Quy trình duplex-PCR xác định nhiễm trùng Mycoplasma hyopneumoniae - Mycoplasma hyorhinis trên mẫu phổi, dịch khớp và dịch xoang miệng trên heo

Nghiên cứu thực hiện nhằm xây dựng và tối ưu hóa quy trình duplex PCR phát hiện đồng thời Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) và Mycoplasma hyorhinis (Mhr) trên heo.

AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 24 (1), 59 – 67 QUY TRÌNH DUPLEX PCR XÁC ĐỊNH NHIỄM TRÙNG MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE - MYCOPLASMA HYORHINIS TRÊN MẪU PHỔI, DỊCH KHỚP VÀ DỊCH XOANG MIỆNG TRÊN HEO Đỗ Tiến Duy1, Nguyễn Tất Tồn1 Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Thơng tin chung: Ngày nhận bài: 11/10/2018 Ngày nhận kết bình duyệt: 29/03/2019 Ngày chấp nhận đăng: 02/2020 Title: Duplex pcr protocol for detection of mycoplasma hyopneumoniae - mycoplasma hyorhinis on lung, joint exudates and oral fluid specimens from pigs Keywords: duplex-PCR, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, pigs Từ khóa: Duplex-PCR, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, heo ABSTRACT The study aims at building and optimizing a duplex PCR protocol for simultaneously detection of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis in pigs Duplex PCR was built completely including an optimized parameters: primer concentrations of Mhp16s-F, Mhp16s-R, Mhr37p-F, and Mhr37p-R were 0.5 µM; 0.5 µM; 0.5 µM; and 0.5 µM, respectively d-PCR thermal reaction was in total 35 cycles of initial denaturation at 94 oC for minutes, second denaturation at 94 oC for min., annealing at 45 oC for min., extension at 72 oC for and the final extension at 72 oC for The d-PCR had a high specificity and sensitivity to be able to detect minimum 20.9 copies/ng (Mhp) and 15.0 copies/ng (Mhr) The d-PCR is highly applicable since 11/11 field samples were matched with s-PCR in result TÓM TẮT Nghiên cứu thực nhằm xây dựng tối ưu hóa quy trình duplex PCR phát đồng thời Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) Mycoplasma hyorhinis (Mhr) heo Duplex PCR xây dựng thành công với thông số tối ưu sau: Nồng độ mồi Mhp16s-F, Mhp16s-R, Mhr37p-F, Mhr37p-R 0,5 µM; 0,5 µM; 0,5 µM; 0,5 µM Chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng d-PCR bao gồm giai đoạn tiền biến tính 94 oC 3phút, biến tính 94 oC phút, bắt cặp 45 oC phút, kéo dài 72 oC phút giai đoạn hậu kéo dài 72 oC phút, lặp lại 35 chu kỳ Quy trình d-PCR có đặc hiệu độ nhạy cao với khả phát tối thiểu 20,9 copies/ng (Mhp) 15,0 copies/ng (Mhr) Quy trình d-PCR có tính ứng dụng cao 11/11 mẫu thực địa cho kết đồng với quy trình s-PCR heo Mhr vi khuẩn gây viêm khớp, viêm màng dịch tham gia mầm bệnh ca bệnh hô hấp ghi nhận (Kobayashi cs., 1996; Lobo cs., 2011) GIỚI