NGHIÊN cứu THỰC TRẠNG NHIỄM sán lá GAN NHỎ và CHẾ tạo bộ KIT LAMP để CHẨN đoán NHIỄM sán lá GAN NHỎ tại NINH BÌNH và PHÚ yên, năm 2018 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG -* - PHẠM THỊ HÀ TRANG NGHIÊN CỨU THỰC TRẠNG NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ VÀ CHẾ TẠO BỘ KIT LAMP ĐỂ CHẨN ĐOÁN NHIỄM SÁN LÁ GAN NHỎ TẠI NINH BÌNH VÀ PHÚ YÊN, NĂM 2018-2021 CHUYÊN NGÀNH: DỊCH TỄ HỌC MÃ SỐ: 9720117 ĐỀ CƯƠNG DỰ TUYỂN NGHIÊN CỨU SINH HÀ NỘI – 2018 MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Sán gan nhỏ loài sán gây bệnh người với tỷ lệ nhiễm cao nhiều quốc gia vùng Đông Nam Châu Á Trung Quốc, Hàn Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào, Campuchia [1, 2] Người nhiễm sán gan nhỏ thường khơng có triệu chứng cấp tính rõ ràng, bị nhiễm mãn tính thường có số biểu lâm sàng đau bụng, đau thượng vị, mệt mỏi, vàng da, nôn, sốt nhẹ tiêu chảy [1] Tuy vậy, ảnh hưởng nghiêm trọng nhiễm sán gan nhỏ nguy gây ung thư gan cao, theo thống kê sán gan nhỏ xếp vào nhóm tác nhân sinh học số gây ung thư gan người [3] Có hai loài sán gan nhỏ thường gặp Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini Trong đó, lồi sán gan nhỏ C sinensis phân bố chủ yếu Trung Quốc, Hàn Quốc Việt Nam Sán gan nhỏ O viverrini tìm thấy chủ yếu Campuchia, Lào, Thái Lan Việt Nam [4] Tại Việt Nam phát hai loài sán gan nhỏ C sinensis O viverrini với hai vùng dịch tễ rõ rệt Loài C.sinensis lưu hành cao vùng đồng Bắc Theo thống kê Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương từ năm 1976 đến 2004, xác định bệnh sán gan nhỏ C sinensis lưu hành 15 tỉnh với tỷ lệ nhiễm trung bình 19%, số nơi có tỷ lệ nhiễm cao tới 37% Nam Định, Hồ Bình, Ninh Bình 20-30% Trong lồi sán gan nhỏ O viverrini lưu hành chủ yếu tỉnh phía Nam Phú n có tỷ lệ nhiễm 36,9%, Bình Định 11,9%, Đăk Lăk 7,6%, Đà Nẵng 0,3%, Quảng Nam 4,6%, Khánh Hoà 1,4% Đến nay, ghi nhận bệnh sán gan nhỏ lưu hành 32 tỉnh nước, tỷ lệ nhiễm sán gan nhỏ có khác điểm nghiên cứu [4, 5] Bệnh sán gan nhỏ chẩn đoán dựa vào số yếu tố dịch tễ, lâm sàng, xét nghiệm cận lâm sàng Hiện nay, xét nghiệm tìm trứng sán gan nhỏ trưởng thành phân dịch tá tràng xem tiêu chuẩn chẩn đoán “vàng” chẩn đoán xác định bệnh sán gan nhỏ [2] Phương pháp Kato-Katz WHO (1994) khuyến cáo sử dụng để xét nghiệm phân phát trứng giun sán vùng dịch tễ có tỷ lệ nhiễm giun ≥ 20%, lồi sán ≥ 10% Đây kỹ thuật phát trứng giun, sán gan nhỏ, sán ruột, sán dây, sán gan lớn phân, áp dụng thực địa Tuy nhiên, lượng trứng phân thấp nên phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng giun sán có độ nhạy khơng cao (chỉ khoảng 30%), độ đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm kỹ thuật viên, dễ nhầm lẫn trứng loài sán gan nhỏ với trứng sán ruột nhỏ [2] Phương pháp tập trung trứng ly tâm lắng cặn theo Esteban CS (1997) [6] ly tâm lắng cặn formalin–ether cải tiến phương pháp có độ xác cao, ngồi trứng giun sán cịn phát đơn bào thể kén, dễ dàng kiểm tra lại mẫu nghi ngờ mẫu phân bảo quản formalin 10% Tuy vậy, lượng trứng phân nên dễ bỏ sót bệnh nhân, khó áp dụng xét nghiệm thực địa [7], [2] Các xét nghiệm miễn dịch phản ứng kháng nguyên gián tiếp (Indirect hemagglutination test: IHA), phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (Indirect Fluorescent anlibody (IFA), phản ứng ELISA (enzyme-Linked immunosorbent assay) có độ nhạy cao, độ đặc hiệu tùy thuộc vào loại test cịn nhiều tranh luận có tượng dương tính kéo dài lai chéo lồi, khó triển khai thực địa [2, 8, 9] Chẩn đoán sinh học phân tử sử dụng gen đích ITS1, ITS2 ADN ty thể với kỹ thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán gan nhỏ O viverrini hay C sinensis cho độ nhạy độ đặc hiệu cao [10-12] Tuy chưa