Nhận xét đặc điểm đột biến EGFR huyết tương ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại bệnh viện bạch mai năm 2017 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN HỮU THẮNG NHẬN XÉT ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2017 – 2018 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA Hà Nội – 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN HỮU THẮNG NHẬN XÉT ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2017 – 2018 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH Y ĐA KHOA KHÓA QH.2013.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN 1: PGS.TS PHẠM CẨM PHƯƠNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN 2: PGS.TS LÊ THỊ LUYẾN Hà Nội – 2019 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng tri ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Cẩm Phương PGS.TS Lê Thị Luyến, người thầy, người hướng dẫn khoa học, tận tình giúp đỡ, động viên em suốt trình học tập, trực tiếp hướng dẫn em thực nghiên cứu, góp ý sửa chữa khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy, cô giáo Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, người tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho em q trình thực đề tài hồn thành khóa luận Em xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến thầy cô, đồng nghiệp, người tạo điều kiện, giúp đỡ em trình thực khóa luận: GS.TS Mai Trọng Khoa, PGS.TS Trần Đình Hà (Trung tâm Y học hạt nhân Ung bướu, Bệnh Viện Bạch Mai), TS Nguyễn Thuận Lợi, ThS Nguyễn Tiến Lung, toàn thể bác sỹ, điều dưỡng, kỹ thuật viên Đơn vị Gen – Tế bào gốc, Trung tâm Y học hạt nhân Ung bướu, Bệnh Viện Bạch Mai giúp đỡ em trình thu thập số liệu phục vụ cho nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình, bạn bè giúp đỡ ủng hộ em trình học tập Tuy nhiên kiến thức chun mơn cịn hạn chế thân thiếu nhiều kinh nghiệm thực tiễn nên nội dung khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận góp ý để khóa luận hoàn thiện Hà Nội, tháng 05 năm 2019 Nguyễn Hữu Thắng DANH MỤC TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Ký hiệu/từ viết tắt AJCC ATP CEA ctDNA DNA EGFR EMT FDA kDa OS PCR PET-CT PFS PI3K RR SCC SPECT TKI TNM UTPKTBN WHO i MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG –TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ (UTPKTBN) 1.1.1 Dịch tễ học 1.1.2 Yếu tố nguy 1.1.3 Triệu chứng 1.1.4 Chẩn đoán 1.2 THỤ THỂ YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG BIỂU BÌ (EGFR) 1.2.1 Cấu trúc hoạt hoá EGFR 1.2.2 Đột biến EGFR 10 1.2.3 Điều trị UTPKTBN thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) phân tử nhỏ 12 1.2.4 Sự kháng thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) 13 1.2.5 Phương pháp lấy mẫu, xác định đột biến gen EGFR mẫu huyết tương UTPKTBN 16 1.2.6 Tình hình nghiên cứu đột biến EGFR huyết tương bệnh nhân UTPKTBN 21 CHƯƠNG – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 24 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn lựa 24 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 24 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 24 2.2.2 Cỡ mẫu 24 2.2.3 Các biến số, số nghiên cứu 24 2.2.4 Thời gian nghiên cứu 24 ii 2.2.5 Địa điểm nghiên cứu 25 2.2.6 Các bước thực 25 2.3 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 26 CHƯƠNG – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 3.1.1 Đặc điểm lâm sàng 27 3.1.2 Đặc điểm mô bệnh học giai đoạn bệnh 27 3.2.