THIỆU Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) Mycoplasma hyorhinis (Mhr) thuộc nhóm vi khuẩn nhỏ nhất, khơng có thành tế bào, thuộc giống Mycoplasma có khả gây bệnh 59 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 24 (1), 59 – 67 xác định Mhp Mhr mẫu bệnh phẩm phổi dịch khớp Mhp Mhr với nhiều mầm bệnh khác cộng hợp gây suy hô hấp nghiêm trọng heo, hội chứng hô hấp phức hợp (Brockmeier cs., 2002; Thacker Thanawongnuwech, 2004) Viêm phổi Mhp phổ biến heo nhiều nước giới (Brockmeier cs., 2002) nước ta (Nguyễn Thị Phước Ninh cs., 2006), nhiên Mhr chưa nhiều nhà khoa học đánh giá khả sinh bệnh yếu tố độc lực Ở số khảo sát mới, viêm phổi Mhr khó phân biệt với Mhp hay nhiễm đồng thời Mhp Mhr ca viêm phổi mãn tính làm tăng cao tổn thương, hư hại phế quản, màng phổi (Lin cs., 2006; Lobo cs., 2011) 10% Mhr phân lập từ dịch mũi heo nái, 20% mô phổi heo kiểm soát bệnh (SPF), 66% heo thương phẩm (Kobish & Friis, 1996) 30 - 40% dịch mũi heo sau cai sữa, cho thấy khả khu trú vi khuẩn đường hô hấp heo lứa tuổi 2.2 Nguyên liệu nghiên cứu 2.2.1 Đối chứng mẫu bệnh phẩm DNA kháng nguyên đối chứng (Mhp, 619 ng/µL; Mhr, 476 ng/µL) ly trích từ bệnh phẩm dương tính xác định nồng độ ước lượng qua mật độ quang học (máy đo OD Thermo Scientific, Mỹ) DNA E.coli, APP, HPS, Salmonella spp., Staphylococcus aureus (Bệnh viện thú y, Trường ĐHNL Tp.HCM) làm đối chứng phản ứng chéo cho quy trình d-PCR 11 mẫu bệnh phẩm (2 mẫu dịch hầu họng, mẫu dịch khớp mẫu mô phổi) thu thập ca bệnh heo 2.2.2 Các cặp mồi/primers cho phản ứng PCR Mồi đặc hiệu khuyếch đại sản phẩm s-PCR dPCR cho Mhp [Mhp16s-F: 5’ACTAGATAGGAAATGCTCTAG-3’ Mhp16s-R: 5’ATACTACTCAGGCGGATCATTTAAC-3’], có sản phẩm 430bp (Barate cs., 2012); khuyếch đại sản phẩm cho Mhr [Mhr37p-F: 5’GTAGTCAAGCAAGAGGATGT-’3 Mhr37pR: 5’-GCTGGAGTTATTATACCAGGA-3’], có sản phẩm 346bp (Caron cs., 2000) Sự chẩn đoán đồng thời Mhp Mhr ca bệnh rối loạn hô hấp, viêm đa màng dịch viêm khớp có tính thực tiễn cao, bệnh heo có khuynh hướng diễn dạng hội chứng, kết hợp nhiều dấu hiệu lâm sàng phức tạp hô hấp, tiêu chảy viêm khớp (Thacker & Thanawongnuwech, 2004; Đỗ Tiến Duy & Nguyễn Tất Toàn, 2013) Đánh giá nhiễm ghép Mhp Mhr ca bệnh heo giúp người làm cơng tác thú y việc phịng trị bệnh tốt Do đó, nghiên cứu nhằm mục đích đánh giá, tối ưu hóa áp dụng quy trình duplex PCR chẩn đoán Mhp Mhr heo điều kiện thực tiễn nước từ kết nghiên cứu nước ngồi 2.2.3 Dụng cụ hóa chất Kit IVApDNA Extraction kit (Công Ty Việt Á, Tp.HCM) sử dụng chiết tách DNA từ mẫu bệnh phẩm Go taq® green master mix Go taq® G2 Hot Start green master mix (Promega, Mỹ), nước không nuclease (Promega, Mỹ) sử dụng phản ứng s-PCR d-PCR máy khuyếch đại PCR (Techne, Anh) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3 Phương pháp tiến hành 2.1 Nội dung nguyên liệu