Phân lập chủng nấm sợi có hoạt tính chitinase và tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy

Mục đích đề tài là tìm ra các chủng nấm có hoạt tính chitinase mạnh và tối ưu các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase của chủng nấm sợi phân lập được. Đề tài được thực hiện từ tháng 9 năm 2010 đến tháng 4 năm 2011 tại phòng thí nghiệm Vi sinh - Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh (TP HCM).

Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH PHÂN LẬP CHỦNG NẤM SỢI CĨ HOẠT TÍNH CHITINASE VÀ TỐI ƯU HĨA CÁC ĐIỀU KIỆN NI CẤY Lê Đình Hưng (SV năm 4, Khoa Sinh học) GVHD: TS Trần Thanh Thủy, CN Trần Thị Minh Định Mở đầu Hằng năm, lượng lớn nơng sản bị thất bệnh gây vi nấm kí sinh Việc phịng chống nấm gây bệnh trồng vấn đề nhà khoa học quan tâm Một giải pháp sinh học có hiệu cao an toàn sử dụng chitinase để phân giải chitin thành tế bào nấm Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase) Chitinase thuỷ phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác thủy giải liên kết 1,4-glucoside C1 C4 hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp Các cấu trúc mạch ngắn chitin N-acetyl glucosamine không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol Do chitinase vừa enzyme cấu trúc, vừa enzyme cảm ứng nên môi trường (MT) nuôi cấy nấm sợi (NS) sinh chitinase cần có nguồn chitin chất cảm ứng nguồn carbon nhằm tăng khả sinh tổng hợp chitinase Chitinase cịn có nhiều ứng dụng thực tế thu nhận tế bào trần vách tế bào nấm có chứa chitin, sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine N-acetyl glucosamine dùng làm dược phẩm với tính ưu việt kháng khối u, trị viêm khớp Chitinase dùng ước tính sinh khối nấm, kiểm soát muỗi, sản xuất protein đơn bào Vì chitinase enzyme ngoại bào có tầm quan trọng cao cần nghiên cứu rộng rãi, nên tiến hành thực đề tài: “Phân lập chủng nấm sợi có hoạt tính chitinase tối ưu hóa điều kiện ni cấy” Mục đích đề tài tìm chủng nấm có hoạt tính chitinase mạnh tối ưu điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase chủng nấm sợi phân lập Đề tài thực từ tháng năm 2010 đến tháng năm 2011 phịng thí nghiệm Vi sinh - Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh (TP HCM) Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Mẫu phế thải hải sản thu Công ty cổ phần xuất nhập Thủy sản Hợp Tấn, lô 19, đường số 8, khu công nghiệp Tân Tạo, quận Bình Tân, TP HCM huyện Phước Tĩnh, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu 76 Năm học 2010 – 2011 Các loại môi trường: - MT 1: 10g chitin huyền phù; 0,5g peptone; 0,5g cao nấm men; 1g glucose; 0,3g KH2PO4; 0,7g K2HPO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,01g FeSO4.7H2O; 0,001g ZnSO4; 1000ml nước cất [8] - MT 2: 10g chitin huyền phù; 0,5g peptone; 0,3g urea; 0,2g KH2PO4; 0,3g CaCl2; 0,2g Tween 80; 1,4g (NH4)2SO4; 0,3g MgSO4.7H2O; 1000ml nước cất [7] - MT 3: 5g chitin huyền phù; 0,2g MgSO4.7H2O; 0,9g K2HPO4; 0,2g KCl; 1g NH4NO3; 0,002g FeSO4.7H2O; 0,002g MnSO4; 0,002g ZnSO4; pha 1000ml đệm phosphate 50mM [9] - MT 4: 10g chitin huyền phù; 3,5g NaNO3; 1,5g K2HPO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,5g KCl; 0,01g FeSO4.7H2O; 1000ml nước cất [5] - MT 5: Malt Extract Agar (MEA) [6] 2.2 Phương pháp - Phân lập số chủng NS