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG 28 3.3 MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG 29 3.3.1 Mối liên quan đột biến EGFR huyết tương với đặc điểm bệnh nhân 29 3.3.2 Mối liên quan đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học giai đoạn bệnh 30 3.3.3 Đột biến T790M số yếu tố liên quan 31 CHƯƠNG – BÀN LUẬN 34 4.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34 4.1.1 Đặc điểm lâm sàng 34 4.1.2 Đặc điểm mô bệnh học – giai đoạn bệnh 35 4.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG 35 4.3 MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG 36 4.3.1 Mối liên quan tình trạng dột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân 36 4.3.2 Mối liên quan đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học – giai đoạn bệnh 38 4.3.3 Đột biến T790M số yếu tố liên quan 38 iii KẾT LUẬN 41 KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC - PHỤ LỤC QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG - PHỤ LỤC PHIẾU THÔNG TIN BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU - PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN - - iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mơ hình cấu trúc hoạt động EGFR Hình 1.2 Các đường truyền tín hiệu nội bào khởi nguồn từ EGFR 10 Hình 1.3 Các dạng đột biến gen EGFR định tính đáp ứng với TKIs 11 Hình 1.4 Phân bố số chế kháng thuốc ức chế tyrosine kinase hệ I,II 14 Hình 1.5 Biểu đồ khuếch đại phản ứng real-time PCR 18 Hình 1.6 Biểu đồ chuẩn phản ứng real-time PCR 19 Hình 2.1 Sơ đồ bước tiến hành nghiên cứu 25 Hình 3.1 Đặc điểm giai đoạn bệnh đối tượng nghiên cứu 28 Hình 3.2 Tỷ lệ loại đột biến exon 18-21 gen EGFR 29 Hình 3.3 Ví dụ đột biến kháng thuốc thứ phát T790M 32 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại giai đoạn UTPKTBN theo AJCC 2010 Bảng 3.1 Đặc điểm lâm sàng đối tượng nghiên cứu 27 Bảng 3.2 Đặc điểm mô bệnh học đối tượng nghiên cứu 28 Bảng 3.3 Tỷ lệ bệnh nhân đột biến EGFR huyết tương 28 Bảng 3.4 Mối liên quan đột biến EGFR huyết tương với đặc điểm bệnh nhân 30 Bảng 3.5 Mối liên quan đột biến EGFR huyết tương với mô bệnh học giai đoạn bệnh 30 Bảng 3.6 Mối liên quan đột biến T790M đặc điểm bệnh nhân 31 Bảng 3.7 Mối liên quan đột biến T790M với mô bệnh học – giai đoạn bệnh 32 v ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phế quản phổi nguyên phát ung thư xuất phát từ niêm mạc phế quản, phế nang Dựa vào mô bệnh học, ung thư phế quản phổi chia thành hai thể bệnh chính: ung thư phổi không tế bào nhỏ ung thư phổi tế bào nhỏ, ung thư phổi khơng tế bào nhỏ chiếm 85% Ung thư phế quản phổi chẩn đoán sớm thường khó khăn tốn Phần lớn chẩn đoán giai đoạn muộn Chẩn đoán ung thư phế quản phổi cần phối hợp nhiều phương pháp: Lâm sàng, X – quang, chụp cắt lớp vi tính, nội soi, xét nghiệm tế bào, mơ bệnh học Có nhiều phương pháp điều trị ung thư phổi phẫu thuật, hoá trị, xạ trị, điều trị đích; nhiều nghiên cứu chứng minh thuốc ức chế tyrosine kinase (tyrosine kinase inhibitor – TKI) giúp trì hỗn bệnh tiến triển cải thiện chất lượng sống tốt so với hố trị bệnh nhân có đột biến EGFR [3] Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor Receptor – EGFR) yếu tố ảnh hưởng đến phát triển ung thư, có ung thư phổi Đột biến vùng tyrosine kinase EGFR quan trọng cho việc xác định độ nhạy thuốc ức chế tyrosine kinase (TKIs) Hiện nay, kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA dựa mẫu mô ung thư xem tiêu chuẩn vàng phát đột biến gen EGFR Tuy nhiên, phương pháp không khả thi số trường hợp không đủ điều kiện cho phép sinh thiết, mẫu sinh thiết nhỏ, không đủ để giải trình tự gen, cần kiểm tra lại mẫu huyết tương tín hiệu đột biến thấp Phương pháp phát đột biến gen EGFR cách sử dụng ctDNA (circulating tumor DNA) có huyết tương bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (mẫu “sinh thiết lỏng” – Liquid Biopsy) có nhiều ưu điểm vượt trội [23, 30] Điều cho phép bệnh nhân có thêm hội để làm xét nghiệm chẩn đoán, đồng thời làm xét nghiệm lặp lại nhiều lần để theo dõi điều trị mà không cần can thiệp sâu sinh thiết Bên cạnh đó, phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, giảm chi phí, thời gian cho bệnh nhân không gây biến chứng [8] Như vậy, việc phân tích đánh giá tình trạng đột biến EGFR mẫu huyết tương cần thiết giúp bác sĩ việc điều trị nhằm kéo dài thời gian sống nâng cao chất lượng sống bệnh nhân Do đó, đề tài nghiên cứu Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, 26(10), 1742-1751 28 Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, et al (1977), "Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy", Cancer Res, 37(3), 646-50 29 Li X, Ren R, Ren S, et al (2014), "Peripheral blood for epidermal growth factor receptor mutation detection in non-small cell lung cancer patients", Translational oncology, 7(3), 341-348 30 Luo J, Shen L, and Zheng D (2014), "Diagnostic value of circulating free DNA for the detection of EGFR mutation status in NSCLC: a systematic review and meta-analysis", Scientific reports, 4, 6269-6269 31 Marmor MD, Skaria KB, and Yarden Y (2004), "Signal transduction and oncogenesis by ErbB/HER receptors", International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics, 58(3), 903-913 32 Nurwidya F, Takahashi F, Murakami A, et al (2014), "Acquired resistance of non-small cell lung cancer to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors", Respiratory Investigation, 52(2), 82-91 33 Ohashi K, Maruvka YE, Michor F, et al (2013), "Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor–Resistant Disease", Journal of Clinical Oncology, 31(8), 1070-1080 34 Oser MG, Niederst MJ, Sequist LV (2015), "Transformation from non-small-cell lung cancer to small-cell lung cancer: molecular drivers and cells of origin", The Lancet Oncology, 16(4), e165-e172 35 Pao W, Miller VA (2005), "Epidermal growth factor receptor mutations, small-molecule kinase inhibitors, and non-small-cell lung cancer: current knowledge and future directions", J Clin Oncol, 23(11), 2556-68 36 Pao W, Miller VA, Politi KA, et al (2005), "Acquired Resistance of Lung Adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib Is Associated with a Second Mutation in the EGFR Kinase Domain", PLOS Medicine, 2(3), e73 37 Piperdi B, Perez-Soler R (2012), "Role of erlotinib in the treatment of non-small cell lung cancer: clinical outcomes in wild-type epidermal growth factor receptor patients", Drugs, 72 Suppl 1(0 1), 11-19 38 Pirker R, Filipits M (2016), "Personalized treatment of advanced non-small-cell lung cancer in routine clinical practice", Cancer and Metastasis Reviews, 35(1), 141-150 39 Pirker R (2015), "What is the best strategy for targeting EGF receptors in non-small-cell lung cancer?", Future Oncol, 11(1), 153-67 40 Ramalingam SS, Yang JC, Lee CK, et al (2015), "AZD9291, a mutant-selective EGFR inhibitor, as first-line treatment for EGFR mutation- positive