nghiên cứu Tính chất chung đặc hiệu mồi kiểm tra gồm: Chiều dài sở phù hợp khoảng 18 - 24 nucleotides, GC chiếm 35 - 60%, khả hình thành cấu trúc thứ cấp thấp (kết khơng trình bày; cơng cụ PrimerSelect, Lasergene) Hai cặp mồi sử dụng nghiên cứu để khuyếch đại 2.3.1 Kiểm tra đặc tính chung mồi Nghiên cứu gồm ba bước sau: [1] Thử nghiệm, đánh giá quy trình PCR đơn (s-PCR) phát riêng lẽ Mhp Mhr; [2] Xây dựng, tối ưu hóa quy trình PCR đơi (d-PCR) phát đồng thời Mhp Mhr; [3] Ứng dụng d-PCR tối ưu hóa 60 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 24 (1), 59 – 67 đoạn gen mã hóa 16s rRNA (Barate cs., 2012) 37p (Caron cs., 2000) đặc hiệu cho chủng Mhp Mhr, tương ứng (NCBI, GeneBank) phản ứng với thành phần sử dụng Go taq® green master mix, 2X (Bảng 2) chu trình luân nhiệt gồm ba giai đoạn: Giai đoạn (1 chu kỳ), tiền biến tính 94 oC phút; giai đoạn (35 chu kỳ), biến tính 94 oC phút, bắt cặp 45 oC phút kéo dài sản phẩm 72 oC phút; giai đoạn (1 chu kỳ), kéo dài sản phẩm cuối 72 oC phút 2.3.2 Thử nghiệm, đánh giá quy trình PCR đơn (s-PCR) Quy trình s-PCR phát Mhp Mhr thực với primer tương ứng, 25 µL tổng Bảng Thành phần phản ứng s-PCR phát Mhp Mhr Thành phần Go taq® green master mix, 2X Mhp16s-F 25 µM Mhp Nồng độ cuối µL 12 0,5 0,5 µM Mhr37p-F 25 µM Mhp16s-R 25 µM Mhr37p-R 25 µM 0,5 µM 0,5 0,5 µM 158 ng/µL 206 ng/µL DNA Mhr đối chứng 476 ng/µL Nước DEPC khơng nuclease 0,5 0,5 µM 0,5 DNA Mhp đối chứng 619 ng/µL µL 12 Mhr Nồng độ cuối vừa đủ 25 µL Sản phẩm khuyếch đại s-PCR có băng tương ứng (Mhp, 430bp; Mhr, 346bp) với đối chứng dương thang chuẩn (ladder 100bp; Promega, Mỹ) giải trình (Cơng ty Nam Khoa, Tp.HCM) Trình tự giải mã sánh cặp tương đồng với 100 trình tự gen 16s rRNA (Mhp) 37p (Mhr) tham chiếu từ ngân hàng liệu gen (GenBank, NCBI) phần mềm BioEdit BLAST (NCBI) Các bước chuẩn hóa s-PCR tham khảo (Đỗ Tiến Duy cs., 2014) gồm xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu (ToC), nồng độ mồi tối ưu lượng Master Mix (Go taq® green, Promega, Mỹ) cho phản ứng khuyếch đại (Bảng 2) chu trình luân nhiệt ba bước giữ nguyên Bảng Các nghiệm thức (NT) chuẩn hóa s-PCR cho Mhp/Mhr Nồng độ mồi* (µL) Nhiệt độ bắt cặp (ToC)/ Master mix (µL) 8µL 10µL 0,25 NT1 0,5 0,75 43 oC 45 oC 47 oC 49 oC 12µL 8µL 10µL 12µL 8µL 10µL 12µL 8µL 10µL 12µL NT4 NT7 NT1 NT4 NT7 NT1 NT4 NT7 NT1 NT4 NT7 NT2 NT5 NT8 NT2 NT5 NT8 NT2 NT5 NT8 NT2 NT5 NT8 NT3 NT6 NT9 NT3 NT6 NT9 NT3 NT6 NT9 NT3 NT6 NT9 *, mồi tương ứng cho Mhp hay Mhr 61 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 24 (1), 59 – 67 2.3.3 Xây dựng, tối ưu hóa quy trình d-PCR Nồng độ cặp mồi tối ưu từ thí nghiệm trước áp dụng để đánh giá thang nhiệt độ bắt cặp mồi khuôn 43 oC, 45 oC, 47 oC, 49 o C thành phần phản ứng khác giữ nguyên hai thí nghiệm Hai cặp mồi với