có hoạt tính chitinase (F Uyenco, 1988), - Khảo sát hoạt tính enzyme chitinase phương pháp đục lỗ (Stephen, 2000), - Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại nấm sợi [2], - Tối ưu hóa qui hoạch thực nghiệm [3], - Bước đầu thu nhận enzyme thô dung môi [4] Kết bàn luận 3.1 Phân lập, tuyển chọn số chủng NS có hoạt tính chitinase Bảng Kết phân lập, tuyển chọn số chủng NS có hoạt tính chitinase Stt Ký hiệu chủng Hoạt tính enzyme, D- d (cm) B1 3,275 B2 1,200 B3 2,000 B4 2,200 B5 2,150 B6 3,000 B7 2,225 Từ mẫu (mai ghẹ) thu TP HCM tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, phân lập chủng NS có hoạt tính chitinase (tạm gọi kiểu khuẩn lạc (KL) chủng) Chúng chọn chủng nấm B1 để tiếp tục nghiên cứu chủng nấm có hoạt tính chitinase cao 3.2 Định danh đến chi chủng nấm sợi B1 77 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH Nuôi cấy chủng nấm sợi B1 đĩa petri có MT 5, quan sát đặc điểm đại thể chủng B1 Tiến hành làm phòng ẩm, cấy chủng B1 vào phịng ẩm, quan sát hình thái vi thể chủng B1 kính hiển vi So sánh đặc điểm quan sát với khóa phân loại Bùi Xuân Đồng [3] A Samson [10] Kết ghi nhận bảng Bảng Kết định danh chủng B1 đến chi Đặc điểm chủng nấm sợi B1 Đặc điểm phân loại chi Aspergillus theo [3] [10] - KL phát triển nhanh.KLban đầu có - KLthường phát triển nhanh, có màu trắng, màu trắng, sau chuyển thành màu xanh vàng, vàng nâu, nâu đen có màu lục - Hệ sợi nấm gồm sợi ngăn vách, phân lục đậm dần theo thời gian - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, nhánh, không màu, màu nhạt sẫm màu khơng màu - Bào tử đính Giá bào tử khơng phân - Giá bào tử trần khơng có nhánh, có phần đỉnh nhánh, có phần đỉnh phình to tạo to thành bọng hình chùy, hình elipse thành bọng hình nửa cầu - Khối bào tử trần đính bên ngồi thể - Khối bào tử trần đính bọng có dạng bọng hình cột, hình cầu hình tia tỏa trịn Từ kết định danh chúng tơi kết luận chủng nấm B1thuộc chiAspergillus Hình Hình thái đại thể chủng B1 Hình Hình thái vi thể chủng B1 3.3 Ảnh hưởng MT ni cấy đến hoạt tính chitinase chủng Aspergillus sp B1 Ni chủng Aspergillus sp.B1 bình tam giác 250 ml chứa 50 ml MT1, MT2, MT3, MT4 Sau ngày nuôi cấy lắc, tiến hành xác định hoạt tính chitinase phương pháp đục lỗ, kết thể qua biểu đồ 78 D - d (cm) Năm học 2010 – 2011 3.5 2.5 1.5 0.5 3.55 3.05 2.85 2.4 MT MT MT MT Môi trường Biểu đồ Ảnh hưởng MT nuôi cấy đến hoạt tính chitinase chủng Aspergillus sp B1 Qua biểu đồ, ta thấy MT hoạt tính chitinase mức khá, MT hoạt tính chitinase mức mạnh, MT hoạt tính chitinase mạnh Điều cho thấy Aspergillus sp.B1 có tính thích nghi cao MT cho hoạt tính mạnh có hàm lượng khống cao MT MT 4, có hàm lượng chitin huyền phù cao MT Hình Hoạt tính chitinase chủng Aspergillus sp B1 MT khác (từ trái sang: MT1, MT2, MT3, MT4) 3.4 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính chitinase chủng Aspergillus sp B1 Ni chủng Aspergillus sp.B1 bình tam giác 250 ml chứa 50 ml MT1 Thử hoạt tính chitinase phương pháp đục lỗ sau 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h, 96h, kết thể qua đồ thị 3.267 3.500 3.000 2.950 84h 96h D - d (cm) 3.000 2.233 2.500 1.800 2.000 1.500 1.267 1.233 24h 36h 1.000 0.500 48h 60h 72h Thời gian Đồ thị Ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính chitinase chủng Aspergillus sp.B1 Kết cho thấy, hoạt tính chitinase Aspergillus sp.B1 cao vào lúc 72h Giai đoạn đầu hoạt tính chitinase chưa ổn định tế bào nấm phải thích nghi với MT, sau thích nghi q trình trao đổi chất diễn mạnh mẽ, chitinase tổng hợp nhiều để phân giải chitin, cung cấp nguồn carbon cho tế bào Kết thống với nghiên cứu Lê Thị Huệ [5] 79 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH 3.5 Ảnh hưởng nồng độ chitin huyền phù MT ni cấy đến hoạt tính chitinase chủng Aspergillus sp.B1 Nuôi chủng Aspergillus sp.B1 bình tam giác 250 ml chứa 50 ml MT 1, thay đổi nồng độ chitin huyền phù giá trị 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5%; 3,0% Sau 72h, thử hoạt tính chitinase phương pháp đục lỗ, kết thể qua đồ thị 3.8 D - d (cm) 3.7 3.7 3.65 3.6 3.65 3.6 3.45 3.5 3.4 3.4 3.3 3.2 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Nồng độ chitin huyền phù (%) Đồ thị Sự biến thiên hoạt tính chitinase theo nồng độ chitin huyền phù Nồng độ chitin huyền phù thích hợp cho phát triển Aspergillus sp.B1 khoảng từ 1% đến 2%, đạt cực đại nồng độ 1,5% Kết phù hợp với nghiên cứu Felse Panda, 2000 Khi nồng độ chitin huyền phù lớn 2%, hoạt tính chitinase giảm rõ rệt, điều lượng chitin huyền phù cao giảm tiếp xúc nấm với khơng khí, làm giảm lượng oxygen cần thiết cho hoạt động sống lồi hơ hấp hiếu khí Aspergillus sp.B1 3.6 Ảnh hưởng pHlên hoạt tính chitinase chủng Aspergillus sp.B1 Ni chủng Aspergillus sp B1trong bình tam giác 250 ml chứa 50 ml MT 1, nồng độ chitin huyền phù 1,5%, thay đổi pH MT giá trị 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 Sau 72h, thử hoạt tính chitinase phương pháp đục lỗ, kết thể qua đồ thị 3.78 3.9 3.65 3.65 3.6 3.55 3.75 D - d (cm) 3.5 2.95 1.4 1.65 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 pH Đồ thị Ảnh hưởng pH lên hoạt tính chitinase chủng Aspergillus sp B1 80 pH tối ưu cho trình sinh tổng hợp chitinase Aspergillus sp.B1 6, điều phù hợp với kết nghiên cứu Takashi cộng sự, 2002 Năm học 2010 – 2011 Hình Hoạt tính chitinase chủng Aspergillus sp B1ở pH= Hình Hoạt tính chitinase chủng Aspergillus sp B1ở pH= 3.7 Ảnh hưởng nguồn nitrogen lên hoạt tính chitinase chủng Aspergillus sp.B1 Ni cấy chủng Aspergillus sp.B1 MT nồng độ chitin huyền phù 1,5%, pH= 6, thay đổi nguồn nitrogen MT urea, cao nấm men, NH4Cl, peptone, cao thịt, KNO3, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, NaNO2, NaNO3, NH4NO3 Sau thời gian tối ưu, thử hoạt tính chitinase phương pháp đục lỗ, kết thể qua biểu đồ 1.100 Ammonium nitrate 3.300 Sodium nitrate 3.600 Sodium nitrite 2.550 Ammonium hydrogen phosphate 0.950 Ammonium sulfate 3.350 Nguồn nitrogen Potassium nitrate 3.775 Cao thịt 3.775 Peptone 1.650 Ammonium chloride 3.775 Cao nấm men 3.725 Urea - 1.0 2.0 3.0 4.0 D - d (cm) Biểu đồ Sự biến thiên hoạt tính chitinase theo nguồn nitrogen khác Qua biểu đồ 2, ta thấy chủng Aspergillus sp.B1 sinh tổng hợp chitinase tốt với nguồn nitrogen hữu urea, cao nấm men, peptone, cao thịt với nguồn nitrogen vơ 3.8 Tối ưu hóa mơi trường ni cấy qui hoạch tốn học Phương pháp tối ưu hóa qui hoạch tốn học phương pháp ưu việt với khả khảo sát nhiểu yếu tố tính xác cao Chúng tơi chọn yếu tố để tối ưu hóa qui hoạch thực nghiệm thời gian, nồng độ chitin huyền phù pH mơi