme thô, lựa chọn màng lọc, lựa chọn các loại gel tinh sạch
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu và hóa chất
Chủng vi khuẩn BL21- CodonPlus (DE3)- RIL mang vector pET43a-BuChE; IPTG, Butyrylthiocholine Iodide từ hãng Sigma-Aldrich; thang chuẩn protein nhuộm sẵn dùng
Trang 2cho SDS-PAGE được mua từ hãng Enzynomics; thang chuẩn protein nhuộm sẵn dùng cho
thẩm tách miễn dịch, NBT, BCIP và màng SnakeSkin của hãng Thermo Fisher Scientific,
màng PVDF, kháng thể đơn dòng kháng BuChE chuột của hãng Millipore; kháng thể thứ
cấp kháng IgG chuột của hãng Promega; gel Ni-sepharose của hãng Qiagen; gel
DEAE-sepharose, gel sephadex G75, G100 của hãng GE; màng lọc tiếp tuyến kích thước 50 kDa,
100 kDa; 0,2 µm và một số hóa chất cần thiết khác dùng trong nghiên cứu được mua từ
các hãng hóa chất uy tín trên thế giới
2.2 Thiết bị
Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn, máy lắc ổn nhiệt, máy phá tế bào, thiết bị điện di đứng, máy
điện chuyển ướt, máy ly tâm Sigma 3K, máy ly tâm 5417 R, máy khuấy từ, máy đo quang
phổ kế, máy Nanodrop Hệ thống lọc tiếp tuyến và hệ thống máy sắc ký tự động AKATA
Prime Plus của GE
2.3 Phương pháp, kĩ thuật nghiên cứu
2.3.1 Xác định hàm lượng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng
λ=280 nm và theo phương pháp của Lowry và cộng sự [5] với tinh thể albumin huyết
thanh bò làm đường chuẩn
2.3.2 Xác định hoạt độ Enzyme butyrylcholinesterase
Hoạt tính của enzyme butyrylcholinesterase được xác định theo phương pháp của
Ellman và cộng sự (1961) [3]
2.3.3 Thu dịch chiết tế bào và kiểm tra sự biểu hiện của enzyme butyrylcholinesterase ở
E coli
Một khuẩn lạc dương tính chứa vector tái tổ hợp pET43a-BuChE trên đĩa LB đặc được
cho vào 50ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin (Amp) 50 µg/ml và
chloramphenicol (Cm) 34 µg/ml, nuôi lắc qua đêm với tốc độ 200 vòng/phút tại 37o
C
10ml dịch nuôi được trẻ hóa 50 lần trong 500ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp 50
µg/ml và Cm 34 µg/ml Vi khuẩn được nuôi cho đến khi OD600 đạt 0,6 ÷ 0,8; bổ sung
125µl IPTG 1M rồi đem nuôi ở 37oC, 200 vòng/phút, 3 giờ Sinh khối tế bào được thu sau
3 giờ nuôi cấy bằng cách li tâm ở 9000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC Tủa được hòa
trong đệm Phosphate 20mM, pH 8, thu được dịch sau hòa tủa Bảo quản dịch sau hòa tủa
tại -20oC Dịch sau hòa tủa được đem đi phá vỡ tế bào bằng siêu âm 4 lần trên đá, mỗi lần
30 giây Dịch sau phá tế bào được đem đi li tâm 13000 vòng/phút, trong 20 phút ở 4o
C, thu dịch Khi đó, dịch chứa enzyme được bảo quản ở -20oC cho các bước tiếp theo Sự có mặt
của enzyme butyrylcholinesterase được đánh giá bằng phương pháp điện di trên gel
polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) khẳng định bằng thẩm tách miễn dịch, sử dụng
kháng thể sơ cấp là kháng thể kháng enzyme butyrylcholinesterase gây trên chuột và
kháng thể thứ cấp là kháng thể kháng IgG của chuột có gắn phosphatase kiềm với cơ chất
p-nitro blue tetrazolium chloride 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP)
2.3.4 Phương pháp lọc tiếp tuyến
Dịch chiết tế bào chứa enzyme BuChE thô được lọc qua màng lọc có kích thước 0,2