đặc tính (Bảng 1), nồng độ nhiệt độ bắt cặp tối ưu s-PCR, dùng cho thiết kế phản ứng chung d-PCR, với kích thước sản phẩm khác (Mhp, 430bp; Mhr, 346bp) đủ để nhận diện rõ ràng gel điện di Tối ưu hóa dPCR gồm: [1] Xác định khả hoạt động mồi d-PCR; [2] Xác định nồng độ mồi phản ứng d-PCR; [3] Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu mồi phản ứng d-PCR; [4] Xác định lượng Master mix tối ưu d-PCR; [5] Xác định nồng độ DNA khuôn tối thiểu phát d-PCR Mỗi phản ứng tương ứng thí nghiệm lặp lại lần kèm theo đối chứng âm thử nghiệm phản ứng chéo với DNA số vi khuẩn phổ biến (E.coli, APP, HPS, Salmonella spp., Staphylococcus aureus) để xác định tính xác thí nghiệm Xác định lượng Master mix tối ưu dPCR Nồng độ mồi nhiệt độ bắt cặp tối ưu từ thí nghiệm trước dùng phản ứng dPCR nhằm xác định lượng Master mix vừa đủ Lượng Master mix khảo sát 10 µL, 12 µL 14 µL Thành phần phản ứng khác giữ nguyên thí nghiệm Nồng độ DNA đối chứng tối thiểu phát d-PCR Nồng độ DNA đối chứng tối thiểu phát d-PCR dựa theo số LOD (Limit of Detection) LOD xác định nồng độ định, phương pháp xét nghiệm phát diện gen đích 95%, tỷ lệ âm tính giả ≤ 5% (ISO 24276, 2006) DNA đối chứng dương (Mhp Mhr) tinh chloroform/isopropanol, sau đo mật độ quang học (OD; máy đo OD Thermo Scientific, Mỹ) Số copies/ng ước lượng tính tốn theo cơng thức từ phần mềm trực tuyến (http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html) Pha loãng DNA đối chứng tinh theo cấp số 100, 10-1, 10-2, 10-3, , 10-11 để tiến hành chạy d-PCR tìm lượng tối thiểu phát Đánh giá khả hoạt động mồi dPCR Cặp mồi Mhp16s-F, Mhp16s-R cặp mồi Mhr37p-F, Mhr37p-R thử nghiệm môi trường điều kiện phản ứng d-PCR, mơ tả Bảng Quy trình d-PCR thực điều kiện ba giai đoạn: Giai đoạn (1 chu kỳ), tiền biến tính 94 oC phút; giai đoạn (35 chu kỳ), biến tính 94 oC phút, bắt cặp 45 oC phút kéo dài sản phẩm 72 oC phút; giai đoạn (1 chu kỳ), kéo dài sản phẩm cuối 72 oC phút Thành phần phản ứng tổng thể tích (25 àL) nh sau: 12 àL Go taqđ G2 Hot Start green master mix, 2X; 0,5 µL cho đoạn mồi (Mhp16s-F 25 µM, Mh16sR 25 µM, Mhr37p-F 25 µM, Mhr37p-R 25 µM), µL DNA đối chứng dương với tỷ lệ 1:1 (Mhp/Mhr), nước DEPC thêm vào cho đủ tổng thể tích 2.3.4 Ứng dụng d-PCR tối ưu hóa xác định Mhp Mhr mẫu bệnh phẩm Tổng cộng 11 mẫu gồm có mẫu dịch hầu họng (thu thập phương pháp dây cotton, Nguyễn Tất Toàn & Đỗ Tiến Duy, 2013), mẫu dịch khớp mẫu mô phổi thu thập ngẫu nhiên ca bệnh heo (Bệnh viện thú y, Trường ĐHNL Tp.HCM) s-PCR d-PCR tối ưu ứng dụng để xác định Mhp Mhr loại bệnh phẩm Sự tương đồng s-PCR d-PCR tính tốn với trị số Kappa (Blackman & Koval, 2000) Xác định nồng độ mồi tối ưu d-PCR Nồng độ mồi khác (0,25 µM, 0,5 µM, 0,75 µM 1,0 µM) khảo sát với điều kiện phản ứng luân nhiệt giống thí nghiệm đánh giá