áp dụng rộng rãi giá thành cao khâu kỹ thuật phức tạp, không triển khai thực địa mà chủ yếu ứng dụng đánh giá hiệu lực thuốc điều trị, giám sát tái nhiễm hay phát vùng dịch tễ sán gan nhỏ khu vực Đông Nam Á [13] Để khắc phục giới hạn phương pháp PCR truyền thống Real time PCR chẩn đoán xác định mầm bệnh thực địa, nghiên cứu gần có xu hướng chuyển sang phương pháp khuếch đại ADN đẳng nhiệt với ưu điểm độ nhạy đặc hiệu tương đương kỹ thuật PCR loại bỏ bước luân nhiệt nên cần thiết bị xét nghiệm đơn giản, nhỏ gọn, thời gian xét nghiệm rút ngắn xuống 30 60 phút, đặc biệt kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt có khả phát triển thành kít phân tử cho phép ứng dụng thực địa [4, 14] Kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) nghiên cứu phát triển từ năm 1998 [15] Đây phương pháp nhân gen mới, tổng hợp đoạn ADN lớn mà khơng cần chu trình biến nhiệt Đặc điểm phương pháp sử dụng mồi khác thiết kế đặc biệt để nhận vùng riêng biệt gen đích phản ứng diễn nhiệt độ (650C) Thành phần phản ứng gồm có ADN khn, mồi, enzyme Bst DNA polymerase Những ưu điểm vượt trội công nghệ so với kỹ thuật sử dụng như: + Độ nhạy, độ đặc hiệu cao tương đương với phương pháp PCR + ADN làm khuôn khuếch đại khơng địi hỏi độ tinh cao, sử dụng phương pháp tách chiết đơn giản, tiết kiệm kinh phí, thời gian + Phát kết trực tiếp mắt thường sử dụng thuốc nhuộm que thử miễn dịch: Đơn giản, xác, tránh tạp nhiễm, tiết kiệm thời gian, kinh phí, khơng tiếp xúc với hóa chất độc hại giúp đảm bảo sức khỏe cho người thực + Thời gian xét nghiệm nhanh, xét nghiệm đồng thời nhiều mẫu + Thực thực địa, dễ chuyển giao kỹ thuật cho y tế tuyến sở + Hóa chất, vật tư để chế tạo kít phổ biến thị trường nên dễ mua, giá thành rẻ so với công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt khác RPA, NASBA + Chi phí cho xét nghiệm rẻ khơng địi hỏi đầu tư thiết bị đắt tiền so với phương pháp sinh học phân tử khác PCR, RT-qPCR Hoạt động phản ứng LAMP diễn điều kiện đẳng nhiệt (ví dụ 650C) Nhằm đánh giá thực trạng nhiễm sán gan nhỏ cộng đồng dân cư vùng dịch tễ sán gan nhỏ Ninh Bình Phú Yên chế tạo kít phân tử có độ nhạy, độ đặc hiệu cao để đáp ứng nhu cầu nâng cao chất lượng chẩn đoán bệnh sán gan nhỏ, thực đề tài Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán gan nhỏ chế tạo kit LAMP để chẩn đoán nhiễm sán gan nhỏ Ninh Bình Phú Yên, năm 2018-2021 với mục tiêu sau: Đánh giá thực trạng nhiễm sán gan nhỏ người số vùng dịch tễ tỉnh Ninh Bình Phú Yên Nghiên cứu chế tạo kít LAMP để chẩn đốn nhiễm sán gan nhỏ Clonorchis sinensis Opisthorchis viverrini nhiễm người Ứng dụng kít LAMP để phát tỉ lệ nhiễm sán gan nhỏ người tỉnh Ninh Bình Phú Yên Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương sán gan nhỏ Sán gan nhỏ lồi sán gây bệnh người Trên giới tìm thấy có lồi sán gan nhỏ Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini Opisthorchis felineus 1.1.1 Hình thể Sán trưởng thành Sán gan nhỏ C.sinensis có hình lá, thân dẹt, màu đỏ nhạt Sán dài 1012mm, rộng 2-4mm, có hai mồm hút, mồm hút phía trước thơng với đường tiêu hố có đường kính 600 µm, mồm hút phía sau (mồm hút bụng) có đường kính 500µm Ống tiêu hố chạy dọc bên thân ống tắc, không nối thông với Sán khơng có hậu mơn dinh dưỡng sán chủ yếu thẩm thấu chất dinh dưỡng qua bề mặt sán Do thân sán có nhiều tuyến dinh dưỡng Trên thân sán có phận sinh dục đực Tinh hoàn chia nhánh, chiếm gần hết phía sau thân Buồng trứng khoảng thân, tử cung chạy ngoằn ngoèo, chứa nhiều trứng Trứng Trứng sán gan nhỏ, kích thước 16-17µm x 26-30µm, hình bầu dục, cực có nắp giống hình chóp mũ, cực phình to giống lọ phình đáy có gai nhỏ Trứng mầu vàng sẫm Vỏ mỏng, nhẵn, có đường viền kép Bên khối nhân có