Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố kỹ thuật sử dụng tinh trùng đã xác định tính biệt cái đến khả năng sản xuất phôi in vitro và in vivo trên bò Holstein Friesian

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TINH TRÙNG ĐÃ XÁC ĐỊNH TÍNH BIỆT CÁI ĐẾN KHẢ NĂNG SẢN XUẤT PHÔI IN VITRO VÀ IN VIVO TRÊN BÒ HOLSTEIN FRIESIAN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP THÁI NGUYÊN - 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TINH TRÙNG ĐÃ XÁC ĐỊNH TÍNH BIỆT CÁI ĐẾN KHẢ NĂNG SẢN XUẤT PHÔI IN VITRO VÀ IN VIVO TRÊN BÒ HOLSTEIN FRIESIAN Chuyên ngành: Chăn nuôi Mã số: 60.62.01.05 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Phan Đình Thắm TS Phan Lê Sơn THÁI NGUYÊN - 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn ghi nhận, cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Tuyết Nhung ii LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu, Phòng quản lý đào tạo Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi thú y Thầy giáo, Cô giáo Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, giảng dạy dìu dắt trình học tập hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Chăn nuôi, quan chủ quản nơi công tác tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành trình học luận văn Để hoàn thành luận văn này, xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, người hướng dẫn khoa học PGS.TS Phan Đình Thắm TS Phan Lê Sơn tận tình giúp đỡ suốt trình hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo TS Đào Đức Thà động viên, dạy bảo, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để hoàn thành luận văn Xin cảm ơn giúp đỡ Cô, Chú, Anh, Chị, Em Bộ môn Sinh lý, Sinh sản Tập tính vật nuôi tạo điều kiện, giúp đỡ trình công tác học tập Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Tuyết Nhung iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Buồng trứng bò 1.1.1 Cấu tạo buồng trứng 1.1.2 Chức buồng trứng 1.1.3 Chu kỳ buồng trứng 1.2 Nang trứng bò 1.2.1 Sự hình thành nang trứng bò 1.2.2 Chức nang trứng .7 1.3 Tế bào trứng bò 1.3.1 Sự hình thành, phát triển tế bào trứng 1.3.2 Cấu tạo tế bào trứng .9 1.3.3 Cơ chế thần kinh thể dịch điều khiển phát triển noãn nang .10 1.4 Tinh trùng 12 1.4.1 Đặc điểm sinh lý cấu tạo tinh trùng 12 1.4.2 Các phương pháp xác định giới tính tinh trùng 13 1.4.3 Cơ sở xác định giới tính tinh trùng phương pháp dòng chảy tế bào (flow cytometric sexing) 16 1.5 Sản xuất phôi in vitro 17 1.5.1 Hoạt hóa tinh trùng 18 iv 1.5.2 Quá trình thụ tinh 20 1.5.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình thụ tinh in vitro 21 1.5.4 Sự phát triển phôi 22 1.6 Sản xuất phôi in vivo 24 1.7 Tình hình nghiên cứu nước 25 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 27 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu .27 2.2 Nội dung nghiên cứu 27 2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng mật độ tinh trùng xác định tính biệt đến khả sản xuất phôi in vitro .27 2.2.2 Nội dung 2: Ảnh hưởng thời gian phối tinh trùng xác định tính biệt đến khả sản xuất phôi in vivo 28 2.