khả hoạt động mồi Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu d-PCR 62 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 24 (1), 59 – 67 Sản phẩm s-PCR d-PCR tất thí nghiệm điện di gel agarose (1,5%, TBE 0,5x, 100V; máy VWRC®), hịa tan µL/25mL Ethidium bromide (Invitrogen brand, Mỹ), kết điện di đọc máy chiếu tia UV trực tiếp (máy Vilber Lourmat, Pháp) Ở s-PCR Mhp, nhiệt độ bắt cặp 45 oC, 47 oC 49 oC có sản phẩm khuyếch đại tốt tương tự (băng sáng rõ khơng có vạch phụ) gel điện di Hoạt động cặp mồi Mhp16s-F, Mhp16s-R tốt khoảng dao động nhiệt độ rộng giúp cho việc xét nghiệm hiệu điều kiện nhiệt hay máy nhiệt khác Qua thí nghiệm tối ưu nồng độ mồi, 0,5 µM nồng độ tốt cho vạch sản phẩm sáng rõ thang nhiệt độ khác nhau; sản phẩm khuyếch đại mờ gel điện di nồng độ 0,25 µM xuất sản phẩm phụ 0,75 µM Lượng master mix tối ưu cho sản phẩm s-PCR tốt qua khảo sát 10 µL, sản phẩm yếu µL, dư thừa 12 µL sản phẩm s-PCR tốt 10 µL KẾT QUẢ 3.1 Quy trình s-PCR xác định Mhp Mhr Hai cặp mồi Mhp16s-F, Mhp16s-R Mhr37p-F, Mhr37p-R khuyếch đại sản phẩm (Hình 1A, B) hoàn toàn đặc hiệu (gen 16s, Mhp; gien 37p, Mhr) so với chủng tham chiếu ngân hàng liệu gen Hình Sản phẩm khuyếch đại s-PCR [A]: Băng sản phẩm 430bp Mhp giếng 3, 4; [B]: Băng sản phẩm 346bp Mhr giếng 3, 4; [C]: Sản phẩm khuyếch đại Mhr từ s-PCR chuẩn hóa 45oC từ NT1-NT9 (giếng - 9), đối chứng âm (giếng 10) thang chuẩn (L) 63 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 24 (1), 59 – 67 3.3 Quy trình d-PCR tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp khác (giếng số đến 11; hình 2C) Ở 45 oC nhiệt độ bắt cặp lựa chọn cho thí nghiệm Thể tích Master mix 12 µL cho sản phẩm khuyếch đại rõ sáng Quy trình d-PCR yêu cầu lượng thành phần phản ứng (Master mix) cao so với s-PCR Sự cạnh tranh nguyên liệu phản ứng (Polymerase, dNTP MgCl2) xảy cặp mồi khuyếch đại sản phẩm đặc trưng khác Nồng độ DNA tinh Mhp (9,7 ng/µL, tương đương 2,09.1010) Mhr (5,6 ng/µL, tương đương 1,5.1010) xem nồng độ mẫu gốc để tiến hành xác định tính nhạy cảm d-PCR Ở độ pha lỗng 10-9, khơng sản phẩm d-PCR xuất hiện, xem giới hạn thấp (Mhp: 20,9 copies/ng; Mhr: 15,0 copies/ng) mà phản ứng xét nghiệm Sự xác kết lặp lại 10 với mẫu nồng độ pha lỗng 10-9 cho kết hồn tồn giống Hình 2A trình diễn kết đánh giá hoạt động cặp primer (Mhp16s-F, Mhp16s-R Mhr37p-F, Mhr37p-R) phản ứng d-PCR Chất lượng sản phẩm khuyếch đại 430bp Mhp 346bp Mhr tương đồng Độ dày băng sản phẩm yếu s-PCR điều kiện, nguyên liệu phản ứng nên hiệu chỉnh d-PCR để tìm thơng số tối ưu cơng đoạn quan trọng Nồng độ 0,25; 0,5; 0,75 µM mồi cho sản phẩm khuyếch đại tốt, băng sản phẩm rõ sáng Ở nồng độ mồi 0,25 µM kết khuyếch đại nồng độ lại; 0,5 µM nồng độ hữu hiệu với kết tốt hạn chế dư thừa phản ứng Ở kết khảo sát nhiệt độ bắt