µm, 100 kDa và 50 kDa trên máy lọc tiếp tuyến AKTA flux, thu dịch
2.3.5 Phương pháp tinh sạch protein bằng sắc ký lọc gel
Tiến hành tinh sạch dịch chiết tế bào chứa enzyme thô bằng các loại gel: sephadex
G75, sephadex G100 Cột gel có đường kính 1cm và chiều dài 80 cm, được cân bằng với
đệm phosphate 20mM, pH 8 Mẫu được cho lên cột với tổng thể tích là 5 ml Sau đó, rửa
chiết bằng đệm phosphate 20mM, pH 8, thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml Các phân
đoạn được phân tích nồng độ protein và kiểm tra hoạt độ enzyme butyrylcholinesterase
Trang 32.3.6 Phương pháp tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực
Tiến hành tinh sạch dịch chiết tế bào chứa enzyme thô bằng gel sepharose Gel Ni-sepharose được nhồi vào cột XK 16/20 để có thể tích cột gel 5ml 15 ml NiSO4 50 mM được cho chảy qua với tốc độ 15-20 ml/giờ để đảm bảo sự bão hòa ion Ni2+
cho gel Cột gel được cân bằng với đệm phosphate 20 mM; pH 8; NaCl 100 mM; PMSF 1 mM (đệm A) có bổ sung imidazol 5 mM bằng cách cho 15 ml đệm A chảy qua với tốc độ 20-30 ml/giờ Mẫu được cho lên cột với tổng thể tích là 5 ml Sau đó, rửa chiết lần lượt bằng đệm A có bổ sung imidazol 5mM, 80mM, 100mM nhằm loại bỏ các protein gắn không đặc hiệu với cột gel Protein gắn cột được rửa chiết bằng đệm A có bổ sung imidazol 250mM Các phân đoạn được phân tích nồng độ protein và kiểm tra hoạt độ enzyme butyrylcholinesterase
2.3.7 Phương pháp tinh sạch protein bằng sắc ký trao đổi ion
Gel trao đổi anion DEAE- sepharose fast flow được ngâm cho đến khi trương hoàn toàn trong đệm phosphate 20 mM, pH 8; sau đó được nhồi vào cột XK 26/70 Cột gel được cân bằng cùng đệm này bằng cách cho khoảng 100 ml đệm chảy qua cột Dịch chiết
tế bào được cho lên cột với tổng thể tích là 5 ml Sau khi cho dịch chiết chạy qua, cột được rửa bằng đệm phosphate 20 mM, pH 8; và cho đẩy bằng gradient NaCl từ 20-1000 mM pha trong 500 ml đệm trên với tốc độ 20 ml/giờ; tiến hành thu các phân đoạn, mỗi phân đoạn 2ml Các phần dịch không hấp thụ và các phân đoạn thu được từ bước đẩy bằng gradient NaCl được phân tích protein và kiểm tra hoạt tính enzyme butyrylcholinesterase
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả kiểm tra sự biểu hiện và hoạt tính của enzyme thô tái tổ hợp
Dịch chiết tế bào được kiểm tra hoạt tính theo phương pháp của Ellman và cộng sự [3] Theo đó, dịch chiết tế bào chứa enzyme có hoạt độ riêng là 3,58 U/mg
Kết quả biểu hiện gen BuChE được kiểm tra bằng SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch (hình 1) cho thấy, dịch chiết tế bào BL21-RIL mang vector pET43a-BuChE có chứa băng protein 70kDa (đường chạy 4,5,6 hình 1A) Trong khi đó, ở mẫu đối chứng âm (tế bào BL21-RIL (1,2,3) không mang vector pET43a-BuChE) không có băng protein này Kết quả thẩm tách miễn dịch, sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng BuChE cũng cho thấy sự có mặt của băng protein 70 kDa ở các mẫu tương ứng với mẫu trên SDS-PAGE (đường chạy
4,5,6 hình 1B) Từ đó, chúng tôi kết luận rằng đã biểu hiện được BuChE ở E coli
Hình 1 SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu hiện BuChE ở E Coli