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng số liều tinh trùng xác định tính biệt đến khả sản xuất phôi in vivo 28 2.2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng vị trí bơm tinh trùng xác định tính biệt đến khả sản xuất phôi in vivo 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Phương pháp sản xuất phôi in vitro 29 2.3.2 Phương pháp sản xuất phôi in vivo 32 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 34 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Ảnh hưởng mật độ tinh trùng xác định tính biệt đến khả sản xuất phôi in vitro 35 3.1.1.Thu tế bào trứng 35 3.1.2 Chất lượng tế bào trứng .37 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn ghi nhận, cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Tuyết Nhung vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BSA : Bovine Serum Albumin FCS : Foetal Calf serum FSH : Follicle Stimulating Hormone GnRH : Gonadotropin Releasing Hormone HEPES : N-(2 Hydroxyethyl) piperazine-N’-(2-ethanesulforic acid) HF : Holstein Friesian LH : Luteinizing Hormone LTH : Luteo Tropic Hormone PRH : Prolactin Releasing Hormone MEM : Minimum Essential Medium PGF2α : Prostaglandin F2α SOF : Synthetic oviduct fluid TCM-199 : Tisue culture medium 199 PCR : Polymerase chain reaction NST : Nhiễm sắc thể vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Số lượng tế bào trứng thu 35 Bảng 3.2: Chất lượng tế bào trứng theo mức độ từ tốt đến xấu 37 Bảng 3.3: Hợp tử thu sau thụ tinh 39 Bảng 3.4: Phôi dâu phôi nang thu sau thụ tinh nuôi phôi in vitro ngày 42 Bảng 3.5: Tỉ lệ bò động dục, tỉ lệ bò phối giống số lượng thể vàng thu 45 Bảng 3.6: Số lượng phôi dâu phôi nang thu 47 Bảng 3.7: Phôi đủ tiêu chuẩn cấy (Loại A, B) phôi không đủ tiêu chuẩn cấy (Loại C, D) 49 Bảng 3.8: Tỉ lệ bò động dục, tỉ lệ bò phối giống số lượng thể vàng thu 51 Bảng 3.9: Số lượng phôi thu phối bò gây rụng trứng nhiều liều tinh liều tinh 53 Bảng 3.10: Phôi đủ tiêu chuẩn cấy (Loại A, B) phôi không đủ tiêu chuẩn cấy loại C, D) 54 Bảng 3.11: Số lượng thể vàng thu thời điểm thu phôi 56 Bảng 3.12: Số lượng phôi thu 57 Bảng 3.13: Phôi đủ tiêu chuẩn cấy (Loại A, B) phôi không đủ tiêu chuẩn cấy (Loại C, D) 59 viii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cấu tạo buồng trứng Hình 1.2: Sự biến đổi hàm lượng hormone chu kỳ động dục bò 11 Hình 1.3: Sơ lược hệ thống xác định giới tính tinh trùng 17 Hình 1.4: Các giai đoạn phát triển phôi 23 Hình 2.1: Phác đồ gây rụng trứng nhiều 33 Hình 3.1: Thu tế bào trứng phương pháp chọc – hút 36 Hình 3.2:Tế bào trứng 38 Hình 3.3: Hợp tử phân chia 39 Hình 3.4: Biểu đồ đánh giá bình quân số lượng hợp tử phân chia/buồng trứng mật độ tinh trùng 40 Hình 3.5: Đánh giá chất lượng hợp tử phân chia kính hiển vi 42 Hình 3.6: Phôi thu 43 Hình 3.7: Biểu đồ đánh giá bình quân số lượng phôi đủ tiêu chuẩn cấy/buồng trứng mật độ tinh trùng 44 Hình 3.8: Biểu đồ đánh giá bình quân số lượng phôi đủ tiêu chuẩn cấy/bò/lần mức độ thời gian phối giống 50 Hình 3.9: Buồng trứng bò sau thu phôi (ngày thứ sau động dục) 52 Hình 3.10: Biểu đồ đánh giá bình quân số lượng phôi đủ tiêu chuẩn cấy/bò/lần phối giống cho bò nhận phôi liều tinh liều tinh 55 Hình 3.11: Vị trí bơm tinh vào sừng tử cung 57 Hình 3.12: Biểu đồ đánh giá bình quân số lượng phôi đủ tiêu chuẩn cấy/bò/lần bơm tinh vào thân tử cung sừng tử cung 60 viii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cấu tạo buồng trứng Hình 1.2: Sự biến đổi hàm lượng hormone chu kỳ động dục bò 11 Hình 1.3: Sơ lược hệ thống xác định giới tính tinh trùng 17 Hình 1.4: Các giai đoạn phát triển phôi 23 Hình 2.1: Phác đồ gây rụng trứng nhiều 33 Hình 3.1: Thu tế bào trứng phương pháp chọc – hút 36 Hình 3.2:Tế bào trứng 38 Hình 3.3: Hợp tử phân chia 39 Hình 3.4: Biểu đồ đánh giá bình quân số lượng hợp tử phân chia/buồng trứng mật độ tinh trùng 40 Hình 3.5: Đánh giá chất lượng hợp tử phân chia kính hiển vi 42 Hình 3.6: Phôi thu 43 Hình 3.7: Biểu đồ đánh giá bình quân số lượng phôi đủ tiêu chuẩn cấy/buồng trứng mật độ tinh trùng 44 Hình 3.8: Biểu đồ đánh giá bình quân số lượng phôi đủ tiêu chuẩn cấy/bò/lần mức độ thời gian phối