advanced non-small cell lung cancer (NSCLC): Results from a phase expansion cohort", Journal of Clinical Oncology, 33(15 suppl), 8000-8000 41 Reck M, Hagiwara K, Han B, et al (2016), "ctDNA Determination of EGFR Mutation Status in European and Japanese Patients with Advanced NSCLC: The ASSESS Study", J Thorac Oncol, 11(10), 16829 42 Robertson EG, Baxter G (2011), "Tumour seeding following percutaneous needle biopsy: the real story!", Clin Radiol, 66(11), 100714 43 Rosell R, Carcereny E, GERvais R, et al (2012), "Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase trial", The Lancet Oncology, 13(3), 239-246 44 Sakuma Y, Matsukuma S, Yoshihara M, et al (2007), "Epidermal growth factor receptor gene mutations in atypical adenomatous hyperplasias of the lung", Modern Pathology, 20, 967 45 Sequist LV, Bell DW, Lynch TJ, et al (2007), "Molecular predictors of response to epidermal growth factor receptor antagonists in nonsmall-cell lung cancer", J Clin Oncol, 25(5), 587-95 46 Sequist LV, Waltman BA, Dias-Santagata D, et al (2011), "Genotypic and Histological Evolution of Lung Cancers Acquiring Resistance to EGFR Inhibitors", Science Translational Medicine, 3(75), 75-26 47 Sharma SV, Bell DW, Settleman J, et al (2007), "Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer", Nature Reviews Cancer, 7, 169 48 Shigematsu H, Lin L, Takahashi T, et al (2005), "Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers", J Natl Cancer Inst, 97(5), 339-46 49 Soria JC, Ohe Y, Vansteenkiste J, et al (2018), "Osimertinib in Untreated EGFR-Mutated Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer", N Engl J Med, 378(2), 113-125 50 Suda K, Tomizawa K, Fujii M, et al (2011), "Epithelial to mesenchymal transition in an epidermal growth factor receptor-mutant lung cancer cell line with acquired resistance to erlotinib", J Thorac Oncol, 6(7), 1152-61 51 Takahama T, Sakai K, Takeda M, et al (2016), "Detection of the T790M mutation of EGFR in plasma of advanced non-small cell lung cancer patients with acquired resistance to tyrosine kinase inhibitors (West Japan oncology group 8014LTR study)", Oncotarget, 7(36), 58492-58499 52 Takezawa K, Pirazzoli V, Arcila ME, et al (2012), "HER2 amplification: a potential mechanism of acquired resistance to EGFR inhibition in EGFR-mutant lung cancers that lack the second-site EGFRT790M mutation", Cancer Discov, 2(10), 33-922 53 Thiery JP, Acloque H, Huang RY, et al (2009), "Epithelialmesenchymal transitions in development and disease", Cell, 139(5), 90871 54 Travis WD, Brambilla E, Nicholson AG, et al (2015), "The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification", Journal of Thoracic Oncology, 10(9), 1243-1260 55 Vossen RH, White SJ (2017), "Quantitative DNA Analysis Using Droplet Digital PCR", Methods Mol Biol, 1492, 167-177 56 WHO (2018) "GLOBOCAN 2018 Estimated cancer incidence, mortality and prevalence worldwide in 2018", from http://gco.iarc.fr/today/fact-sheets-populations 57 Wislez M, Kurie JM (2012), The intersection of EGFR and the Ras signaling pathway Cancer drug discovery and development: EGFR signaling networks in cancer therapy 89-95 58 Wu SG, Shih JY (2018), "Management of acquired resistance to EGFR TKI–targeted therapy in advanced non-small cell lung cancer", Molecular Cancer, 17(1), 38 59 Yamaguchi F, Fukuchi K, Yamazaki Y, et al (2014), "Acquired resistance L747S mutation in an epidermal growth factor receptortyrosine