Đang tải... (xem toàn văn)
Trong đề tài này, mục tiêu nhắm tới là những kĩ thuật động lạnh trứng bò và heo theo phương pháp mới. Nội dung cụ thể như sau: Thu và tuyển chọn trứng bò từ nguồn trứng của bò bị giết mổ tại lò mổ, đánh giá và tuyển chọn trứng heo chín từ nguồn trứng đã được IVM (In Vtro Maturation), tiến hành đông lạnh trứng thu được bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt, đánh giá sự sống chết của trứng sau giải đông.
Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH THỬ NGHIỆM BẢO QUẢN TRỨNG BÒ VÀ HEO BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HĨA TRONG VI GIỌT (MICRODROP VITRIFICATION) Đỗ Hồng Hùng Sinh viên năm 3, Khoa Sinh học GVHD: ThS Nguyễn Thị Thương Huyền Mở đầu 1.1 Lý chọn đề tài Đông lạnh trứng chiến lược hấp dẫn cho bảo tồn sinh sản Công nghệ ngày ứng dụng nhiều y học, nông nghiệp nhiều lĩnh vực khác Các ngân hàng trứng người đông lạnh lập để hỗ trợ bệnh nhân nỗn Điều mang lại hi vọng cho nhiều cặp vợ chồng bị chứng vô sinh Trong lĩnh vực nông nghiệp, việc trao đổi, mua bán trứng đông lạnh loài gia súc ngày dễ, lồi có giá trị kinh tế cao Vì vậy, chủ động thời điểm thụ tinh ống nghiệm tạo phôi, chuyển phôi, chuyển gen…tạo giống vật ni có suất, chất lượng cao, góp phần lớn cải thiện nguồn gen Công nghệ đông lạnh trứng tỏ hiệu việc bảo tồn nguồn gen loài động vật quý hiếm, có nguy tuyệt chủng Ngồi ra, ngân hàng trứng đơng lạnh cịn nguồn cung cấp vật liệu cho nghiên cứu bản, tạo phôi để tách tế bào gốc… Tuy nhiên, nghiên cứu lĩnh vực đông lạnh trứng Việt Nam hạn chế Do vậy, việc nghiên cứu phát triển quy trình đơng lạnh trứng hiệu cần thiết Trên sở đó, tơi thực đề tài: “Thử nghiệm bảo quản trứng bò heo phương pháp thủy tinh hóa vi giọt” 1.2 Mục tiêu đề tài Trong đề tài này, mục tiêu nhắm tới kĩ thuật động lạnh trứng bò heo theo phương pháp Nội dung cụ thể sau: Thu tuyển chọn trứng bò từ nguồn trứng bò bị giết mổ lò mổ Đánh giá tuyển chọn trứng heo chín từ nguồn trứng IVM (In Vtro Maturation) 45 Năm học 2008 – 2009 Tiến hành đông lạnh trứng thu phương pháp thủy tinh hóa vi giọt Đánh giá sống chết trứng sau giải đông Tổng quan tài liệu 2.1 Sơ lược lịch sử nghiên cứu Những nghiên cứu đơng lạnh trứng mang tính chun sâu thực phát triển từ năm 1970 Các cơng trình nghiên cứu liên tục công bố Parkening cs (1976) đối tượng trứng chuột với tỷ lệ sống 18%; Papis cs (1999); Martin cs (2005) đối tượng trứng bò chưa trưởng thành sử dụng pp thủy tinh hóa với tỷ lệ sống 80% Trong nước, chưa có cơng trình nghiên cứu đơng lạnh trứng bị heo cơng bố 2.2 Đơng lạnh trứng (Cryopreservation of oocytes) Đông lạnh trứng bảo quản thành cơng chức sinh học bình thường trứng tiến hành giảm nhiệt độ từ nhiệt độ sinh lý (37 oC) xuống nhiệt độ không xảy phản ứng sinh lý (-196oC) Thủy tinh hóa (Vitrification) Kỹ thuật đông lạnh ứng dụng tượng đông đặc hoàn toàn dung dịch thực trình giảm nhiệt với tốc độ cực nhanh (2.000 – 30.000oC/phút) Khi đó, nước khơng có hình thành tinh thể đá mà hình thành dạng giống thủy tinh (glass - like), tế bào trứng tránh tổn thương tinh thể đá gây trình bảo quản Trong phương pháp này, trứng đặt cân chất bảo quản với