trường Tiến hành 27 thí nghiệm theo ma trận thực nghiệm 81 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH Chọn mức (-), (0), (+) theo thí nghiệm khảo sát rời rạc với mức (0) giá trị tối ưu, mức (-) cận tối ưu, mức (+) cận tối ưu Xây dựng hàm mục tiêu theo công thức sau Khảo sát kết ma trận thực nghiệm chọn ymax ymin Chọn 0,63 giá trị tùy chọn cho dmax, 0,2 giá trị tùy chọn cho dmin thang mong đợi Ta có hệ phương trình Giải hệ phương trình ta bo b1 Từ ta tính y’ theo công thức: Thế y’ vào hàm mục tiêu, ta tính xác suất đặc trưng cho hoạt tính chitinase chủng nấm sợi (D) Xác định điều kiện thí nghiệm Dmax, kết luận điều kiện thí nghiệm trình tối ưu thực nghiệm Bảng Kết khảo sát biến thiên hoạt tính chitinase qui hoạch thực nghiệm Nồng độ chitin Thời Kết STT pH y’ D huyền phù (%) gian (h) ∆d (y) 1 (-) 5,5 (-) 66 (-) 3,2 -0,0848 0,3367 (-) 6,0 (0) 66 (-) 3,25 -0,4475 0,20921 (-) 6,5 (+) 66 (-) 2,95 -0,28505 0,26452 1,5 (0) 5,5 (-) 66 (-) 3,05 -0,20495 0,29303 1,5 (0) 6,0 (0) 66 (-) 3,05 -0,20495 0,29303 1,5 (0) 6,5 (+) 66 (-) 3,1 -0,1649 0,3075 (+) 5,5 (-) 66 (-) 3,05 -0,20495 0,29303 (+) 6,0 (0) 66 (-) 2,95 -0,28505 0,26452 (+) 6,5 (+) 66 (-) 2,95 -0,28505 0,26452 10 (-) 5,5 (-) 72 (0) 2,867 -0,351533 0,24141 11 (-) 6,0 (0) 72 (0) 2,9 -0,3251 0,25053 12 (-) 6,5 (+) 72 (0) 3,183 -0,098417 0,33173 13 1,5 (0) 5,5 (-) 72 (0) 2,983 -0,258617 0,27386 14 1,5 (0) 6,0 (0) 72 (0) 3,067 -0,191333 0,29794 15 1,5 (0) 6,5 (+) 72 (0) 2,983 -0,258617 0,27386 16 (+) 5,5 (-) 72 (0) 2,983 -0,258617 0,27386 82 Năm học 2010 – 2011 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 (+) (+) (-) (-) (-) 1,5 (0) 1,5 (0) 1,5 (0) (+) (+) (+) 6,0 (0) 6,5 (+) 5,5 (-) 6,0 (0) 6,5 (+) 5,5 (-) 6,0 (0) 6,5 (+) 5,5 (-) 6,0 (0) 6,5 (+) 72 (0) 72 (0) 78 (+) 78 (+) 78 (+) 78 (+) 78 (+) 78 (+) 78 (+) 78 (+) 78 (+) 2,983 2,95 3,05 2,983 3,033 2,867 3,116 3,126 3,067 3,033 3,25 -0,258617 -0,258617 -0,20495 -0,258617 -0,218567 -0,351533 -0,152084 -0,144074 -0,191333 -0,218567 -0,4475 0,27386 0,26452 0,29303 0,27386 0,288145 0,24141 0,31215 0,31507 0,29794 0,288145 0,20921 Theo kết trên, nghiệm thức (nồng độ chitin 1%, pH 5,5, thời gian nuôi cấy 66h) tối ưu để nuôi cấy chủng nấm sợi Aspergillus sp B1 Kết khảo sát yếu tố tối ưu rời rạc tối ưu theo qui hoạch có sai khác nhỏ, phương pháp tối ưu tốn học phương pháp cho kết đáng tin cậy nên chọn điều kiện nồng độ chitin, thời gian ni cấy pH theo tối ưu qui hoạch tốn học Kết hợp với kết tối ưu rời rạc yếu tố khác, điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng Aspergillus sp B1 sau: 10g chitin huyền phù; 0,5g peptone; 0,5g cao nấm men; 1g glucose; 0,3g KH2PO4; 0,7g K2HPO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,01g FeSO4.7H2O; 0,001g ZnSO4; 1000ml nước cất; pH= 5,5 Thời gian nuôi cấy 66h 3.9 Kết khảo sát dung môi tối ưu để thu chế phẩm enzyme Nuôi chủng Aspergillus sp.B1 MT tối ưu khảo sát, thu dịch chiết enzyme, tủa 50ml dịch chiết enzyme cồn, acetone, (NH4)2SO4 Cân khối lượng chế phẩm enzyme thu được, từ xác định loại tỷ lệ dung mơi tối ưu Kết trình bày bảng Bảng Kết khảo sát dung môi dùng để tủa dịch chiết enzyme Dung môi Cồn Acetone (NH4)2SO4 70% 80% Tỉ lệ 1:2 1:3 1:4 1:2 1:3 1:4 bão hòa bão hòa Khối lượng 0,06g 0,02g 0,02g 0,02g 0,02g 0,02g 0,66g 