kinase inhibitor-naive patient: A report of three cases", Oncol Lett, 7(2), 357-360 60 Yasuda H, Park E, Yun CH, et al (2013), "Structural, Biochemical, and Clinical Characterization of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Exon 20 Insertion Mutations in Lung Cancer", Science Translational Medicine, 5(216), 177-216 61 Yu HA, Arcila ME, Rekhtman N, et al (2013), "Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers", Clin Cancer Res, 19(8), -2240 62 Yun CH, Mengwasser KE, Toms AV, et al (2008), "The T790M mutation in EGFR kinase causes drug resistance by increasing the affinity for ATP", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105(6), 2070-2075 63 Zakowski MF, Ladanyi M, and Kris MG (2006), "EGFR mutations in small-cell lung cancers in patients who have never smoked", N Engl J Med, 355(2), 5-213 64 Zhang S, Zhu L, and Chen X (2018), "ctDNA assessment of EGFR mutation status in Chinese patients with advanced non-small cell lung cancer in real-world setting", Journal of thoracic disease, 10(7), 41694177 65 Zhang Z, Lee JC, Lin L, et al (2012), "Activation of the AXL kinase causes resistance to EGFR-targeted therapy in lung cancer", Nat Genet, 44(8), 852-60 66 Zhao X, Han RB,Zhao J, et al (2013), "Comparison of Epidermal Growth Factor Receptor Mutation Statuses in Tissue and Plasma in Stage I–IV Non-Small Cell Lung Cancer Patients", Respiration, 85(2), 119-125 67 Zhou C, Wu YL, Chen G, et al (2011), "Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG0802): a multicentre, open-label, randomised, phase study", The Lancet Oncology, 12(8), 735-742 PHỤ LỤC PHỤ LỤC QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG Trong việc kiểm tra đột biến EGFR huyết tương, sử dụng kit cobas® Sample Preparation (Roche) để tách DNA kit cobas® EGFR mutation Test v2 để khuếch đại DNA phát đột biến + Chuẩn bị Để xét nghiệm đột biến EGFR mẫu huyết tương, cần chuẩn bị 5ml mẫu máu bệnh nhân thu thập ống EDTA, sau ly tâm 4000xg 10 phút để tách huyết tương khỏi máu, khoảng 2ml huyết tương thu thập phải lưu trữ nhiệt độ -80 oC xử lý thêm sử dụng Thử nghiệm bao gồm giai đoạn chính: Tách DNA khuếch đại DNA + Tách DNA Chuẩn bị ống falcon 15ml có dán nhãn dành cho mẫu huyết tương chứng âm (dùng nước) Vortex mẫu huyết tương sau chuyển 2ml (thể tích nhỏ nhất) huyết tương chứng âm sang ống falcon 15ml có dán nhãn tương ứng Tiến hành loại bỏ protein cách bổ sung 250 µl Protein Kinase (PK) vào ống để phân giải protein, đồng thời thêm 2ml DNA PBB vào ống nhằm tăng khả bám dính tăng tương tác DNA với cột lọc Trộn ống falcon 3-5 lần cách đảo ngược ủ nhiệt độ phòng 15-30 oC 30 phút Trong trình ủ chuẩn bị số lượng cột lọc HPEA FT (HPEA filter tube) có dán nhãn nắp cột cột thu (CT – collection tube) đủ dùng cho mẫu chứng âm Mỗi mẫu cần HPEA FT, CT elution tube (ống 1,5 ml) Sau 30 phút ủ, tiến hành tủa thu DNA Bổ sung 500 µl Isopropanol để kết tủa DNA, trộn ống falcon 3-5 lần cách đảo ngược Sau chuyển toàn dung dịch ống qua HPEA FT ly tâm 4000×g -1- phút Ly tâm xong tiến hành lấy HPEA khỏi FT, loại bỏ phần dung dịch bên chảy qua HPEA FT đặt FT vào ống CT Thêm 500 µl WBI (Wash Buffer I) pha ethenol vào FT ly tâm 8000×g phút để rửa tủa, loại bỏ muối, tạp chất Sau tiếp tục đặt FT vào ống CT rửa lần WBII pha ethanol, ly tâm 8000×g phút Lại đặt FT vào CT mới, ly tâm 16000-20000×g/1 phút để làm khơ màng lọc làm bay ethanol ethanol làm hạn chế mồi Taqman phản ứng realtime