Nghiên cứu này khảo sát hình thái tế bào, đường cong tăng trưởng và tốc độ tăng trưởng Thalassiosira sp. trong môi trường nước biển nhân tạo (NBNT). Khảo sát ảnh hưởng của IAA (indol-3-acetic-acid) và BA (benzyl adenin) lên sự sinh trưởng Thalassiosira sp. trong môi trường NBNT thông qua các chỉ số trên.
Năm học 2009 – 2010 BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA AUXIN VÀ CYTOKININ LÊN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO THALASSIOSIRA SP TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC BIỂN NHÂN TẠO Võ Thị Ngọc Thành (SV năm 3, Khoa Sinh học) GVHD: TS Lê Thị Trung, CN Huỳnh Thị Ngọc Như Mở đầu Trong tự nhiên, vi tảo xem “đồng cỏ” biển, mắt xích quan trọng chuỗi thức ăn sinh vật biển, khâu chu trình vật chất biển [1] Về ứng dụng, chúng nguồn thức ăn bổ dưỡng cho người, động vật, đặc biệt ngành ni trồng thuỷ sản; nguồn phân bón sinh học; nguồn lượng sạch… [4] Trong vi tảo, tảo Silic chiếm 60-70% số loài sinh vật lượng Do đó, tảo Silic giữ vai trị trọng yếu Trên giới, việc nghiên cứu vi tảo tiến hành từ lâu khảo cứu sâu, rộng nhiều vấn đề Tuy nhiên, Việt Nam việc nghiên cứu sinh lý học vi tảo nhiều hạn chế Bên cạnh đó, vai trị chất điều hồ sinh trưởng thực vật nghiên cứu nhiều thực vật bậc cao với đối tượng thực vật bậc thấp nói chung tảo Silic nói riêng, vai trị chúng chưa hiểu rõ Và lý chọn đề tài “Bước đầu khảo sát ảnh hưởng auxin cytokinin lên sinh trưởng Thalassiosira sp môi trường nước biển nhân tạo” Mục đích nghiên cứu Khảo sát hình thái tế bào, đường cong tăng trưởng tốc độ tăng trưởng Thalassiosira sp môi trường nước biển nhân tạo (NBNT) Khảo sát ảnh hưởng IAA (indol-3-acetic-acid) BA (benzyl adenin) lên sinh trưởng Thalassiosira sp môi trường NBNT thông qua số Vật liệu - phương pháp nghiên cứu 3.1 Vật liệu Mẫu vi tảo Thalassiosira sp thạc sĩ Nguyễn Tấn Đại thu vùng biển Cần Giờ - TPHCM, phân lập giữ mẫu phịng thí nghiệm sinh lý thực vật trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh 227 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 3.2 Phương pháp Môi trường nuôi cấy Môi trường nước biển nhân tạo, độ mặn 3%, pH 8,2 (Harrison, 1980) Lấy mẫu cấy chuyền Mẫu lấy cấy chuyền nhằm mục đích giữ giống bố trí thí nghiệm Sau cấy chuyền mẫu tảo nuôi theo dõi theo phương pháp bán liên tục, ngày lấy lượng mẫu định bổ sung lại lượng môi trường tương đương Thời gian lấy mẫu nằm khoảng sai số nửa [9] Trong thí nghiệm, mẫu cấy chuyền sang bình tam giác 250ml với thể tích dịch ni cố định 125ml Mật độ xuất phát 5.103 tế bào/ml cấy chuyền vào ngày thứ tư Điều kiện nuôi: cường độ ánh sáng 3000 ± 500lux, nhiệt độ 25 oC ± 2oC, chu kỳ sáng tối 12:12 Đếm tế bào xác định mật độ tế bào Mật độ tế bào dịch nuôi xác định thông qua số tế bào đếm phòng đếm hồng cầu, đếm ba ngăn buồng đếm hai lần đưa mẫu lên buồng đếm [6] Quan sát hình thái Mẫu lấy với thể tích 10 µl, quan sát kính hiển vi quang học X40 Xác định đường cong tăng trưởng Đường cong tăng trưởng mẫu xác định dựa mật độ tế bào hàng ngày Tính tốc độ tăng trưởng Mật độ tế bào hai thời điểm khác trình tăng trưởng mẫu dùng để tính tốc độ tăng trưởng khoảng thời gian [9] Khảo sát ảnh hưởng IAA BA riêng rẽ Theo dõi tăng trưởng vi tảo môi trường NBNT có bổ sung IAA BA riêng rẽ với nồng