cặp, mức nhiệt độ 45 oC, 47 oC 49 oC mồi hoạt động tốt cho băng sản phẩm sáng, rõ khơng có sản phẩm phụ (Hình 2C) Ở nhiệt độ bắt cặp kết khuyếch đại tương đương sản phẩm d-PCR Mhp so với thang Hình Sản phẩm khuyếch đại d-PCR 64 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 24 (1), 59 – 67 [A]: Băng sản phẩm 430bp Mhp s-PCR (giếng 2), băng sản phẩm 346bp Mhr s-PCR (giếng 3), băng sản phẩm Mhp Mhr d-PCR (giếng 4, 5); [B]: Kết xác định đặc hiệu d-PCR, có băng sản phẩm Mhp Mhr xuất (giếng 2), giếng cịn lại âm tính với vi khuẩn kiểm tra; [C]: Sản phẩm khuyếch đại Mhp/Mhr qua nhiệt độ bắt cặp khác (45 oC, giếng - 5; 47 oC, giếng - 8; 49 oC, giếng - 11); thang chuẩn (L) đối chứng âm (giếng 2) 3.4 Kết ứng dụng d-PCR tối ưu hóa Đỗ Tiến Duy, 2013), nhiên Mhp có khả phát thấp so với mơ phổi (kết chưa cơng bố), lượng mầm bệnh diện dịch miệng thấp Ngược lại, Mycoplasma (Mhp, Mhr) diện cao dịch tiết mũi heo (Kobish & Friis, 1996), cần có thử nghiệm sâu xác định khả phát Mhp Mhr qua mẫu dịch ngoáy mũi kỹ thuật d-PCR tối ưu nghiên cứu Kết d-PCR hoàn toàn trùng khớp với kết sPCR xét nghiệm Mhp/Mhr 11 mẫu thực địa (Bảng 3) Chỉ số Kappa đạt tối đa (1.0) Quy trình d-PCR khuyếch đại sản phẩm Mhp yếu s-PCR mẫu dịch hầu họng Mẫu dịch hầu họng thu thập dây thừng cotton phương pháp để chẩn đoán mầm bệnh vi-rút heo (Prickett cs., 2008, Prickett cs., 2010; Nguyễn Tất Toàn & Bảng Tương đồng kết d-PCR s-PCR Mẫu xét nghiệm s-PCR d-PCR T Kí hiệu Mhp Mhr Mhp Mhr M-1 - + - + M-4 - - - - M-6 - + - + M-7 + + + + M-9 + + + + M-20 + + + + H-2 + - + - H-3 + - + - D-1 + + + + 10 D-2 + - + - 11 D-6 + + + + M: Mẫu mô; D: Dịch khớp; H: Dịch hầu họng THẢO LUẬN Ở s-PCR Mhr, nhiệt độ bắt cặp tối ưu 47 oC 49 oC cho phản ứng khuyếch đại điều kiện nồng độ mồi Master mix thay đổi Ở 45 oC, sản phẩm khuyếch đại sáng rõ qua gel điện di nồng độ mồi 0,5 µM 0,75 µM (Hình 1C) Ở 43 oC, sản phẩm s-PCR tốt lượng Master mix lớn (10 µL 12 µL) Như vậy, s-PCR Mhr hoạt động tốt nhiệt độ bắt cặp 45 oC đến 49 oC với nồng độ mồi 0,5 µM 0,75 µM lượng Master mix 10 12 µL Thông số tối ưu từ s-PCR Mhp s-PCR Mhr cho phép thiết kế, chuẩn hóa quy trình d-PCR xác, nhanh chóng Quy trình d-PCR u cầu hai mồi phải có nhiệt độ bắt cặp gần giống nhau, nồng độ mồi tương thích hạn chế cạnh tranh nguyên liệu phản ứng khuyếch đại (Octavian, 1997; 65 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 24 (1), 59 – 67 Henegarui cs., 1997) Nhiệt độ bắt cặp tối ưu 45 oC đến 49 oC, nồng độ mồi từ 0,5 µM đến 0,75 µ lượng Master mix từ 10 µL đến 12 µL chọn làm sở phát triển d-PCR Blackman, N.J., & Koval, J.J (2000) Interval estimation for Cohen's kappa as a measure of agreement Statistics in Medicine, 19, 723– 741 Hình 2B chứng minh tính đặc hiệu d-PCR, khơng có phản ứng chéo với DNA đối