hình ảnh ấu trùng 1.1.2 Chu kỳ phát triển Sán gan nhỏ ký sinh ống mật nhỏ gan Nếu nhiều, sán phá huỷ nhu mơ gan ký sinh tổ chức gan Sán dinh dưỡng cách thẩm thấu chất dinh dưỡng từ dịch mật Sán gan đẻ trứng ống mật Trứng theo mật xuống ruột theo phân ngồi Trứng cần có mơi trường nước để phát triển thành ấu trùng lông Ấu trùng lông bơi tự nước tìm tới ký sinh số lồi ốc để phát triển thành vĩ ấu trùng (ấu trùng đuôi) sau vào ốc từ 21-30 ngày Sán gan nhỏ có vật chủ người, ngồi lồi động vật khác chó, mèo, lợn, chuột, chồn vật chủ sán gan nhỏ Để gây nhiễm cho người hay vật chủ khác, sán gan nhỏ phải giai đoạn ấu trùng có khả gây nhiễm (giai đoạn ấu trùng lơng) Khi ăn phải thức ăn có chứa ấu trùng sán gan nhỏ giai đoạn có khả gây nhiễm, ấu trùng theo thức ăn từ thực quản xuống dày tá tràng, ấu trùng tìm cách chui lên đường mật đến khu trú nhánh đường dẫn mật gan Các ấu trùng khoảng vài tháng để trở thành sán gan nhỏ trưởng thành sán gan nhỏ trưởng thành tồn gan tới 20 25 năm Trong q trình trứng sán gan nhỏ tạo lại theo đường dẫn mật xuống ruột theo phân thải ngồi mơi trường - nguồn nước Trong mơi trường nước, trứng sán gan nhỏ vật chủ trung gian thứ ốc ăn, thể ốc, trứng sán gan nhỏ phát triển qua ba giai đoạn Khi dạng trùng lơng, chúng đào thải ngồi bơi lội mơi trường nước, gặp số lồi cá nước giữ vai trò vật chủ trung gian thứ hai, ấu trùng xuyên qua da cá để kết thành nang thịt cá trở thành dạng ấu trùng nang có khả gây nhiễm cho người [16] 1.1.3 Phương thức lây truyền bệnh người Miền Bắc nước ta, cá rửa sạch, đánh vẩy, lọc thịt, thịt cá thấm khô, thái nhỏ trộn với nước chát củ búp ổi Sau thịt cá trộn thính gia vị ăn kèm nhiều loại thơm Miền Nam (Phú Yên) có tập quán ăn gỏi cá “gỏi sinh cầm”, nghĩa ăn cá sống, bơi chậu dùng vó vớt con, nhắm 10 rượu với đủ loại thơm, tập quán có từ lâu đời nhân dân địa phương Do tỷ lệ nhiễm O.viverrini phổ biến [16] Một số trường hợp vùng dịch tễ sán gan nhỏ, không ăn gỏi cá bị nhiễm bệnh ăn cá rán chưa chín (phần thịt cịn sống) 1.1.4 Bệnh học Sán gan gây tổn thương nghiêm trọng gan Sán gây kích thích thường xuyên gan, đồng thời chiếm thức ăn gây độc Vị trí ký sinh kích thước sán dễ gây tượng tắc Do sán thường bám chặt vào ống mật, dùng mồm để hút thức ăn nên lâu dần gan bị xơ hóa lan toả khoảng cửa, tổ chức gan bị tăng sinh đẩn tới tượng xơ hố gan, cổ chướng , thoái hoá mỡ gan Độc tố sán tiết gây nên tình trạng dị ứng, đơi gây thiếu máu, tăng bạch cầu toan Về thương tổn bệnh học, gan bị to rõ rệt Trọng lượng gan tới 4kg Ở mặt gan có điểm phình giãn, chỗ phình giãn thường có màu trắng nhạt tương ứng với giãn nở ống mật Nếu cắt điểm phình giãn thấy chảy dịch màu xanh xám 1.1.5 Triệu chứng Biểu lâm sàng bệnh sán gan nhỏ phụ thuộc vào cường độ nhiễm phản ứng vật chủ Trong trường hợp nhiễm khơng có triệu chứng đặc biệt Trường hợp nhiễm sán gan với số lượng 100 bệnh biểu qua giai đoạn sau: Giai đoạn khởi phát người bệnh thường bắt đầu với biểu rối loạn dày ruột chán ăn, ăn không tiêu, đau âm ỉ vùng gan, tiêu chảy táo bón thất thường Kèm theo thấy toàn thân phát ban, mẩn Giai đoạn toàn phát người bệnh đau vùng gan nhiều hơn, kèm theo thiếu máu, vàng da cổ trướng xuất giai đoạn muộn Nếu có bội nhiễm vi khuẩn, bệnh nhân sốt thành sốt kéo dài 37 - Thiết kế mồi: Tạo mồi LAMP xác định đặc hiệu cho C sinensis, mồi LAMP xác định đặc hiệu cho O viverrini phương pháp sau: - Sử dụng công cụ trực tuyến Primer- Blast để đánh giá, lựa chọn trình tự mồi phù hợp từ nghiên cứu cơng bố tạp chí có uy tín Hoặc sử dụng phần mềm tin sinh chuyên dụng Primer Explorer v.5, ClustalX, Oligos … để tìm vùng bảo tồn vùng gene mục tiêu, thiết kế mồi, kiểm tra đặc tính oligonucleotide thiết kế - Kỹ thuật xét nghiệm