0,72g enzyme Chúng nhận thấy tủa (NH4)2SO4 thu khối lượng enzyme thô nhiều enzyme thô lẫn nhiều tinh thể muối (NH4)2SO4 Tủa acetone thu khối lượng enzyme thơ thấp Từ chúng tơi chọn tác nhân tủa cồn với tỉ lệ 1:2 Kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận - Đã phân lập chủng có hoạt tính chitinase mạnh, D - d= 3,275cm 83 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH - Kết định danh chủng thuộc chi Aspergillus - Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu sau: 10 g chitin huyền phù; 0,5g peptone; 0,5g cao nấm men; 1g glucose; 0,3g KH2PO4; 0,7g K2HPO4; 0,5g MgSO4.7H2O; 0,01g FeSO4.7H2O; 0,001g ZnSO4; 1000ml nước cất; pH= 5,5 Thời gian 66h - Đã xác định dung môi để tủa chế phẩm enzyme cồn với tỉ lệ dịch chiết enzyme: cồn 4.2 Kiến nghị Tiếp tục khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động chitinase từ chủng NS nghiên cứu để tìm hướng ứng dụng TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Cảnh (2004), Quy hoạch thực nghiệm, Nxb Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Bùi Xuân Đồng (2004), Ngun lí phịng chống nấm mốc mycotoxin, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hồng Đình Hịa (1980), “Bàn chất lượng sản phẩm thực phẩm phương pháp tối ưu hóa”, Báo Lương thực thực phẩm, 112 Đinh Minh Hiệp, Phạm Nguyễn Thanh Thảo, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương (2008), “Thu nhận chitinase từ chủng Trichoderma TĐ14 khảo sát khả kháng vi nấm Candida albicans”, Kỷ yếu Hội nghị khoa học tồn quốc lần thứ Hóa sinh sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học công nghiệp thực phẩm, Nxb Khoa học Kỹ thuật, tr 48 - 51 Lê Thị Huệ (2010), Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase số chủng NS thuộc giống Aspergillus, Trichoderma ứng dụng, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Sư phạm TP HCM Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nxb Giáo dục A M Murad and others, “Proteomic analysis of Metarhizium anisopliae secretion in the presence of the insect pest Callosobruchus maculatus”, Microbiology (2008), 154, pp 3766 - 3774 Guoqing Xia, Chunsheng Jin, Ju Zhou, Shoujun Yang, Shuzheng Zhang, Cheng Jin (2001), “A novel chitinase having a unique mode of action from Aspergillus fumigatus YJ407”, Eur J Biochem 268, pp 4079 - 4085 M H El- Katatny, W Somitsch, K- H Robra, M S El- Katatny, G M Gubitz (2000), “Production of Chitinase and β-1,3-glucanase by Trichoderma harzianum for Control of the Phytopathogenic Fungus Sclerotium rolfsii”, Food technol Biotechnol 38 (3), pp 173 - 180 10 Robert A Samson (1996), Introduction to food-borne fungi, Centraalbureau Voor Schimmelcultures, pp 52 - 54 84 ... lập chủng NS có hoạt tính chitinase (tạm gọi kiểu khuẩn lạc (KL) chủng) Chúng chọn chủng nấm B1 để tiếp tục nghiên cứu chủng nấm có hoạt tính chitinase cao 3.2 Định danh đến chi chủng nấm sợi. .. pH 5,5, thời gian nuôi cấy 66h) tối ưu để nuôi cấy chủng nấm sợi Aspergillus sp B1 Kết khảo sát yếu tố tối ưu rời rạc tối ưu theo qui hoạch có sai khác nhỏ, phương pháp tối ưu toán học phương... hưởng MT ni cấy đến hoạt tính chitinase chủng Aspergillus sp B1 Qua biểu đồ, ta thấy MT hoạt tính chitinase mức khá, cịn MT hoạt tính chitinase mức mạnh, MT hoạt tính chitinase mạnh Điều cho thấy