chứng từ mầm bệnh khác Xác định khả phản ứng chéo với lồi Mycoplasma hyosynoviae Mycoplasma flocculate kí sinh khớp đường hô hấp heo (Freeman cs., 1984) cần thiết kỹ thuật xét nghiệm, nhiên nghiên cứu khơng có điều kiện thực Cả mẫu dịch khớp thu thập từ heo có biểu lâm sàng rối loạn hơ hấp viêm khớp dương tính với Mhp qua d-PCR Mhp chưa phân lập hay xác định kỹ thuật sinh học phân tử từ dịch khớp heo (Makhanon cs., 2012), tỷ lệ diện Mhr lại cao (Kobish & Friis, 1996; Makhanon cs., 2012) 79% Mycoplasma pneumonia diện 24 bệnh nhân viêm khớp (Johnson cs., 2007) Do nghiên cứu xác định tỷ lệ đồng nhiễm Mhp Mhr heo viêm khớp (áp dụng phương pháp lấy mẫu hạn chế tối đa vấy nhiễm) giúp hiểu rõ vai trò gây bệnh dịch tễ chúng Brockmeier, S., Halbur, & Thacker, E (2002) Porcine respiratory disease complex In Textbook of Polymicrobial Disease (Brogden, KA., Guthmiller, JM., eds) Washington, DC: ASM Press, 231-258 Caron, J., Ouardani, M., & Dea, S (2000) Diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis infections in pigs by PCR amplification of the p36 and p46 genes J Clin Microbiol, 38, 1390-1396 Đỗ Tiến Duy & Nguyễn Tất Toàn (2013) Khảo sát biểu lâm sàng, bệnh lý mô học phổi viêm nguyên gây bệnh heo cai sữa có triệu chứng hô hấp số trại chăn nuôi khu vực phía Nam Tạp chí KHKT Thú y, 20, 44-52 Đỗ Tiến Duy., Lê Thị Hạnh Dung., Lê Thanh Hiền., & Nguyễn Tất Tồn (2014) Tối ưu hóa phản ứng PCR phát Haemophilus parasuis heo có dấu hiệu rối loạn hô hấp từ trại chăn nuôi số tỉnh phía Nam Tạp chí KHKT Thú y, 21, 8-17 Quy trình d-PCR xây dựng, tối ưu thành cơng tương đồng hồn tồn với s-PCR việc xác định Mhp Mhr mẫu đối chứng mẫu bệnh phẩm (phổi, dịch khớp, dịch miệng) thu thập thực địa Độ nhạy d-PCR cao khuyếch đại Mhp (20,9 copies/ng) Mhr (15,0 copies/ng) d-PCR tối ưu nồng độ mồi Mhp16s-F; Mhp16s-R; Mhr37p-F; Mhr37p-R 0,5; 0,5; 0,5; 0,5 µM; thể tích Master mix 12 µL, nhiệt độ bắt cặp 45 oC Freeman, M.J., Armstrong, C.H., & FreemanSands, L.L (1984) Serological crossreactivity of porcine reference antisera to Mycoplasma hyopneumoniae, M flocculare, M hyorhinis and M hyosynoviae indicated by the enzyme-linked immunosorbent assay, complement fixation and indirect hemagglutination tests Can J Comp Med, 48, 202-207 TÀI LIỆU THAM KHẢO Henegarui, O., Heerema, N.A., Dlouhy, S.R., Vance, G.H & Vogt, P (1997) Multiplex PCR: Critical parameters and step –by- step protocol BioTechniques, 23, 504-511 Barate, A.K., Lee, H.Y., Jeong, H.W., Lam, Q.T., Joo, H.G & Hahn, T.W (2012) An improved multiplex PCR for diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyohinis Korean Journal of Veterinary Research, 52, 39-43 Johnson, S.M., Bruckner, F., & Collins, D (2007) Distribution of Mycoplasma 66 AGU International Journal of Sciences – 