giống 50 Hình 3.9: Buồng trứng bò sau thu phôi (ngày thứ sau động dục) 52 Hình 3.10: Biểu đồ đánh giá bình quân số lượng phôi đủ tiêu chuẩn cấy/bò/lần phối giống cho bò nhận phôi liều tinh liều tinh 55 Hình 3.11: Vị trí bơm tinh vào sừng tử cung 57 Hình 3.12: Biểu đồ đánh giá bình quân số lượng phôi đủ tiêu chuẩn cấy/bò/lần bơm tinh vào thân tử cung sừng tử cung 60 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Có ảnh hưởng rõ rệt mật độ tinh trùng xác định tính biệt đến kết sản xuất phôi in vitro Mật độ tinh trùng 2,5 x 106 cho số lượng phôi dâu phôi nang đủ tiêu chuẩn cấy/buồng trứng cao (P < 0,05) mật độ tinh trùng 1,6 x 106 tương ứng: 2,32 phôi/buồng trứng so với 1,9 phôi/buồng trứng Không có ảnh hưởng thời gian phối giống cho bò cho phôi tinh trùng xác định tính biệt đến kết sản xuất phôi (P > 0,05) Bình quân số lượng phôi đủ tiêu chuẩn cấy/bò/lần tiến hành phối giống 10 giờ, 12 14 tương ứng: 3,90; 4,20 4,30 phôi/bò/lần Có ảnh hưởng rõ rệt số liều tinh trùng xác định tính biệt đến khả sản xuất phôi Phối liều tinh cho bình quân số lượng phôi đủ tiêu chuẩn cấy/bò/lần cao (P < 0,05) phối liều tinh, tương ứng: 4,83 so với 3,92 phôi/bò/lần Có ảnh hưởng rõ rệt vị trí bơm tinh trùng xác định tính biệt đến khả sản xuất phôi Bơm tinh vào sừng tử cung cho bình quân số lượng phôi đủ tiêu chuẩn cấy/bò/lần cao (P < 0,05) bơm tinh vào thân tử cung phối giống cho bò cho phôi, tương ứng: 5,57 so với 4,50 phôi/bò/lần Đề nghị - Tinh trùng xác định tính biệt có khả sản xuất phôi in vitro Sử dụng mật độ tinh trùng xác định tính biệt mật độ 2,5 x 106/ml - Tinh trùng xác định tính biệt có khả sản xuất phôi in vivo Phối giống cho bò nhận phôi khoảng thời gian 10 – 14 sau bò xuất động dục, sử dụng liều tinh, bơm tinh vào sừng tử cung (mỗi sừng tử cung liều) 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Chung Anh Dũng, Lê Công Thiện, Hoàng Ngọc Minh, Phạm Thị Huỳnh Lan (2010), “Thử nghiệm sản xuất phôi bò in vitro xác định trước giới tính”, Tạp chí Chăn nuôi (4), tr 36 – 39 Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Quản Xuân Hữu, Nguyễn Trung Thành, Bùi Linh Chi, Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thùy Anh, Nguyễn Việt Linh, Bùi Xuân Nguyên (2003), “Kết thụ tinh ống nghiệm cấy phôi bò lai Sind”, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 699-702 Nguyễn Văn Lý (2006), Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến kết thụ tinh ống nghiệm bò Việt Nam, Luận án tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Chăn nuôi, tr 140-143 Phan Lê Sơn (2013), Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi ống nghiệm, Luận án tiến sỹ Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tr 117-118 Phan Lê Sơn (2015), “Khả sản xuất phôi in vitro tinh trùng phân biệt giới tính cái”, Tạp chí khoa học công nghệ chăn nuôi, số 51, tr 75 – 82 Tiếng Anh Adams G P., Matteri R, L,, Ginther O J (1992), “Effect of progesterone on ovarian follicles, emergence of follicular waves and circulating follicle-stimulating hormone in heifers”, Journal of Reproduction and Fertility, 95, pp 627-640 Ahmad N., Townsend E C., Dailey R A., Inskeep E.K (1997), “Relationship of hormonal patterns and fertility to occurrence of two or three waves of ovarian follicles, before and after breeding, in beef cows and heifers”, Animal Reproduction Science, 49, pp 13-28 Bavister B D (1996), “Culture of preimplantation embryos: facts and artifacts”, Hum Reprod Update, 1, pp 91-148 Bearden H J., Fuquay J W (2000), “The female reproduction system”, Applied Animal reproduction, Prentice Hall, InC, pp 7-20 63 10 Blondin