độ khác 10-10 g/ml, 10-9 g/ml, 10-8 g/ml so với chuẩn Trong tất nghiệm thức, mẫu tảo Thalassiosira sp nuôi môi trường với mật độ xuất phát thời điểm cấy chuyền Mỗi ngày lấy 2ml mẫu bổ sung lại lượng môi trường tương đương, mẫu cố định lugol để đếm số lượng tế bào 228 Năm học 2009 – 2010 Mỗi nghiệm thức lặp lại hai lần, thời gian tiến hành thí nghiệm từ tháng 11/ 2009 đến tháng 1/2010, phịng thí nghiệm Sinh lý thực vật, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh Các bảng biểu đồ vẽ phần mềm Microsolf Excel 2003 Các số liệu thực nghiệm xử lý phần mềm SPSS phiên 11.5 Kết 4.1 Khảo sát sinh trưởng Thalassiosira sp môi trường NBNT Hình thái tế bào Từ ngày thứ hai, tế bào bắt đầu kết chuỗi đến ngày thứ tư chuỗi dài, tế bào to thể sắc tố chiếm thể tích tế bào nhiều Sang ngày thứ sáu, tế bào tồn dạng đơn lẻ, số bị vỡ thể sắc tố thoát ngồi (hình1) N2 20μm N4 20μm N6 20μm Hình 1: Hình thái tế bào Thalassiosia sp qua số ngày môi trường NBNT (x40) (N2: ngày thứ hai, N4: ngày thứ tư, N6: ngày thứ sáu) Đường cong tăng trưởng Đường cong tăng trưởng xác định qua việc đếm số lượng tế bào ngày Nhìn chung, đường cong tăng trưởng Thalassiosira sp môi trường NBNT có dạng hình chữ S Pha tiềm phát kéo dài khoảng ba ngày đầu Pha tăng trưởng mạnh kéo dài ba ngày từ ngày thứ tư đến ngày thứ sáu Pha cân diễn khoảng hai ngày thứ bảy tám Sau đó, quần thể nhanh chóng bước vào pha suy vong từ ngày thứ chín, số lượng tế bào suy giảm nhanh chóng (hình 1) Tốc độ tăng trưởng Tốc độ tăng trưởng Thalassiosira sp tăng cao ngày 2-3 ngày 45, sau giảm dần, từ ngày 8-9 tốc độ tăng trưởng đạt giá trị âm (hình 2) 229 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH Mật độ tế bào (10000tb/ml) 70 60 50 40 30 20 10 N0 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 Thời gian tăng trưởng (ngày) NBNT Hình 2: Đường cong tăng trưởng Thalassiosira sp môi trường NBNT 4.2 Ảnh hưởng IAA lên tăng trưởng Thalassiosira sp môi trường NBNT Hình thái tế bào IAA nồng độ 10-8 g/ml, 10 -9 g/ml, 10-10 g/ml có tác dụng gia tăng khả kết chuỗi, trì trạng thái chuỗi, hình thái tế bào to, thể sắc tố đẹp qua nhiều ngày, với nồng độ IAA 10-10 g/ml (hình1, hình 3) N2 20μm 20μm N4 20μm N6 A B 20μm 20μm 20μm 20μm 20μm 20μm C Hình 3: Hình thái tế bào Thalassiosia sp qua số ngày môi trường NBNT bổ sung IAA nồng độ khác (x40) 230 Năm học 2009 – 2010 (Trong hàng, thứ tự hình từ trái qua: A: NBNT + IAA 10-10 g/ml, B: NBNT +IAA 10-9 g/ml, C: NBNT +IAA 10-8 g/ml Trong cột, thứ tự hình từ xuống: N2: ngày thứ hai, N4: ngày thứ tư, N6: ngày thứ sáu) Trong bốn môi trường, vào ngày thứ hai, chuỗi tế bào bắt đầu hình thành; đến ngày thứ tư, số chuỗi số tế bào chuỗi nhiều, tế bào to thể sắc tố đậm (hình 1-N2, N4; hình 3-N2, N4), đặc biệt mơi trường NBNT+IAA10-10 g/ml (hình 3-N4-A) (10000 tb/ml) Mật độtế bào Từ ngày thứ sáu, tế bào tách chuỗi dần, kích thước tế bào giảm Tuy nhiên, môi trường NBNT bổ sung IAA, có số tế bào hình thành nên có kích thước lớn so với tế bào cũ (hình 3-N6-B,C) Riêng với mơi trường NBNT, từ ngày thứ sáu số tế bào bị vỡ, thể sắc tố ngồi (hình 1-N4) Đường cong tăng trưởng Trong ba mơi trường NBNT có bổ sung IAA mật độ tế bào tăng cao đồng thời thời gian tăng trưởng dài so với môi trường NBNT Môi trường NBNT bổ sung IAA 10-8 g/ml mật độ tế bào đạt cực đại, nhiên xét đường cong tăng trưởng mơi trường NBNT bổ sung IAA 10-10 g/ml mật độ tế bào mức cao ổn định (hình 4) 180 160 140 120 100 80 60 40 20 N0 D0 N1 N8 D8 N9 D9 N10D10 D1 N2 D2 N3 D3 N4 D4 N5D5N6D6N7D7 Thời gian tăng trưởng (ngày) NBNT NBNT+IAA 10E-10 NBNT+IAA 10-10g/ml -9 NBNT+IAA 10E-9 NBNT+IAA10 g/ml -8 NBNT+IAA 10E-8 NBNT+IAA10 g/ml Hình 4: Đường cong tăng trưởng Thalassiosira sp môi trường NBNT bổ sung IAA nồng độ khác Tốc độ tăng trưởng Sự gia tăng tốc độ tăng độ tăng trưởng ba môi trường NBNT bổ sung IAA diễn nhanh so với chuẩn, ngày 1-2 3-4 mơi trường có IAA so với ngày 2-3 4-5 chuẩn Sự khác biệt thể ngày 8-9 tốc độ tăng trưởng quần thể đối chứng giảm ba môi trường bổ sung IAA, tốc độ tăng trưởng tăng (hình 5) 231 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH Tốc độ tăng trưởng/ngày 1.5 1.0 0.5 0.0 N0 -1 -0.5 N1 -2 -1.0 N2 -3 N3 -4 N4 -5 N5 -6 N6 -7 N7 -8 N8 -9 N9 -1 Thời gian tăng trưởng (ngày) NBNT -10 NBNT+IAA10 10EE NBNT+IAA g/ml -9 NBNT+IAA10 9EEE NBNT+IAA g/ml -8 NBNT+IAA 8EE NBNT+IAA10 g/ml Hình 5: Tốc độ tăng trưởng hàng ngày Thalassiosira sp môi trường NBNT bổ sung IAA nồng độ khác 4.3 Ảnh hưởng BA lên tăng trưởng Thalassiosira sp mơi trường NBNT Hình thái tế bào Nhìn chung, ba nồng độ BA 10-10 g/ml, 10-9 g/ml 10-8 g/ml có tác dụng kích thích hình thành trì chuỗi tế bào, tế bào phát triển lớn thể sắc tố to so với môi trường NBNT, nồng độ BA 10 -10 g/ml (hình 6) N2 20μm 20μm N4 20μm 20μm 20μm 20μm N6 20μm 20μm 20μm A B C Hình 6: Hình thái tế bào Thalassiosia sp qua số ngày môi trường NBNT bổ sung BA nồng độ khác (x40) 232 Năm học 2009 – 2010 (Trong hàng, thứ tự hình từ trái qua: A- NBNT + BA 10 -10 g/ml, BNBNT +BA 10-9 g/ml, C- NBNT +BA 10 -8 g/ml Trong cột, thứ tự hình từ xuống: N2-ngày thứ hai, N4-ngày thứ tư, N6-ngày thứ sáu) Từ ngày thứ hai, ba môi trường bổ sung BA, tế bào bắt đầu kết chuỗi; đến ngày thứ tư chuỗi dài, tế bào to thể sắc tố chiếm nhiều thể tích tế bào Qua ngày thứ sáu, tế bào tách chuỗi dần, thể sắc tố phân mảnh Đường cong tăng trưởng (10000 tb/ml) Mật độ tế bào Mật độ tế bào ba môi trường NBNT bổ sung BA cao có nhiều khác biệt với môi trường chuẩn Cả ba nồng độ BA 10 -10g/ml, 10 -9g/ml, 108 g/ml có tác dụng kích thích tăng trưởng số lượng tế bào so với môi trường NBNT Nhưng ba nồng độ chưa có khoảng cách đủ nhiều để tạo khác biệt riêng cho (hình 7) 160 140 120 100 80 60 40 20 N0 NBNT N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 Thời gian tăng trưởng (ngày) NBNT+BA10EE NBNT+BA 10-10g/ml -9 NBNT+BA9EE NBNT+BA10 g/ml N8 N9 -8 NBNT+BA8EE NBNT+BA10 g/ml Hình 7: Đường cong tăng trưởng Thalassiosira sp môi trường NBNT bổ sung BA nồng độ khác Tốc độ tăng trưởng Tốc độ tăng trưởng ba môi trường NBNT bổ sung BA cao ngày 0-1 cao chuẩn, sau lại có xu hướng giảm dần vào ngày sau (hình 8), điều giải thích ngày đầu tiên, nguồn dinh dưỡng môi trường dồi tác dụng BA nên tế bào tăng trưởng nhanh Với hai môi trường NBNT bổ sung BA nồng độ 10-9g/ml NBNT+BA108 g/ml, tốc độ tăng trưởng ổn định so với hai mơi trường cịn lại Ở mơi trường NBNT+ BA10-10g/ml có thêm đợt tăng tốc độ tăng trưởng vào ngày 3-4 (hình 8) 233 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH Vậy, ba nồng độ BA thí