phân tìm trứng sán gan nhỏ phương pháp xét nghiệm Kato-Katz theo hướng dẫn WHO (1994), quy trình chuẩn Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương Các bước kỹ thuật sau: + Lấy khoảng gam phân đựng vào lọ có nhãn + Dùng que lấy khoảng 100 mg phân (bằng hạt ngô) đặt lên giấy báo giấy thấm + Đặt lưới lọc lên phân + Dùng que ấn nhẹ cho phân lọt qua lưới lọc gạt lấy phân phía + Đặt phiến đong phân lên lam kính lấy phân từ que gạt phân cho đầy vào lỗ đong + Gạt nhẹ miệng hố để loại phần phân thừa, cẩn thận nhấc phiến đong ra, để lại phân đong lam kính + Đặt mảnh cellophane lên phân Dùng nút cao su lam kính khác ấn nhẹ cho phân dàn đến rìa mảnh cellophane + Để tiêu từ 15 phút - 60 phút đến khơ + Soi phát trứng sán kính hiển vi với vật kính 10X, thị kính 10X Chuyển sang vật kính 40X để xác định lồi, đếm trứng tồn tiêu 38 + Giải trình tự ADN để thẩm định kết tái tổ hợp theo phương pháp Sanger máy ABI 3500 + Xác định nồng độ ADN phương pháp real time PCR định lượng đo nồng độ máy chuyên dụng với mồi tự thiết kế trình tự tham khảo + Pha loãng dãy nồng độ để tạo panel chứng dương - Kỹ thuật qPCR – Taqman Probe: Hoạt động tổng hợp sản phẩm PCR Taq polymerase làm phân cắt Taqman probe bắt cặp đặc hiệu bên vùng gen mục tiêu giải phóng phân tử phát huỳnh quang Mẫu kết luận dương tính cường độ huỳnh quang thu phản ứng tăng cao giá trị ngưỡng thời điểm - Phương pháp điện di gel agarose: Các sản phẩm nhân phản ứng PCR có độ dài khác di chuyển với tốc độ khác môi trường bán rắn gel agarose tác động điện trường Kích thước sản phẩm xác định tương đối so sánh vị trí với thang chuẩn 2.7 Các số nghiên cứu 2.8 Thu thập số liệu, xử lý số liệu 2.9 Sai số khống chế sai số 39 2.10 Đạo đức nghiên cứu - Việc tiến hành nghiên cứu có xin phép đồng ý hội đồng đạo đức Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương - Các thông tin thu đối tượng nhằm mục đích nghiên cứu - Mục đích nghiên cứu nhằm góp phần đem lại hội chẩn đoán sớm giúp điều trị hiệu sán gan nhỏ, khơng nhằm mục đích khác 40 Chương DỰ KIẾN KẾT QUẢ 3.1 Đánh giá thực trạng nhiễm sán gan nhỏ người số vùng dịch tễ tỉnh Ninh Bình Phú Yên 3.1.1.Tỷ lệ nhiễm cường độ nhiễm sán gan nhỏ người dân số vùng dịch tễ tỉnh Ninh Bình Phú Yên Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm sán gan nhỏ chung Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm sán gan nhỏ theo giới Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm sán gan nhỏ theo nhóm tuổi Bảng 3.4 Tỷ lệ nhiễm sán gan nhỏ theo nghề nghiệp Bảng 3.5 Tỷ lệ nhiễm sán gan nhỏ theo trình độ học vấn Bảng 3.6 Cường độ nhiễm trứng sán gan nhỏ Bảng 3.7: Cường độ nhiễm trứng sán gan nhỏ theo giới 3.2 Nghiên cứu chế tạo kít LAMP để chẩn đốn nhiễm sán gan nhỏ Clonorchis sinensis Opisthorchis viverrini nhiễm người - Xây dựng quy trình sản xuất hồn thiện quy trình chế tạo 100 kit LAMP thực nghiệm - Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của 100 kit LAMP chế tạo phịng thí nghiệm so với phương pháp chuẩn khác trước đưa thực địa 3.3 Ứng dụng kít LAMP để phát tỉ lệ nhiễm sán gan nhỏ người tỉnh Ninh Bình Phú Yên - Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kit LAMP so với phương pháp chuẩn phát người nhiễm sán gan Ninh Bình Phú Yên - Đánh giá tính bền vững kit LAMP phát nhiễm sán gan nhỏ Ninh Bình Phú Yên 41 Chương DỰ KIẾN BÀN LUẬN - So sánh kết đạt với nghiên cứu khác Việt Nam giới - Đánh giá quy trình chế tạo hiệu kit LAMP ứng dụng phát nhiễm sán gan nhỏ phịng thí nghiệm thực địa tỉnh Ninh Bình Phú Yên DỰ KIẾN KẾT LUẬN - Thực trạng nhiễm sán gan nhỏ Ninh Bình Phú Yên - Quy trình chế tạo kit LAMP ứng dụng chẩn đoán nhiễm sán gan nhỏ người: xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, tính