P., Beaulieu M., Fournier V., Morin N., Crawford L., Madan P., King W A (2009), “Analysis of bovine sexed for IVF from sorting to the embryo”, Theriogenology, 71, pp.30-38 11 Brackett B G., Oliphan G (1975), “Capacitation of rabbit spermatozoa in vitro”, Biology of Reproduction, 12, pp 260-274 12 Campbell B K., Scaramuzzi R J., Webb R (1995), “Control of antral follicle development and selection in sheep and cattle”, Journal of Reproduction and fertility, 49, pp 335-350 13 Carvalho J O., Satori R., Machado G M., Mourao G B., Dode M A N (2010), “Quality assessement of bovine cryopreserved sperm after sexing by flow cytometry and their use in vitro embryo production”, Theriogenology, 74, pp.1521-1530 14 De Loos F., Kastrop P., Vanmaurik P., Vanbeneden T H., Kruip T A M (1991), “Heterologous cell contacts and metabolic coupling in bovine cumulus oocyte complexes”, Molecular Reproduction and Development, 28, pp 255-259 15 Erickson B H (1965), “Symposium on atomic energy in animal science: Radiation effects on gonadal development in farm animals”, Journal of Animal Science, 24, pp 568-583 16 Fry R C., Naill E M., Sympson T J., Squires T J., Raynold J (1997), “The collection oocytes from bovine ovaries”, Theriogenology, 47, pp 977-987 17 Ganner D L (2006), “Flow cytometric sexing of mammalian sperm”, Theriogenology, 65, pp 943-957 18 Ginther O J., Knopf L., Kastelic J P (1989), “Temposal associations among ovarian events in cattle during estrus cycles with two or three follicular waves”, Journal of Reproduction and Fertility, 108, pp 271-279 19 Golberg E H., Boyse E A., Bennett D., Scheid M., Carswell E A (1971) “Serologycal demonstration of H-Y (male) antigen on mouse sperm”, Mature 232, pp 43 20 Goodhand K L., Staines M E., Hutchinson J S M., Broadbent P J (2000), “In vivo oocyte recovery and in vitro embryo production from bovine oocyte doner treated with progestagen, oestradiol”, Animal reproduction, 63, pp 145-185 64 21 Hayakawa H., Hirai T., Takimoto A., Ideta A., Aoyagi Y (2009), “Superrovulation and embryo transfer in Holstein cattle using sexed sperm”, Theriogenology, 71, pp 68-73 22 Heres A A., Merton J S., Haseleger W., Van A M., Wagertendenkedelecuw and Kemp B (1996), “Optimization of sperm oocyte ration during IVF of bovine cumulus oocyte complexes”, Theriogenology, 45, pp 226 23 Ijaz A., Lambert R D., Sirard M A (1994), “in vitro cultured bovine granulose and oviductal cells secrete sperm motility-maintaining factor(s)”, Molecular Reproduction and Development, 37, pp 54-60 24 Imai K., Tagawa M., Yoshioka H., Matoba S., Narita M., Inaba Y., Aikawa Y., Ohtake M., Kobayashi S (2006), “The effiency of embryo production by ovum pick-up and in vitro fertilization in cattle”, Journal of Reproduction and Development, 52, pp 19-29 25 Iwasaki, S., Kono, T., Nakahara, T., Shioya, Y., Fukushima, M., and Hanada, A (1987), “New methods for the recovery of oocytes from bovine ovarian tissue in relation to in vitro maturation and fertilization” Japanese jounal of Animal Reproduction (33), 188-192 26 Johnson L A, Welch G R (1999) “Sex preselection: high-speed flow cytometric sorting of X- and Y-sperm for maximum efficiency”, Theriogenology, 52:1323–413 27 Kaimio I., Mikkola M., Lindeberg H., Heikkinen J., Hasler JF., Taponen J (2913), “Embryo production with sex-sorted semen in superovulated dairy heifers and cows”, Theriogenology, 80, pp 950-954 28 Kaska L., Smorag Z (1984), “Number and quality of oocytes in relation to age of cattle”, Animal Reproduction Science, 7, pp 451-460 29 Larson J E., Lamb G C., Funelll