PCR Tiến hành thu DNA cách đặt FT vào elution tube, sau hồ tan tủa cách cho thêm 100 µl DNA EB (elution buffer) vào FT cho không đụng vào màng FT ủ 15 oC đến 30oC/15 phút Ly tâm 8000×g/1 phút Loại bỏ FT, thu dung dịch DNA stock cách hút chậm 80µl từ ống DNA stock sang ống elution tube thứ Hút cẩn thận để tránh hút lên pellet Dung dịch ống sẵn sàng cho phản ứng PCR Chú ý: hút phải pellet hút DNA stock ngược trở lại ống elution tube Ly tâm 8000×g/1 phút Sau làm lại bước chuyển 80µl sang ống thứ + Phát khuếch đại DNA Vortex ống hoá chất giây (dùng pipette) Chuẩn bị ống PCR, dán nhãn tương ứng với MMX1, MMX2, MMX3, pha loại Master mix công thức: tổng thể tích mẫu = (tổng số mẫu +2 mu chng +1) ì 20àl Cụng thc tớnh th tích MgAc cho MMX tính theo cơng thức sau: thể tích MgAc cần thiết = (tổng s mu + mu chng + 1) ì 5àl Trộn thể tích MMX1,2,3 với thể tích MgAc để mẫu MMX hoạt động Thêm 25µl MMX, chứng âm dương, mẫu theo bảng sau: -2- Hàng/ Cột A 01 PC MMX1 NC MMX1 S1 MMX1 S2 MMX1 S3 MMX1 S4 MMX1 S5 MMX1 S6 MMX1 B C D E F G H PC: posive control: chứng dương; NC: negative control: chứng âm, S#: Sample #: mẫu # Sau hoàn thành việc thêm mẫu vào đĩa theo hướng dẫn, đĩa dán lại Thiết lập máy phân tích cobas z khởi động PCR Việc kiểm tra xác nhận mẫu chạy phần mềm cobas® 4800 Việc khuếch đại DNA thực cách sử dụng realtime PCR có nhiều ưu điểm so với PCR thơng thường Realtime PCR nhạy hơn, xác hơn, tốn thời gian địi hỏi cơng sức so với PCR truyền thống Ngoài ra, realtime PCR hiển thị liệu sau chu kỳ PCR thông thường cho kết kết thúc phản ứng Nhưng tính quan trọng realtime PCR thực nghiệm đo lường định lượng sản phẩm Tính định giúp xác định số bán định lượng (SQI) đột biến SQI phép đo bán định lượng ctDNA (DNA khối u lưu hành máu) sử dụng để theo dõi diện đột biến EGFR theo thời gian Theo dõi số đột biến EGFR quan trọng để quan sát tiến triển bệnh bệnh nhân xác định hướng điều trị tương lai -3- PHỤ LỤC PHIẾU THÔNG TIN BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU I THÔNG TIN CHUNG 1.Họ tên bệnh nhân: 2.Mã số bệnh nhân: 3.Tuổi: 4.Giới tính: □ Nam □ Nữ 5.Lý vào viện: □ Triệu chứng hô hấp □ Nổi hạch □ Triệu chứng quan di □ Triệu chứng toàn thân □ Khám sức khoẻ phát u phổi Tiền sử hút thuốc lá: □ Không □ Đã hút thuốc Số lượng thuốc lá: (bao.năm) Tiền sử điều trị thuốc đích TKIs □ Khơng □ Đã điều trị thuốc TKIs Nếu có, ghi rõ loại thuốc: Mô bệnh học: □ Ung thư biểu mô tuyến Giai đoạn T: □ Tx □ T1 □ T2 Giai đoạn N: -4- □ Nx □N1 □N2 □N3 Di căn: □ Có □ Khơng Nếu có, ghi rõ vị trí di căn: Kết đột biến gen mẫu mơ: □ Có□ Khơng Nếu có, ghi rõ vị trí đột biến: III XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN EGFR HUYẾT TƯƠNG Kết đột biến EGFR huyết tương: □ Có □ Khơng 2.Vị trí đột biến: Chỉ số SQI: -5- PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 -10- ... HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN HỮU THẮNG NHẬN XÉT ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI NĂM 2017 – 2018 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH... Dựa vào mô bệnh học, ung thư phế quản phổi chia thành hai thể bệnh chính: ung thư phổi khơng tế bào nhỏ ung thư phổi tế bào nhỏ, ung thư phổi không tế bào nhỏ chiếm 85% Ung thư phế quản phổi chẩn... cao chất lượng sống bệnh nhân Do đó, đề tài nghiên cứu ? ?Nhận xét đặc điểm đột biến EGFR huyết tương bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ Bệnh viện Bạch Mai năm 2017 – 2018? ?? thực với mục tiêu