bền vững so với phương pháp chẩn đoán sán gan nhỏ tiêu chuẩn khác - Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, tính bền vững kit LAMP so với phương pháp chẩn đoán sán gan nhỏ tiêu chuẩn khác Ninh Bình Phú Yên DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ 42 KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU Kế hoạch thực đề tài 1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.3.1 1.3 Nội dung nghiên cứu năm 2018-2019 Công việc 1: Nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo kít LAMP để chẩn đoán sán gan nhỏ Nghiên cứu xây dựng dự thảo Dự thảo quy trình chế tạo kít quy trình để chế tạo kít LAMP LAMP chẩn đoán sán gan nhỏ chẩn đoán sán gan nhỏ Hội đồng khoa học kỹ thuật chuyên ngành thông qua Thực nội dung nghiên cứu dự thảo quy trình hồn thiện quy trình chế tạo kít Quy trình thu thập, bảo quản Hồn thiện quy trình kỹ thuật mẫu phân, mẫu sán gan nhỏ thu thập bảo quản mẫu phân, trưởng thành mẫu sán gan nhỏ trưởng thành Lựa chọn quy trình tách chiết Lựa chọn quy trình tách chiết ADN tổng số từ mẫu phân, ADN tổng số từ mẫu phân, mẫu mẫu sán gan nhỏ trưởng mô sán gan nhỏ trưởng thành sử thành dụng phù hợp cho kít LAMP Xây dựng quy trình kỹ thuật LAMP xác định sán gan nhỏ loài Clornochis sinensis Opisthorchis viverrini Lựa chọn thiết kế 02 trình tự mồi LAMP xác định mồi LAMP xác định Clornochis sinensis Clornochis sinensis Opisthorchis viverrini; 01 Báo cáo Opisthorchis viverrini, khảo sát phân tích tính đặc hiệu mồi tính đặc hiệu mồi LAMP Xây dựng quy trình kỹ thuật Quy trình tách dịng trình tự gen tạo tách dịng trình tự gen tạo chứng dương cho Clornochis chứng dương chuẩn cho kít sinensis Opisthorchis viverrini; LAMP chẩn đoán sán gan Tạo chứng dương đủ chế tạo nhỏ 1.000 test LAMP Công việc 2: Điều tra thu mẫu sán gan nhỏ O viverrini tỉnh Phú Yên C sinensis tỉnh Ninh Bình để đánh giá thực trạng nhiễm sán gan nhỏ, thử nghiệm chế tạo đánh giá kít LAMP phịng thí nghiệm Nội dung nghiên cứu năm 2020-2021 Cơng việc 3: Chế tạo kít LAMP chẩn đoán sán gan nhỏ, đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định kít LAMP, đánh giá kít 43 LAMP thực địa ngoại kiểm so sánh chất lượng kít Xây dựng quy trình sử dụng bảo quản kít 3.1 1.1 1.2 3.2 3.3 3.4 3.5 Chế tạo kít LAMP chẩn đốn sán gan nhỏ quy trình sử dụng Xây dựng bảo quản kít LAMP để chẩn đoán sán gan nhỏ Chế tạo lượng kít LAMP chẩn đốn sán gan nhỏ Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kít LAMP chẩn đoán sán gan nhỏ mẫu thực địa quy mơ phịng thí nghiệm Đánh giá kít thực địa tỉnh Phú Yên Ninh Bình So sánh kít LAMP chế tạo với kít thương mại số mồi LAMP có mục tiêu có mục tiêu gần giống cơng bố Đánh giá ngoại kiểm chất lượng kít LAMP chẩn đốn sán gan nhỏ Công việc 4: Xây dựng tiêu chuẩn sở cho kít LAMP chẩn đốn sán gan nhỏ Dự thảo quy trình Hội đồng khoa học kỹ thuật chuyên ngành thông qua Chế tạo 500 test LAMP chẩn đoán sán gan nhỏ sử dụng cho thử nghiệm phịng thí nghiệm thực địa Báo cáo phân tích độ nhạy độ đặc hiệu kít LAMP chẩn đốn sán gan nhỏ Báo cáo phân tích so sánh kít LAMP chẩn đốn sán gan nhỏ Báo cáo kết đánh giá ngoại kiểm Bộ tiêu chuẩn sở kít LAMP chẩn đốn sán gan nhỏ: độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện… Kế hoạch tài Kinh phí thực nghiên cứu theo kinh phí đề tài cấp Nhà nước 44 TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI, TÍNH KHẢ THI CỦA ĐỀ TÀI Tính khoa học đề tài Chúng lựa chọn công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng (LAMP) để nghiên cứu chế tạo kit chẩn đoán sán gan nhỏ dựa ưu điểm vượt trội công nghệ so với kỹ thuật sử dụng như: - Độ nhạy, độ đặc hiệu cao tương đương với phương pháp PCR - ADN làm khn khuếch đại khơng địi hỏi