B J., Bird S., Martins A., Rodgers J C (2010), “Embryo prodution in superovulted Angus cows insemination four times with sex-sorted or conventional, frozen-thawed semen”, Theriogenology, 73, pp 698-307 30 Li C., Zhu., Xue S L., Zhang S L., Ma Z., Shi Z D (2009), “Immunization against inhibin enchages both embryo quantity and quality in Holstein heifers after superovulation and insemination with sex-sorted semen”, Theriogenology, 71, pp.1011-1017 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Sữa nguồn cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng đời sống hàng ngày cho người Xã hội phát triển, điều kiện sống nâng cao nhu cầu sử dụng sữa hàng ngày tăng theo Tuy nhiên, theo báo cáo tới năm 2014 việc gia tăng đàn bò sữa nước ta chậm, không đáp ứng đủ nhu cầu dùng sữa người tiêu dùng Để giải vấn đề trên, việc áp dụng biện pháp kỹ thuật cao cho công nghệ sinh sản nhằm nâng cao số lượng chất lượng sữa cần thiết Công nghệ cấy truyền phôi công cụ hữu ích để thực điều Cấy truyền phôi bao gồm, kỹ thuật gây rụng trứng nhiều để sản xuất phôi in vivo, tạo phôi in vitro từ kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm, chia cắt phôi, cấy phôi cho bò nhận Sự thành công công nghệ cấy truyền phôi cho phép khai thác tối đa bò có giá trị di truyền cao, phổ biến nhân nhanh giá trị di truyền vào thực tế sản xuất, rút ngắn tối đa thời gian cải tiến lai tạo giống Song, khả ứng dụng vào thực tế sản xuất công nghệ cấy truyền phôi nhiều hạn chế Một số hạn chế phôi sản xuất không xác định tính biệt nên kiểm soát số bê đực, bê sinh Ở nước ta, chăn nuôi bò sữa, bê đực sau sinh thường bị giết thịt với giá thấp nhiều so với bê làm ảnh hưởng tới thu nhập người chăn nuôi làm hạn chế việc tăng nhanh số lượng đàn bò sữa nước ta Cùng với phát triển nhanh khoa học kỹ thuật, đặc biệt lĩnh vực công nghệ sinh sản, nhà khoa học nghiên cứu thành công thương mại hóa tinh trùng tính biệt Thành công này, mở triển vọng ngành chăn nuôi bò sữa nước ta, cho phép sản xuất phôi in MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Sữa nguồn cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng đời sống hàng ngày cho người Xã hội phát triển, điều kiện sống nâng cao nhu cầu sử dụng sữa hàng ngày tăng theo Tuy nhiên, theo báo cáo tới năm 2014 việc gia tăng đàn bò sữa nước ta chậm, không đáp ứng đủ nhu cầu dùng sữa người tiêu dùng Để giải vấn đề trên, việc áp dụng biện pháp kỹ thuật cao cho công nghệ sinh sản nhằm nâng cao số lượng chất lượng sữa cần thiết Công nghệ cấy truyền phôi công cụ hữu ích để thực điều Cấy truyền phôi bao gồm, kỹ thuật gây rụng trứng nhiều để sản xuất phôi in vivo, tạo phôi in vitro từ kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm, chia cắt phôi, cấy phôi cho bò nhận Sự thành công công nghệ cấy truyền phôi cho phép khai thác tối đa bò có giá trị di truyền cao, phổ biến nhân nhanh giá trị di truyền vào thực tế sản xuất, rút ngắn tối đa thời gian cải tiến lai tạo giống Song, khả ứng dụng vào thực tế sản xuất công nghệ cấy truyền phôi nhiều hạn chế Một số hạn chế phôi sản xuất không xác định tính biệt nên kiểm soát số bê đực, bê sinh Ở nước ta, chăn nuôi bò sữa, bê đực sau sinh thường bị giết thịt với giá thấp nhiều so với bê làm ảnh hưởng tới thu nhập người chăn nuôi làm hạn chế việc tăng nhanh số lượng đàn bò sữa nước ta Cùng với phát triển nhanh khoa học kỹ thuật, đặc biệt lĩnh vực công nghệ sinh sản, nhà khoa học nghiên cứu thành công thương mại hóa tinh trùng tính biệt Thành công này, mở triển vọng ngành chăn nuôi bò sữa nước ta, cho phép sản xuất phôi in 67 52 Tubman L M., Brink Z., Suh