nghiệm, nồng độ BA10-10g/ml ảnh hưởng nhiều đến tốc độ tăng trưởng quần thể Thalassiosira sp môi trường NBNT Tốc độ tăng trưởng/ ngày 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 N0 -1 -1.0 NBNT N1 -2 N2 -3 N3 -4 N4 -5 N5 -6 N6 -7 N7 -8 N8 -9 Thời gian tăng trưởng (ngày) -10 NBNT+BA10 NBNT+BA10 g/ml NBNT+BA9-9 g/ml NBNT+BA10 NBNT+BA8-8 g/ml NBNT+BA10 Hình 8: Tốc độ tăng trưởng hàng ngày Thalassiosira sp môi trường NBNT bổ sung BA nồng độ khác Kết luận đề nghị 5.1 Kết luận Tóm lại, Thalassiosira sp., hai hormon IAA BA có tác dụng làm tăng khả kết chuỗi, trì chuỗi lâu, tăng kích thước tế bào, thể sắc tố to có màu đẹp Ngồi ra, IAA cịn có khả kéo dài thời gian tăng trưởng tế bào Và ba nồng độ thí nghiệm, nồng đồ 10-10g/ml có ảnh hưởng tốt đến sinh trưởng Đối với BA, số lượng tốc độ tăng trưởng tế bào tương đương nồng độ khác Riêng BA nồng độ 10 -10g/ml, hình thái tế bào có phần đẹp 5.2 Đề nghị Trong thời gian tới có điều kiện, chúng tơi tiếp tục khảo sát: Ảnh hưởng IAA BA kết hợp Hàm lượng diệp lục tố IAA, BA tác động riêng rẽ kết hợp 234 Năm học 2009 – 2010 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Trương Ngọc An (1993), Phân loại tảo Silic phù du biển Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Hoài Hà (2006), http://vietsciences2.free.fr [3] Nguyễn Tấn Đại (2007), Khảo sát ảnh hưởng số điều kiện ni trồng tăng trưởng số lồi tảo Silic thuỷ vực ven bờ biển Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh, Luận văn thạc sĩ - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [4] Guillard GRL, Sieracki MS., (2005), “Counting cells in cultures with the light microscope”, In: Andersen RA (ed.) Algal culturing techniques Amsterdam: Elsevier Academic Press, p 239-252.Amsterdam: Elsevier Academic Press, p 269-285 [5] Harrison P.J., Water R.E., Taylor F.J.R (1980), “Abroad spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton.J”, Phycol 16:28-35 [6] Lê Thị Phương Hồng, Bùi Trang Việt, Phạm Thành Hổ (1997), “Sự diện vai trò chất điều hoà tăng trưởng thực vật tảo lam Spirulina platensis”, Tập san Khoa học Kỹ thuật Nông lâm nghiệp, Trường Đại học Nơng lâm TP Hồ Chí Minh, số tháng [7] Đặng Đình Kim, Đặng Hồng Phước Hiền (1999), Công nghệ sinh học vi tảo, NXB Nông nghiệp Hà Nội [8] Mazur H, Konop A, Synak R (2001), "Indole-3-acetic acid in the culture medium of two axenic green microalge” Journal of Applied Phycology, 13: 35-42 [9] Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, (Phần II- Phát Triển), NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [10] Wood AM, Everroad RC, Wingard LM (2005), “Measuring growth rates in microalgal cultures” In: Andersen RA (ed.), Algal culturing techniques 235 ... tăng trưởng Mật độ tế bào hai thời điểm khác trình tăng trưởng mẫu dùng để tính tốc độ tăng trưởng khoảng thời gian [9] Khảo sát ảnh hưởng IAA BA riêng rẽ Theo dõi tăng trưởng vi tảo mơi trường. ..Kỷ yếu Hội nghị sinh vi? ?n NCKH 3.2 Phương pháp Môi trường nuôi cấy Môi trường nước biển nhân tạo, độ mặn 3%, pH 8,2 (Harrison, 1980) Lấy mẫu cấy chuyền... tăng trưởng (ngày) NBNT Hình 2: Đường cong tăng trưởng Thalassiosira sp môi trường NBNT 4.2 Ảnh hưởng IAA lên tăng trưởng Thalassiosira sp mơi trường NBNT Hình thái tế bào IAA nồng độ 10-8 g/ml,