độ tinh cao, sử dụng phương pháp tách chiết đơn giản, tiết kiệm kinh phí, thời gian - Phát kết trực tiếp mắt thường sử dụng thuốc nhuộm que thử miễn dịch: Đơn giản, xác, tránh tạp nhiễm, tiết kiệm thời gian, kinh phí, khơng tiếp xúc với hóa chất độc hại giúp đảm bảo sức khỏe cho người thực - Thời gian xét nghiệm nhanh, xét nghiệm đồng thời nhiều mẫu - Thực thực địa, dễ chuyển giao kỹ thuật cho y tế tuyến sở - Hóa chất, vật tư để chế tạo kít phổ biến thị trường nên dễ mua, giá thành rẻ so với công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt khác RPA, NASBA - Chi phí cho xét nghiệm rẻ khơng địi hỏi đầu tư thiết bị đắt tiền so với phương pháp sinh học phân tử khác PCR, RT-qPCR Hoạt động phản ứng LAMP diễn điều kiện đẳng nhiệt (ví dụ 650C) Tính đề tài Tại Việt Nam chưa có kit phân tử dựa phương pháp đẳng nhiệt để chẩn đoán sán gan nhỏ ứng dụng thực địa thương mại Do vậy, đề tài thực góp phần giải khó khăn cấp bách, hạn chế mặt kỹ thuật biện pháp truyền thống đặt ra, chủ động phát triển kỹ thuật tiên tiến nhằm tăng cường chất lượng xét nghiệm để đáp ứng nhanh hiệu chẩn đoán sán gan nhỏ, góp phần giảm gánh nặng bệnh tật cho người dân, đóng góp hồn thành mục tiêu phịng chống ảnh hưởng, tác hại bệnh loại giun sán nói chung sán gan nhỏ nói riêng cộng đồng 45 Tính khả thi đề tài Đề tài có tính khả thi TÀI LIỆU THAM KHẢO E Bazsalovicsová, Králová-Hromadová, I., Špakulová, M., Reblánová, M ;Oberhauserová, K (2010), "Determination of ribosomal internal transcribed spacer (ITS2) interspecific markers in Fasciola hepatica, Fascioloides magna, Dicrocoelium dendriticum and Paramphistomum cervi (Trematoda), parasites of wild and domestic ruminants", Helminthologia, tr 47(2) MM Hassan, Saad, M, Hegab, MH, Metwally, S (2001), "Evaluation of circulating Fasciola antigens in specific diagnosis of fascioliasis", J Egypt Soc Parasitol, tr 31:271 S Adachi, Kotani, K, Shimizu, T, et al (2005), "Asymptomatic fascioliasis", Intern Med, 44:1013 Lê Quang Huấn Hoàng Phú Hiệp (2011), "Kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) hướng việc tạo Kit phát nhanh bệnh truyền nhiễm", Tạp chí khoa học cơng nghệ, 90(02), tr 43-48 Trần Thị Hồng Lê Đức Vinh (2006), "Điều tra nhiễm Strongyloides stercoralis phương pháp cấy nghiệm phân cải tiến xã Phú Hịa Đơng, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 7/2006 đến tháng 12/2006", Y học TP HỒ Chí Minh, Phụ 11(39-41) R Arjona, Riancho, JA, Aguado, JM, et al (1995), "Fascioliasis in developed countries: a review of classic and aberrant forms of the disease", Medicine (Baltimore), tr 74:13 Y Arimatsu, Kaewkes, S., Laha, T., Hong, S.J., Sripa, B ( 2012), "Rapid detection of Opisthorchis viverrini copro-DNA using loopmediated isothermal amplification International 61, tr 178–182 (LAMP)", Parasitology Berit A S Cook J., Iveth J G., et al (2015), "Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) for point-of-care detection of asymtomatic low density malaria parasite carriers in Zanzibar", Malaria journal, tr 14:43 AM Espino, Diaz, A, Perez, A, Finlay, CM.; (1998), " Dynamics of antigenemia and coproantigens during a human Fasciola hepatica outbreak ", J Clin Microbiol tr 36:2723 10 Wamadeva B Craw P (2012), "Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of – care diagnostics: a critical review", Lap on a chip.12p 11 K E et al Halliday (2014), " Impact of intermittent screening and treatment for malaria among school children in Kenya: a cluster randomised trial", PLoS Med., 11, tr e1001594 12 D.R Hopkins, () : (1992), " Homing in on helminthes", Am J Trop Med Hyg, 46, tr 626-634 13 W Apt, Aguilera, X, Vega, F, et al (1995), " Treatment of human chronic fascioliasis