T K., Seidel Jr G E (2004), “Characteristics of calves produced with sperm sexed by flow cytometry/cell sorting”, J Anim Sci, 82, pp:1029–36 53 Underwood S L., Bathgate R., Pereira D C., Castro A., Thomson P C., Maxwell W M C., Evans G (2010), “Embryo production after in viro fertilization with frozen-thawed, sex-sorted, re-frozen-thawed bull sperm”, Theriogenology, 73, pp 97-102 54 Williams T J (1986), “A technique for sexing mouse embryos by a visual colorimetric assay of the X – lingked enzyme, glucose-6-phosphat dehydrogenase”, Theriogenology, 25, pp 733 55 Wilson R D., Fricke P M., Leibfried-Rutledge M L., Rutledge J J., Syverson C M., Wwigel K A (2006), “In vitro production of bovine embryo using sex-sorted sperm”, Theriogenology, 65, pp 1007-1015 56 Zhang M., Lu K H., Seidel G E (2003), “Development of bovine embryos after in vitro fertilization of oocytes with flow cytometrically sorted, stained and unsorted sperm”, Theriogenology, 60, pp:1657–1663 57 Ziebe S., Petersen K., Lindenberg S., Anderson A G., Gabrielsen A., Andersen A N (1997), “Embryo morphology or cleavage stage: How to select the best embryo for transfer after in vitro fertilization”, Human Reproduction, 12, pp 1545-1549 68 PHỤ LỤC Máy móc, dụng cụ thí nghiệm - Máy siêu âm khám bò: hình siêu âm HS-2000, HONDA, đầu dò siêu âm Nhật Bản - Các loại kính hiển vi soi nổi: Kính hiển vi vi thao tác Nikon TE 300; Kính hiển vi soi Wild M3B; Kính hiển vi soi Leica MZ6; Kính hiển vi soi Olympus SD 30; Kính hiển vi Olympus CH30 - Tủ nuôi cấy CO2 – Sanyo CO2 Incubator - Buồng vô trùng Labcaire - Cân phân tích Precisa - Máy li tâm Universal 32R - Bồn nước ổn nhiệt Memer Waterbath - Máy ổn nhiệt HT 50 - Máy rửa dụng cụ siêu âm - Tủ sấy khô SL Shel lab - Tủ sấy ẩm Sanyo Incubator - Tủ sấy áp suất Tomy autoclave SS-325 - Máy đông lạnh CL – 2000 - Buồng đếm Thoma - Pippetteman cỡ: 100µl, 200 µl, 1000 µl - Các loại đĩa petri: Falcon disk, Grainer disk, Nunc disk - Pippete pasteur 69 - Găng tay vô trùng, bơm tiêm ml, kim tiêm 18G, microfilter 0,22 µm - Đĩa petrri 35 mm, 90 mm - Dụng cụ đặt CIRD - Catheter để rửa phôi - Lọ đựng dung dịch 500 ml - Cốc lọc phôi - Sy ranh loại: ml, 10 ml, 20 ml 50 ml Hóa chất thí nghiệm Sucrose C12H22O11 196-00015 Wako Japan Disodium Hydrogenphosphate Na2HPO4 197-02865 Wako Japan D(+) – Glucose C6H12O6 041-00595 Wako Japan Potassium Dihydrogenphosphate KH2PO4 165-04242 Wako Japan Potassium Chloride KCl 163-03545 Wako Japan Sodium Hydrogen Carbonate NaHCO3 191-01305 Wako Japan Sodium Chloride NaCl 191-01665 Wako Japan Sodium Dihydrogen Phosphate Dihydrate NaH2CO3.2H2O 192-02815 Wako Japan Calcium Chloride Dihydrate CaCl2.2H2O 031-00435 Wako Japan Phenol Red Solution 0,5% P0290 Sigma Magnesium Chloride Hexahydrate MgCl2.6H2O 131-00162 Wako Japan Ethylene Glycol C2H6O2 Prolabo Germany 70 Glycerol Prolabo Germany Medium 199 3769 GIBCO BME Amino Acide Solution 50x B-6766 Sigma MEM Non-Essential Amino Acide Solution 100x 02380 GIBCO Penicilin G Potassium 200.000 Meiji Seika Kaisha LTD Tokyo Japan Novo-Heparin Pharmaceutical Products LTD V ventis Japan Streptomycin Sulphate 1g Meiji Kaisna LTD Tokyo Japan L-Glutamic Acid G-4815 Sigma Albumin, Bovine A-4378 Sigma Caffein Sodium Benzoate C-4144 Sigma L(+)-Lactic Acid L-4388 Sigma Albumin, Bovine A-7030 Sigma Sodium Pyruvate 199-03062 Wako Japan Các loại hormone - FSH để gây rụng trứng nhiều - PGF2α để phá thể vàng - CIRD để gây rụng trứng nhiều - Estradiol Chuẩn bị môi trường 4.1 Môi trường hút tế bào trứng (mDPBS) Pha môi trường PBS (-) NaCl 8,0g 71 KCl 0,2g Na2HPO4 1,15g KH2PO4 