thời gian ngắn trước làm lạnh nitơ lỏng Thời gian tiếp xúc với chất bảo quản cua trứng tùy thuộc vào nhiệt độ, tính thấm tế bào tính độc chất bảo quản Tế bào đặt dung dịch huyền phù chất bảo quản nồng độ cao nhiệt độ phịng Vì tác dụng gây độc chất bảo quản nên thời gian đặt trứng dung dịch cân ngắn Các biện pháp cải tiến phương pháp thủy tinh hóa thường trọng vào vào việc làm tăng tốc độ làm lạnh giải đơng, nhờ làm giảm ảnh hưởng độc tính chất bảo quản tổn thương lên tế bào 2.3 Vật liệu – Phương pháp 46 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH Trứng bò thu từ lò mổ mang phịng thí nghiệm tế bào gốc – Trường Đại học KHTN Tp HCM để tiến hành chọc-hút, thu nhận phân loại Sau đó, chọn trứng loại A B đem đơng lạnh Trứng heo ni chín (trứng trưởng thành) cung cấp Phịng thí nghiệm Tế bào gốc Trứng đánh giá chọn lọc, trứng có xuất thể cực thứ chọn cho đơng lạnh Hình : Cryotube chứa vi giọt đông lạnh Cả loại trứng sau đơng lạnh phương pháp thủy tinh hóa vi giọt (microdrop vitrification) Trứng cho vào môi trường VS1 với thành phần TCM-199 + 10% FBS + 20% EG 45 giây; VS2 với thành phần TCM-199 + 10% FBS + 40% EG +1M sucrose 25 giây Sau nhỏ trực tiếp vi giọt VS2 trứng vào nitơ lỏng Trứng sau đông lạnh giải đông cách đặt trứng vào môi trường RĐI (TCM 199 + 10% FBS + 0,25M sucrose) 1,5 phút; RĐII (TCM 199 + 10% FBS + 0,15M sucrose) 1,5 phút; RĐIII (TCM 199 + 10% FBS) phút Sau đem đánh giá dựa vào hình thái (đối với trứng bị) đánh giá hình dựa vào thái kết hợp nhuộm trypan blue (đối với trứng heo) Các số liệu nghiên cứu xử lý Excel 2003 độ tin cậy 95% 2.4 Kết 47 Năm học 2008 – 2009 2.4.1 Kết đông lạnh trứng bị chưa trưởng thành Tiến hành với lơ thí nghiệm, tổng số trứng đem đơng lạnh 477 Kết đông lạnh giải đông sau: Bảng Kết rã đơng trứng bị vi giọt Trứng Trứng thu Trứng sống sau sau rã đông rã đông đông lạnh n % n % 50 37 74,00 28 75,68 71 55 77,46 41 74,55 65 43 66,15 27 62,79 60 41 68,33 28 68,29 55 40 72,73 27 67,50 66 50 75,76 34 68,00 48 39 81,25 30 76,92 62 49 79,03 40 81,63 Tổng 477 354 255 Trung bình (%) 74,34 ± 5,13a 71,92 ± 6,23 a (a: độ lệch chuẩn với mức nghĩa α < 0,05) Đợt TN Tỷ lệ trứng sống Tỷ lệ trứng chết 28,08% 71,92% Biểu đồ Tỷ lệ trứng bò sống – chết sau rã đông phương pháp thủy tinh hóa vi giọt 48 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH Các trứng đánh giá sống hay chết dựa vào hình thái Trứng sống sau giải đông (255/354) đạt tỷ lệ 71,92% ± 6,23 Hình 2: Trứng sống (A) chết (B) sau rã đông (X10) 2.4.2 Kết đông lạnh trứng heo trưởng thành Sử dụng trứng qua ni chín có xuất thể cực Tiến hành đông lạnh giải đông theo quy trình Sau đợt thí nghiệm, tỷ lệ trứng sống sau giải đông 46,15 ± 15,91% (qua đánh giá hình thái) Kết nhộm, tỷ lệ trứng sống 26,07 ± 10,42% Kết cụ thể thống kê lại sau: Bảng Kết trứng heo thu sau đơng lạnh phương pháp thủy tinh hóa vi giọt Trứng Trứng sau giải đông Số lần TN đông lạnh n % 58 32 55,17 53 46 86,79 73 57 78,08 32 32 100,00 21 14 66,67 20 12 60,00 28 11 39,29 20 12 60,00 Tổng cộng 305 216 Trung bình 68,25 ± 19,26% 49 Năm học 2008 – 2009 Tỷ lệ thu nhận trứng heo sau giải đông Tỷ lệ trứng sau giải đông 31,75% 