with triclabendazole: drug efficacy and serologic response", Am J Trop Med Hyg, tr 52:532 14 M Dorris, Viney, M.E., Blaxter, M.L (2002), "Molecular phylogenetic analysis of the genus Strongyloides and related nematodes", Int J Parasitol, 3212, tr 1507e1517 15 N.D Feliciano, Gonzaga, H.T., Gonỗalves-Pires, M.R.F., Gonỗalves, A.L.R.,Rodrigues, R.M., Ueta, M.T., Costa-Cruz, J.M (2010), "Hydrophobic fractions from Strongyloides venezuelensis for use in the human immunodiagnosis of strongyloidiais", Diagn Microbiol Infect Dis, 67, tr 153e161 16 Phạm Văn Thân Nguyễn Văn Đề, (), , (2012), Ký sinh trùng Y học, Nxb Y học 17 Gasser R B Lun Z R., Lai D H., Li A X., Zhu X Q., Yu X B., Fang Y Y (2005), "Clonorchiasis: a key foodborne zoonosis in China.", Lancet Infect, Dis, 5, tr 31–41 18 H.J Rim, Farag, H.F., Sornmani, S., Cross, J.H (1994), "Food-borne trematodes: ignored or emerging?", Parasitol Today., 10, tr 207-209 19 Đỗ Trung Dũng cs Đặng Thị Cẩm Thạch (2008), "Tình hình nhiễm sán người xã Nghĩa Phú Nghĩa Lạc, huyện Nghĩa Hưng , tỉnh Nam Định, 2007", Tạp chí Phịng chống bệnh Sốt rét bệnh Ký sinh trùng, Số 1, tr 47-53 20 P Sithithaworn, Tesana, S., Pipitgool, V., Kaewkes, S., Pairojkul, C., Sripa, B.,Paupairoj, A., Thaiklar, K (1991), " Relationship between faecal egg count and worm burden of Opisthorchis viverrini in human autopsy cases", Parasitology International, 102, tr 277–281 21 S Wongratanacheewin, Pumidonming, W., Sermswan, R.W., Pipitgool, V., Maleewong, W (2002), "Detection of Opisthorchis viverrini in human stool specimens by PCR", Journal of Clinical Microbiology, 40, tr 3879–3880 22 S.M Rahman, Bae, Y.M., Hong, S.T., Choi, M.H (2011), "Early detection and estimation of infection burden by real-time PCR in rats experimentally infected with Clonorchis sinensis", Parasitology Research, 109, tr 297–303 23 E.M Kim, Verweij, J.J., Jalili, A., van Lieshout, L., Choi, M.H., Bae, Y.M., Lim, M.K., Hong, S.T (2009), "Detection of Clonorchis sinensis in stool samples using real-time PCR", Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 103, tr 513–518 24 M A Taylor, Coop, R L & Wall, R L (2007), "Veterinary Parasitology ed Oxford, UK ; Ames, Iowa: Blackwell", ISBN, tr 978-1-4051-1964-1 25 K Duenngai, Boonmars, T., Sithithaworn, J., Sithithaworn, P (2013), "Diagnosis of early infection and post chemotherapeutic treatment by coproDNA detection in experimental opisthorchiasis", Parasitology Research, 112, tr 271–278 26 T Notomi, Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N & Hase, T (2000), "Loop-mediated isothermal amplification of DNA ", Nucleic acids research, 28(12), tr e63–e63 27 Mikosza A.S Njiru Z.K., Armstrong T., Enyaru J.C., Ndung'u J.M., Thompson A.R (2008), "Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for rapid detection of Trypanosoma brucei rhodesiense", PLoS Negl Trop Dis., 2(1), tr e147 28 Sithithaworn P Andrews R H., and Petney T N () (2008), "Opisthorchis viverrini: an underestimated parasite in world health", Trends Parasitol, 24, tr 497–501 29 Risa W Han E-T., Jetsumon S., et al (2007), "Detection of four Plasmodium species by Genus and species-specific Loop Mediated Isothermal Amplification for clinical diagnosis.", Journal of Clinical Microbiology, tr 2521- 2528 30 E.