0,2g Nước cất khử ion 700ml Pha môi trường PBS (+) CaCl2 0,1g MgCl2.6H2O 0,1g Nước cất khử ion 200ml Sau chuẩn bị xong, rót từ từ môi trường PBS (+) vào môi trường PBS (-) để tránh kết tủa Sau bổ sung thêm 100ml nước cất khử ion để đủ 1000ml Sau đó, bổ sung thêm 1,0 g glucose, 0,036 g Sodium pyruvate mDPBS Sau lọc seize bảo quản tủ lạnh Để siêu âm hút tế bào trứng sử dụng môi trường mDPBS bổ sung 2% heparin 100.000iu penicilin/ml + 100µl streptomycin/ml 4.2 Môi trường lọc tìm trứng Sử dụng môi trương mDPBS, bổ sung 5% huyết bê sinh 100.000iu penicilin/ml + 100µl streptomycin/ml 4.3 Môi trường nuôi thành thục tế bào trứng TCM 199 47,5 ml CS 2,5 ml Penicilin-G 10.000IU (100IU/ml) Streptomycin Sulfate 10mg (100µg/ml) vivo in vitro mang tính biệt Tuy nhiên, kết sản xuất phôi từ tinh trùng xác định tính biệt có nhiều biến động số lượng tinh trùng mang tính biệt cái/cọng rạ thấp nhiều so với tinh chưa xác định tính biệt sức sống tinh trùng phần bị ảnh hưởng trải qua trình phân ly giới tính Chính lẽ đó, tiến hành đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố kỹ thuật sử dụng tinh trùng xác định tính biệt đến khả sản xuất phôi in vitro in vivo bò Holstein Friesian” Mục tiêu đề tài - Đánh giá ảnh hưởng số yếu tố kỹ thuật sử dụng tinh trùng xác định tính biệt đến khả sản xuất phôi in vitro in vivo - Xác định số yếu tố kỹ thuật sử dụng tinh trùng xác định tính biệt tăng số lượng chất lượng phôi in vitro in vivo thu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - Nâng cao cường độ chọn lọc giới tính bò - Tăng khả ứng dụng công nghệ cấy truyền phôi vào thực tế sản xuất - Hạ giá thành bê sinh công nghệ cấy truyền phôi 73 Heparin (Novo-heparin: 5000IU/ml) 50 µl 4.4.4.Chuẩn bị dung dịch rửa tế bào trứng Dung dịch BO 40ml BSA 400mg 4.4.5 Dung dịch thụ tinh ống nghiệm Dung dịch BO 10ml BSA 200mg 4.5 Chuẩn bị môi trường nuôi phôi (CR1aa) Dung dịch A NaCl 6,7031g KCl 0,2311g Na Pyruvate 0,0440g NaHCO3 2,2011g Phenol Red 5% 2ml Nước cất khử ion Thêm đủ 760ml Dung dịch B Hemicalcium lactate 0,5996g Nước cất khử ion Thêm đủ 200ml Môi trường CR1aa Dung dịch A 76ml Dung dịch B 20ml BME Essential Amino Acids 2ml MEM Non Essential Amino Acids 1ml 74 L-Glutamic Acid (2mg/ml) 1ml BSA 3mg/ml Penicilin-G 10.000IU (100IU/ml) Streptomycin Sulfate 10mg (100µg/ml) Môi trường đông lạnh phôi - VIGRO Freeze medium [...]... hưởng của một số yếu tố kỹ thuật sử dụng tinh trùng đã xác định tính biệt cái đến khả năng sản xuất phôi in vitro và in vivo trên bò Holstein Friesian 2 Mục tiêu của đề tài - Đánh giá được sự ảnh hưởng của một số yếu tố kỹ thuật sử dụng tinh trùng đã xác định tính biệt cái đến khả năng sản xuất phôi in vitro và in vivo - Xác định được một số yếu tố kỹ thuật sử dụng tinh trùng đã xác định tính biệt cái. .. định tính biệt cái đến khả năng sản xuất phôi cái in vitro .27 2.2.2 Nội dung 2: Ảnh hưởng của thời gian phối tinh trùng đã xác định tính biệt cái đến khả năng sản xuất phôi cái in vivo 28 2.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của số liều tinh trùng đã xác định tính biệt cái đến khả năng sản xuất phôi cái in vivo 28 2.2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí bơm tinh trùng đã xác định. .. hiệu quả kinh tế trong việc sử dụng tinh trùng xác định giới tính (Seidel, 2003)[46], sử dụng tinh trùng xác định giới tính để sản xuất phôi in vitro (Wilson và cs, 2006) [55], đánh giá tinh trùng phân biệt giới tính trong sản xuất phôi in vitro (Blondin và cs, 2009) [10], nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian thụ tinh ở bò sữa và bò thịt khi sử dụng tinh xác định giới tính