2020, Vol 24 (1), 59 – 67 Nguyễn Tất Toàn & Đỗ Tiến Duy (2013) Xác định số virus gây rối loạn hô hấp heo qua mẫu dịch xoang miệng mẫu mơ Tạp chí KHKT Thú y, 20, 41-49 pneumoniae and Mycoplasma salivarium in the synovial fluid of arthritis patient Journal of Clinical Microbiology, 45, 953–957 Kobayashi, H., Morozumi, T., Miyamoto, C., & Shimizu, M (1995) Mycoplasma hyorhinis infection levels in lung of piglets with Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome J Vet Med Sci, 58, 109-113 Nguyễn Thị Phước Ninh., Đỗ Tiến Duy., Nguyễn Tất Toàn., Nguyễn Ngọc Tuân., & Trần Thị Dân (2006) Phân lập Mycoplasma hyopneumoniae số vi khuẩn liên quan đến bệnh hô hấp phổi heo Tạp chí KHKT Thú Y, 13, 12-15 Kobisch, M., & Friis, N.F (1996) Swine mycoplasmoses Revue Scientifique et Technique, 15, 1569–1605 Octavian, H (1997) Troubleshooting for PCR and multiplex PCR Yale University, US Retrieved from medicine.yale.edu/labs/henegariu/tavi/trblesht html Lin, J.H., Chen, S.P., Yeh, K.S., & Weng, C.N (2006) Mycoplasma hyorhinis in Taiwan: Diagnosis and isolation of swine pneumonia pathogen Veterinary Microbiology, 15, 111– 116 Lobo, E., Poveda, C., Gupta, R., Hernández, Y., Ramírez, A., & (2011) Mycoplasmas hyorhinis regions of Cuba Diagnosis Braz 42, 721-725 Prickett, J.R., Kim, K., Simer, R., Yoon, K.J, & Zimmerman, J (2008) Oral-fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type infections Journal of Swine Health and Production, 16, 86-91 Suarez, A., Poveda, J.B in different J Microbiol, Prickett, J.R., & Zimmerman, J,J (2010) The development of oral fluid-based diagnostics and applications in veterinary medicine Animal Health Reseach Reviews, 11, 207-216 Makhanon, M., Tummaruk, P., Thongkamkoon, P., Thanawongnuwech, R., & Prapasarakul, N (2012) Comparison of detection procedures of Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyosynoviae, and Mycoplasma hyorhinis in lungs, tonsils, and synovial fluid of slaughtered pigs and their distributions in Thailand Trop Ani Health Prod, 44, 313–318 Thacker, E.L., & Thanawongnuwech, R (2004) Porcine respiratory disease complex (PRDC) Thai Journal of Veterinary Medicine, 32, 125134 67 ... vi-rút heo (Prickett cs., 2008, Prickett cs., 2010; Nguyễn Tất Toàn & Bảng Tương đồng kết d-PCR s-PCR Mẫu xét nghiệm s-PCR d-PCR T Kí hiệu Mhp Mhr Mhp Mhr M-1 - + - + M-4 - - - - M-6 - + - + M-7... M-6 - + - + M-7 + + + + M-9 + + + + M-20 + + + + H-2 + - + - H-3 + - + - D-1 + + + + 10 D-2 + - + - 11 D-6 + + + + M: Mẫu mô; D: Dịch khớp; H: Dịch hầu họng THẢO LUẬN Ở s-PCR Mhr, nhiệt độ bắt... 21, 8-1 7 Quy trình d-PCR xây dựng, tối ưu thành cơng tương đồng hồn tồn với s-PCR việc xác định Mhp Mhr mẫu đối chứng mẫu bệnh phẩm (phổi, dịch khớp, dịch miệng) thu thập thực địa Độ nhạy d-PCR