-T Han (2013), " Loop-mediated isothermal amplification test for the molecular diagnosis of malaria", Expert Rev Mol Diagn, 13, tr 205–18 31 Moemi S Aonuma H., Hiroshi I., et al (2008), "Rapid identification of Plasmodium – carrying mosquitoes using Loop Mediated Isothermal Amplification", Biochemical and biophysical research communications, 276, tr 671-676 32 Lotus L H Wu L., Hannah S., et al (2015), "Coparison of diganostics for dectection of asymtomatic Plasmodium falciparum infections to inform control and elimination strategies", Nature, 7580, tr 528 33 Koichi M Yamamura M., Yasuo O (2009), " Evaluation of a new rapid molecular diagnosis system for Plasmodium falciparum combined with DNA filter paper, Loop Mediated Isothermal Amplification, and Melting curve analysis", Jpn J Infect Dis, 62, tr 20-25 34 Nora L M Vallejo A F., Iveth J G., et al (2014), "Evaluation of the Loop Mediated Isothermal DNA Amplification (LAMP) kit for malaria diagnosis in P vivax Endemic settings of Comlombia", Plos Negl Trop Dis 9(1) tr e3453 35 LTD FIND – EIKEN Chemical co (2012), Manual of Standard Operating Proceduce for malaria LAMP 36 Viriyakosola S Snounou G., Zhua X.P., Jarraa W., Pinheirob L., Virgilio E Rosariob, Thaithongc S., and Brown K.N (1993), "High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction", Molecular and Biochemical Parasitology, 61, tr 315-320 37 Huang X Lizardi P.M., Zhu Z., Bray-Ward P., Thomas D.C., Ward D.C (1998), "Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification", Nature Genetics, 19, tr 225 - 232 38 B et al Aydin-Schmidt (2014), "Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Accurately Detects Malaria DNA from Filter Paper Blood Samples of Low Density Parasitaemias", PLoS One 9, , tr e103905 39 J T Lin, Saunders, D L & Meshnick, S R (2014), "The role of submicroscopic parasitemia in malaria transmission: what is the evidence?", Trends Parasitol, 30, tr 183–90 40 Takafumi T Sattabongkot J., Eun-Taek H., et al (2014), " Loop Mediated Isothermal Amplification Assay for rapit Diagnosis of malaria infection in an area of Endemicity in Thailand", Journal of Clinical Microbiology, 52(05), tr 1471-1477 41 L Ai, Chen, M X., Alasaad, S., Elsheika, H M., Li, J., Li, H L., Lin, R Q., Zou, F C., Zhu, X Q ; Chen, J X (2011), "Genetic characterization, species differentiation and detection of Fasciola spp by molecular approaches", Parasites & Vectors [online], tr 4(101) 42 Hong Nguyen Van Peter Van den Eede, Chantal Van Overmeir, Indra Vythilingam, Thang Ngo Duc, Le Xuan Hung, Hung Nguyen Manh, Jozef Anné, Umberto D'Alessandro1 and Annette Erhart (2009), "Human Plasmodium knowlesi infections in young children in central Vietnam", Malaria Journal, tr 8:249 43 X.Q Cai, Xu, M.J., Wang, Y.H., Qiu, D.Y., Liu, G.X., Lin, A., Tang, J.D., Zhang, R.L.,Zhu, X.Q (2010), "Sensitive and rapid detection of Clonorchis sinensis infection in fish by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)", Parasitology Research, 106, tr 1379–1383 44 M.R Watts, James, G., Sultana, Y., Ginn, A.N (2014), "A loopmediated isothermal amplification (LAMP) assay for Strongyloides stercoralis in stool that uses a visual detection method with SYTO-82 fluorescent dye", Am J Trop Med Hyg, 90, tr 306e311 45 Lê Quang Huấn Hoàng Phú Hiệp (2011), "Kỹ thuật LAMP (Loopmediated isothermal amplification) cho việc phát nhanh xác vi khuẩn Escherichia coli O157:H7", Tạp chí sinh học 34 (03), tr 343-346 ... cao để đáp ứng nhu cầu nâng cao chất lượng chẩn đốn bệnh sán gan nhỏ, chúng tơi thực đề tài Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán gan nhỏ chế tạo kit LAMP để chẩn đốn nhiễm sán gan nhỏ Ninh Bình Phú Yên,. .. Bình Phú Yên, năm 2018- 2021 với mục tiêu sau: Đánh giá thực trạng nhiễm sán gan nhỏ người số vùng dịch tễ tỉnh Ninh Bình Phú Yên Nghiên cứu chế tạo kít LAMP để chẩn đốn nhiễm sán gan nhỏ Clonorchis... phịng thí nghiệm thực địa tỉnh Ninh Bình Phú Yên DỰ KIẾN KẾT LUẬN - Thực trạng nhiễm sán gan nhỏ Ninh Bình Phú Yên - Quy trình chế tạo kit LAMP ứng dụng chẩn đoán nhiễm sán gan nhỏ người: xác định