để phối giống (Sales và cs, 2011)... phôi in 2 vivo và in vitro mang tính biệt cái Tuy nhiên, kết quả sản xuất phôi từ tinh trùng đã xác định tính biệt cái đang có nhiều biến động do là số lượng tinh trùng mang tính biệt cái/ cọng rạ thấp hơn rất nhiều so với tinh chưa xác định tính biệt cái và sức sống của tinh trùng phần nào bị ảnh hưởng do trải qua quá trình phân ly giới tính Chính vì lẽ đó, chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng. .. đã xác định tính biệt cái đến khả năng sản xuất phôi cái in vivo 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Phương pháp sản xuất phôi in vitro 29 2.3.2 Phương pháp sản xuất phôi in vivo 32 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 34 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Ảnh hưởng của mật độ tinh trùng đã xác định tính biệt cái đến khả năng sản xuất phôi cái in vitro ... tăng khả năng ứng dụng công nghệ cấy truyền phôi vào thực tế sản xuất Giúp hạ giá thành bê cái sinh ra từ việc sử dụng tinh trùng phân biệt giới tính các 26 nhà khoa học đã dùng tinh trùng phân biệt giới tính để phối giống cho bò được gây rụng trứng nhiều nhằm tạo phôi cái in vivo và tạo phôi cái in vitro Do một cọng tinh có thể thu được từ 3-5 phôi in vivo và hàng chục phôi in vitro Nghiên cứu khả năng. .. đổi chất của giao tử đực và giao tử cái Quá trình này chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố như: Thời gian thụ tinh giữa trứng và tinh trùng, Chất lượng tế bào trứng, màng cumulus, tế bào chất Và một trong những yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến kết quả thụ tinh là ảnh hưởng của số lượng tinh trùng đến quá trình thụ tinh Hầu hết kỹ thuật thụ tinh in vitro sử dụng mật độ tinh trùng khoảng 1 x 106 ml và quá trình... giữa các con đực (Lu và cs, 2004) [34] Hayakawa và cs (2009) [21], đã tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của số lượng tinh trùng đến kết quả phôi thu được khi sử dụng tinh phân biệt giới tính thấy rằng, số lượng tinh trùng ảnh hưởng đên kết quả sản xuất phôi in vivo Ông sử dụng liều 2 triệu, 5 triệu và 10 triệu tinh trùng và phối giống 2 lần ở khoảng cách 12 giờ ở bò thu được tỉ lệ phôi đủ tiêu chuẩn... Các phương pháp xác định giới tính tinh trùng 13 1.4.3 Cơ sở xác định giới tính tinh trùng bằng phương pháp dòng chảy tế bào (flow cytometric sexing) 16 1.5 Sản xuất phôi in vitro 17 1.5.1 Hoạt hóa tinh trùng 18 16 về thụ tinh nhân tạo cho bò sữa bằng tinh giới tính, sử dụng tinh đã xác định giới tính trong gây rụng trứng nhiều và sản xuất phôi (Schenk và cs, 2006) [44],... trứng và 54,55% Bình quân số lượng phôi dâu và phôi nang thu được/buồng trứng, tỷ lệ phôi dâu và phôi nang/hợp tử phân chia và thụ tinh của tinh trùng phân biệt giới tính tương ứng đạt: 1,8 phôi/ buồng trứng, 45,97% và 20,66% Thấp hơn tinh trùng không phân biệt giới tính (P < 0,05), tương ứng: 3,14 phôi/ buồng trứng, 65,78% và 35,61% Nghiên cứu khả năng sản xuất phôi bò sữa in vivo bằng tinh trùng phân biệt ... Đánh giá ảnh hưởng số yếu tố kỹ thuật sử dụng tinh trùng xác định tính biệt đến khả sản xuất phôi in vitro in vivo - Xác định số yếu tố kỹ thuật sử dụng tinh trùng xác định tính biệt tăng số lượng... NGUYỄN THỊ TUYẾT NHUNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG TINH TRÙNG ĐÃ XÁC ĐỊNH TÍNH BIỆT CÁI ĐẾN KHẢ NĂNG SẢN XUẤT PHÔI IN VITRO VÀ IN VIVO TRÊN BÒ HOLSTEIN FRIESIAN Chuyên ngành:... phân ly giới tính Chính lẽ đó, tiến hành đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố kỹ thuật sử dụng tinh trùng xác định tính biệt đến khả sản xuất phôi in vitro in vivo bò Holstein Friesian Mục