M: Thang chuẩn protein; 1: Dịch đồng nhất tủa tế bào BL21-RIL; 2: Dịch chiết protein tổng số tế bào BL21-RIL; 3: Dịch hòa phân đoạn tủa tế bào BL21-RIL; 4: Dịch đồng nhất tủa tế bào BL21-RI mang pET43a-BuChE; 5: Dịch chiết protein tổng số tế bào BL21-RIL mang pET43a-BuChE; 6: Dịch hòa phân đoạn tủa tế bào BL21-RIL mang pET43a-BuChE
Trang 4Kết quả xác định hoạt tính protein BuChE tái tổ hợp thu được trong dịch chiết protein
tổng số có hoạt độ riêng là 3,58 U/mg
3.2 Kết quả lọc tiếp tuyến
Dịch sau màng 0,2 µm được lọc qua hai màng lọc với kích thước 50 kDa hoặc 100
kDa Dịch cô trên màng 50 kDa và dịch cô trên màng 100 kDa được kiểm tra hoạt tính [3]
Kết quả được thể hiện trên bảng 1:
Bảng 1 Hoạt tính của dịch lọc qua các loại màng
Kết quả ở bảng 1 cho thấy, hoạt tính của enyzme BuChE tăng sau mỗi bước sử dụng
màng lọc Hoạt tính enzyme ở dịch chiết tế bào trước khi lọc qua màng 0,2 µm là 3,58
U/mg Sau khi lọc qua màng 0,2 µm; hoạt tính tăng lên 1,23 lần (đạt 4,39 U/mg) Dịch lọc
qua màng 0,2 µm sau khi cô qua màng 50 kDa đạt hoạt tính 7,65 U/mg (tăng 1,74 lần)
Dịch lọc qua màng 0,2 µm sau khi cô qua màng 100 kDa đạt hoạt tính 8,2 U/mg (tăng 1,87
lần) Kết quả chỉ ra rằng, việc sử dụng màng 100 kDa sau bước lọc qua màng 0,2 µm cho
hiệu quả tinh sạch cao hơn so với việc sử dụng màng 50 kDa Do đó, chúng tôi sử dụng
màng lọc 100 kDa để cô dịch tế bào chứa enzyme BuChE
3.3 Kết quả tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký
Dịch lọc qua màng được nghiên cứu tinh sạch bằng phương pháp sắc ký: Sắc ký lọc gel
(sephadex G75 và sephadex G100), Sắc ký ái lực và Sắc ký trao đổi ion
Kết quả tinh sạch sử dụng gel sephadex G75 được trình bày ở hình 2 và sử dụng gel
sephadex G100 được trình bày ở hình 3
Hình 2 Sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G75 tinh sạch BuChE tái tổ hợp
Qua đây, sắc ký đồ cho thấy có 2 đỉnh protein trải rộng từ phân đoạn 2 đến phân đoạn
18 Hoạt độ BuChE cũng xuất hiện giải đều trong các phân đoạn 2 đến phân đoạn 7 Tổng
lượng protein và hoạt độ BuChE của phần này tương ứng là 19,95 mg protein và 235,41 U,
hoạt độ riêng của chế phẩm BuChE thu được là 11,8 U/mgpr
Từ hình 3 cho thấy, sắc ký đồ có 2 đỉnh protein trải rộng từ phân đoạn 2 đến phân đoạn
16 Hoạt độ BuChE cũng xuất hiện giải đều trong các phân đoạn 2 đến phân đoạn 6 Tổng
lượng protein và hoạt độ BuChE của phần này tương ứng là 20,53 mg protein và 271 U,
hoạt độ riêng của chế phẩm BuChE thu được là 13,2 U/mg pr
Trang 5Hình 3 Sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G100 tinh sạch BuChE tái tổ hợp
Qua bước thí nghiệm này, chúng tôi thấy rằng, sử dụng sắc ký qua cột lọc gel sephadex G75, G100 đã cho chưa thực hiện loại bỏ được protein không mong muốn trong chế phẩm Đồng thời, hoạt độ riêng của chế phẩm BuChE sau khi qua bước này đã tăng lên không đáng kể so với ban đầu Vì vậy, có thể kết luận rằng tinh sạch lọc gel bằng cột sephadex G75, G100 không phù hợp đối với việc tinh sạch BuChE tái tổ hợp
Kết quả tinh sạch sử dụng sắc ký ái lực được trình bày ở hình 4
Hình 4 Sắc ký ái lực qua cột Ni- sepharose tinh sạch BuChE tái tổ hợp