68,25% Biểu đồ Trứng heo thu trung bình sau giải đơng qua lần thí nghiệm Bảng Kết trứng sống chết sau q trình giải đơng qua lần TN Trứng sống mặt hình thái Trứng sống sau nhuộm n % n % 15 46,88 28,13 18 39,13 12 26,09 21 36,84 18 31,58 11 34,38 10 31,25 64,29 14,29 6 50,00 41,67 72,73 27,27 25,00 8,33 Tổng cộng 91 60 Trung bình 46,15 ± 15,91% 26,07 ± 10,42% Số lần TN 50 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH Trứng chết Trứng sống Hình Hình thái trứng sống chết (% ) Tỷ lệ trứng sống theo hình thái Trứng sống theo nhuộm 80 72,73 64,29 70 60 50 50 46,88 39,13 40 30 28,13 36,84 31,58 41,67 34,38 31,25 27,27 26,09 25 14,29 20 8,33 10 Đợt thí nghiệm Biểu đồ Tỷ lệ trứng heo sống sau giải đơng qua lần thí nghiệm 51 Năm học 2008 – 2009 (2) (1) Hình Trứng sống chết nhuộm trypan blue (X10) (1) Trứng chết bắt màu xanh thuốc nhuộm (2) Trứng sống không bắt màu xanh thuốc nhuộm Kết luận Các kết trứng đông lạnh thành công đề tài bước đầu cho thấy khả bảo quản trứng theo phương pháp thủy tinh hóa vi giọt đạt kết cao hẳn phương pháp khác Đây bước đầu cho nghiên cứu lĩnh vực đông lạnh trứng Cung cấp nguồn trứng cho việc thành lập ngân hàng trứng, ni chín trứng tiến hành thụ tinh theo phương pháp IVF (In Vitro Fertilization) hay ICSI (Intracytoplasmic sperm injection) để tạo phôi ống nghiệm, chuyển gen, khai thác tế bào gốc… 52 Kỷ yếu Hội nghị sinh viên NCKH TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Tường Anh Sinh học đại cương, đa dạng, sinh sản phát triển động vật NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [2] Phan Kin Ngọc, Phạm Văn Phúc (2006), Công nghệ sinh học động vật NXB Giáo dục [3] Andreas Mavrides, David Morroll (2002), Cryopreservation of bovine oocytes: is cryoloop vitrification the future to preserving the female gamete? © INRA, EDP Sciences Reprod Nutr Dev 42: 73–80 [4] Dong-Hoon Kim cs (2007), Vitrification of Immature Bovine Oocyte by The Microdrop Method Journal of Reproduction and Development, Vol.53, No.4 [5] B A Didion, D Pomp, M J Martin, G E Homanics and C l Markert (1990), Observations on the cooling and cryopreservation of pig oocytes at the germinal vesicle stage J Anim.Sci 68:2803-2810 [6] Steven Francis Mullen (2007), Advances In The Fundamental Cryobiology Of Mammalian Oocytes © Copyright by Steven Francis Mullen 2007 All Rights Reserved [7] R D Martins, E P Costa1, J S C Chagas1, F S Ignácio, C A A Torres, C McManus (2005), Effects of vitrification of immature bovine oocytes on in vitro maturation Anim Reprod., v.2, n.2, p.128-134 53 ... trứng đông lạnh thành công đề tài bước đầu cho thấy khả bảo quản trứng theo phương pháp thủy tinh hóa vi giọt đạt kết cao hẳn phương pháp khác Đây bước đầu cho nghiên cứu lĩnh vực đông lạnh trứng. .. lạnh Hình : Cryotube chứa vi giọt đông lạnh Cả loại trứng sau đơng lạnh phương pháp thủy tinh hóa vi giọt (microdrop vitrification) Trứng cho vào môi trường VS1 với thành phần TCM-199 + 10% FBS... 0,05) Đợt TN Tỷ lệ trứng sống Tỷ lệ trứng chết 28,08% 71,92% Biểu đồ Tỷ lệ trứng bò sống – chết sau rã đông phương pháp thủy tinh hóa vi giọt 48 Kỷ yếu Hội nghị sinh vi? ?n NCKH Các trứng đánh giá