Từ hình 4 chúng tôi thấy, sắc ký đồ có 2 đỉnh protein từ phân đoạn 6 đến phân đoạn 31 Hoạt độ BuChE cũng xuất hiện trong các phân đoạn 7 đến phân đoạn 13 Tổng lượng protein và hoạt độ BuChE của phần này tương ứng là 22,28 mg protein và 308,13 U Hoạt
độ riêng của chế phẩm BuChE thu được là 13,83U/mg pr Điều này cho thấy, enzyme chưa được gắn đặc hiệu vào cột ái lực Qua bước thí nghiệm này, chúng tôi thấy rằng, sử dụng sắc ký qua cột ái lực đã cho chưa thực hiện loại bỏ được protein không mong muốn trong chế phẩm Đồng thời, hoạt độ riêng của chế phẩm BuChE sau khi qua bước này đã tăng lên không đáng kể so với ban đầu Vì vậy, có thể kết luận rằng tinh sạch lọc gel bằng cột Ni-sepharose không phù hợp đối với việc tinh sạch BuChE tái tổ hợp
Kết quả tinh sạch sử dụng Sắc ký trao đổi ion được trình bày ở hình 5 Kết quả phân tích protein của các phân đoạn rửa chiết được thể hiện trên hình 5 cho thấy, có hai đỉnh protein tách biệt rõ ràng Kết quả xác định hoạt độ BuChE cho thấy, chỉ có một đỉnh hoạt
độ BuChE được đẩy ra giải đều từ phân đoạn 4 đến phân đoạn 8 tương ứng với nồng độ NaCl ở khoảng 100-250 mM Điều này cho thấy ở pH 8, BuChE gắn vào cột sepharose với
ái lực yếu; được đẩy ra ngay sau khi rửa chiết bằng đệm chứa NaCl Tổng lượng protein và hoạt độ BuChE của phần này tương ứng là 4,27 mg protein và 515,43U; hoạt độ riêng của chế phẩm BuChE thu được là 120,71U/mg pr Đỉnh hoạt độ được đẩy ra trùng với các
Trang 6phân đoạn có hàm lượng protein thấp Hoạt độ riêng của BuChE tăng lên rõ rệt so với dịch
chiết ban đầu Vì vậy, chúng tôi nhận thấy, sử dụng sắc ký trao đổi ion là phù hợp để tinh
sạch BuChE tái tổ hợp
Hình 5 Sắc ký trao đổi ion qua cột DEAE- sepharose tinh sạch BuChE tái tổ hợp
Hình 6 Điện di gel polyacrylamide có SDS (A) kiểm tra BuChE tái tổ hợp đã tinh sạch (B)
(1): Dịch lên cột; (2): Dịch qua cột; (3): Dịch r a bằng đệm phosphate 20 mM, pH 8;
(4): Thang chuẩn protein nhuộm sẵn dùng cho SDS-PAGE; (5),(6), (7), (8) lần lượt là các
phân đoạn 4, 5, 6, 7 r a bằng đệm phosphate 20 mM pH 8 có bổ sung NaCl 1M
Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của BuChE (hình 6) cho thấy, việc sử dụng cột
DEAE-Sepharose để tinh sạch BuChE thu được hiệu quả tốt bởi vì hầu hết các thành phần protein
phức tạp bị loại bỏ hết Trong các phân đoạn tinh sạch, chúng tôi chỉ thu được một băng
protein có kích thước khoảng 70 kDa, tương ứng với kích thước của protein BuChE So
sánh kết quả thẩm tách miễn dịch (hình 6B) với kết quả SDS-PAGE cho thấy, những băng
protein xuất hiện trên màng PDVF có cùng kích thước 70 kDa trùng với các phân đoạn
tinh sạch khi điện di SDS-PAGE cho phép chúng tôi khẳng định đã tinh sạch thành công
protein BuChE
4 KẾT LUẬN
Đã hoàn thiện được các điều kiện tinh sạch enzyme Butyrylcholinesterase tái tổ hợp
Dịch chiết tế bào chứa enzyme thô được lọc qua màng 0,2 µm và được cô lại bằng màng
100 kDa Dịch cô chứa enzyme BuChE tái tổ hợp được tinh sạch tốt bằng cột trao đổi ion
DEAE-sepharose fast flow trong đệm phosphate 20 mM, pH 8; NaCl 1M Enyzme sau tinh
sạch có hoạt tính riêng khoảng 120 U/mg pr
Lời cảm ơn: Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu khoa
học công nghệ cấp Viện Khoa học và Công nghệ quân sự với tên gọi “Nghiên cứu hoàn thiện công
nghệ sản xuất enzym butyrylcholinesterase (EC 3.1.1.8) bằng công nghệ ADN tái tổ hợp phục vụ
mục đích trinh sát phát hiện chất độc hóa học”
Trang 7TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Ahmed M, Rocha J B T, Correa M, Mazzanti C M, Zanin R F, Morsch A L
B,“Inhibition of two different cholinesterases by tacrine”, Chemico-Biological
Interactions, 162, 165–171, 2006
[2] Bhagat, Kaur A, Yadav A.K, Chadha B.S, “Cholinesterase inhibitor (Altenuene) from
an endophytic fungus Alternaria alternata: optimization, purification and characterization”, Journal of Applied Microbiology ISSN, 1364-5072, 2015
[3] Ellman G, Courtney K, Andres V, Featherstone R, “A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity”, Biochemical Pharmacology, Vol 7, pp
88-95, 1961
[4] Hossein Mehrani, “Simplified procedures for purification and stabilization of human plasma butyrylcholinesterase”, Process Biochemistry 39, 877-882, 2003
[5] Lowry O H, Rosbrough J R, Farr AL, Randall RJ, “Protein Measurement With the Folin Phenol Reagent”, J Biol Chem, 193-265, 1951.
[6] Tham L.G, Shukor M.Y, Syed M.A, Shamaan N.A,“Partial purification of cholinesterase from Pangasius pangasius using affinity chromatography”, JEMAT,
Vol 5, No 2, 14-18, 2017
[7] Tian J, Xie Y, Chen X, “The progress in Cloning, expression and purification of cholinesterase in Pichia Pastoris: one kind of biomaterial for the detection of Residual Insecticide Contamination”, Advanced Materials Research, Vol.1120-1121, pp
847-852, 2015
ABSTRACT
STUDY ON COMPLETING THE PURIFICATION PROCESS
OF RECOMBINANT ENZYME BUTYRYLCHOLINESTERASE (EC.3.1.1.8)
Butyrylcholinesterase is a serine esterase The main effect of BuChE is catalyzing the hydrolysis of Choline esters to choline and carboxylic acids This enzyme is strongly inhibited by organophosphate compounds and neurological agents In the previous study, we successfully expressed recombinant protein BuChE in E coli BL21 DE3 under 0.25 mM IPTG, after 3 hours at 37°C The recombinant BuChE is about 70 kDa with specific activity is 3.58 U/mg protein In order to improve the acquisition efficiency as well as the activity of a recombinant enzyme, we proceed to optimize the purification conditions, including optimizing the cell lysis solution, containing the crude enzyme, selecting the membrane filtration, selecting the gel filtration The crude enzyme solution is extracted in phosphate buffer pH 8, filtered through a membrane filter 100 kDa The fluid on the membrane
is purified by various chromatography methods: gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography The results show that the use of ion exchange column to purify BuChE protein has the highest efficiency The active fractions are concentrated through 100kDa membrane, the purified enzyme has specific activity 120 U/mg pr
Keywords: Enzyme; Butyrylcholinesterase; Purified
Nhận bài ngày 02 tháng 8 năm 2020 Hoàn thiện ngày 05 tháng 10 năm 2020 Chấp nhận đăng ngày 05 tháng 10 năm 2020
Địa chỉ: 1 Viện Công nghệ mới/Viện Khoa học và Công nghệ quân sự;
2 Nhà máy X61/BTL Hóa học;
3 Trường Đại học Khoa học tự nhiên/Đại học Quốc gia Hà Nội
*Email: phamkiencuong83@gmail.com.