Nghiên cứu một số đặc tính sinh hoá của các chủng xạ khuẩn phân lập được từ các ao nuôi tôm thâm canh tại Thừa Thiên Huế

Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu đặc tính sinh hóa của các chủng xạ khuẩn phân lập được từ các ao nuôi tôm tại Thừa Thiên Huế, từ đó tìm ra chủng xạ khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh cho tôm nuôi.

TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 4(1)-2020:1799-1810 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HOÁ CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÁC AO NUÔI TÔM THÂM CANH TẠI THỪA THIÊN HUẾ Nhận bài:11/02/2020 Nguyễn Ngọc Phước*, Nguyễn Thị Huế Linh, Trương Thị Hoa Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế *Tác giả liên hệ: nguyenngocphuoc@huaf.edu.vn Hoàn thành phản biện: 14/03/2020 Chấp nhận bài: 29/03/2020 TÓM TẮT Nghiên cứu nhằm tìm hiểu đặc tính sinh hố chủng xạ khuẩn phân lập từ ao nuôi tôm Thừa Thiên Huế, từ tìm chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh cho tôm nuôi Xạ khuẩn phân lập theo phương pháp Lakshmi (2008) định danh phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA Nghiên cứu khả sinh enzyme xác định khả gây độc máu tôm chủng xạ khuẩn thực môi trường thạch chuyên biệt Kết phân lập chủng xạ khuẩn DH A1, DM A1, DM A2, PH A1 QN A1 có khả ức chế phát triển vi khuẩn V parahaemolyticus Cả chủng không làm tan tế bào máu tôm môi trường Rose-Bengal Các chủng xạ khuẩn phân lập có trình tự nucleotide tương đồng từ 94-98% so với chủng Streptomyces sampsonii ATCC 25495 Năm chủng xạ khuẩn phân lập có khả sản sinh cellulase, amylase, lipase (trừ chủng PH A1), riêng chủng PHA1 QN A1 cịn có khả tiết enzyme gelatinase Kết nghiên cứu cho thấy ứng dụng chủng để sản xuất chế phẩm sinh học thay cho kháng sinh điều trị bệnh nhiễm khuẩn Vibrio parahemolyticus gây Từ khóa: Streptomyces sampsonii, Vibrio parahaemolyticus, Xạ khuẩn ISOLATION AND BIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF ACTYNOMYCES FROM INTENSIVE SHRIMP PONDS IN THUA THIEN HUE PROVINCE Nguyen Ngoc Phuoc, Nguyen Thi Hue Linh, Trương Thị Hoa Faculty of Fisheries, University of Agriculture and Forestry, Hue University ABSTRACT The aims of this study were: (i) to isolate and identify actinomycetes strains that were recorvered from intensive shrimp ponds in Tam Giang lagoon in Thua Thien Hue province; (ii) to study on the enzymes and antimicrobial activity on the pathogenic bacteria Vibrio parahaemolyticus to cultured shrimp; and (iii) to study on the virulence of recovered actinomyces strains to shrimp in the in vitro condition The isolates were isolated from the following method of Lakshmi et al (2008) and identified by 16s rRNA gene sequencing Five actinomycete isolates (DH A1, DM A1, DM A2, PH A1 and QN A1) were isolated from shrimp pond’s sediment and the 16S rRNA gene sequences of these five isolates showed the identities from 94 - 98% with those of Streptomyces sampsonii strain ATCC 25495 through the BLAST analysis The isolates were then investigated how their abilities produced antibacterial compounds, enzymes as well as haemolytic activity Five isolates showed antimicrobial activity against V parahaemolyticus These isolates were non-heamolytic on the Rose-Bengal medium with hemolymph of shrimp added In addition, PH A1 and QN A1 were able to increase enzymatic activity by producing cellulase, amylase, and gelatinases while DH A1, DM A1, DM A2, and QN A1 produced cellulase, amylase, and lipase Results from this study provided the first insight into characteristics of marine actinomycete isolates recovered from shrimp ponds sediments in Thua Thien Hue Keywords: Actinomyces, Vibrio parahaemolyticus, Streptomyces sampsonii http://tapchi.huaf.edu.vn/ 1799 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY MỞ ĐẦU Những năm gần đây, ngành thủy sản đối mặt với nhiều khó khăn, thách thức Sự phát triển tự phát thiếu quy hoạch vùng nuôi làm bệnh dịch lây lan tình trạng nhiễm mơi trường ngày khó kiểm sốt Để giải vấn đề này, người ni thường xun sử dụng hóa chất thuốc kháng sinh gây suy thối mơi trường xuất nhiều loại vi khuẩn kháng kháng sinh Xu hướng sử dụng vi khuẩn đối kháng thay cho kháng sinh việc nâng cao hiệu xử lý môi trường ao ni (Nguyễn Hồng Minh Huy, 2006), xạ khuẩn nhóm vi khuẩn nghiên cứu để phân hủy hợp chất hữu hạn chế gia tăng mầm bệnh Vibrio parahaemolyticus, V harveyi ao (Nguyễn Lân Dũng cs., 1978) Trong số 8.000 chất kháng sinh biết giới có 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn, chủ yếu từ chi Streptomyces Micromonospora Xạ khuẩn dùng để sản xuất nhiều loại enzyme, số vitamin axit hữu cơ, chất sinh học vitamin nhóm B (B2, B6, B12) Trong ni trồng thủy sản, xạ khuẩn sử dụng loại thuốc để xử lý nước thải, môi trường nước xạ khuẩn tiết loại kháng sinh làm ức chế tăng trưởng vi khuẩn gây bệnh ao nuôi (Nguyễn Lân Dũng cs., 1998) Ngồi ra, xạ khuẩn có hàm lượng protein cao (> 60%), vitamin nhóm B enzyme tiêu hóa, sử dụng làm thực phẩm phụ gia sản xuất thức ăn cho tôm, đặc biệt giai đoạn ấu trùng, để cải thiện tỷ lệ sống Nuôi trồng thuỷ sản Thừa Thiên Huế đối mặt với nhiều thách thức dịch bệnh ô nhiễm môi trường Tôm thẻ chân trắng nuôi chủ yếu 1800 ISSN 2588-1256 Vol 4(1)-2020:1799-1810 xã ven biển, nuôi tâm canh tập trung chủ yếu huyện Phong Điền Phú Vang Theo thống kê Chi cục Thuỷ sản Thừa Thiên Huế, năm 2018, 10% diện tích ni tơm thẻ chân trắng bị dịch bệnh vi khuẩn Vibrio gây ra, đặc biệt bệnh hoại tử gan tuỵ cấp vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây tôm nuôi 30 ngày tuổi chưa có giải pháp phịng trị hiệu việc sử dụng kháng sinh gây tổn thất lớn kinh tế cho người dân gây ô nhiễm môi trường (Chi cục Thuỷ sản Thừa Thiên Huế, 2018) Xuất phát từ vấn đề nêu trên, nghiên cứu nhằm tìm hiểu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn phân lập từ ao ni tơm Thừa Thiên Huế, từ tìm chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh cho tôm nuôi, giúp hạn chế sử dụng kháng sinh PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm thu mẫu Mẫu bùn đáy thu ao nuôi xã thuộc huyện: Phú Vang (xã Phú Hải), Quảng Điền (xã Quảng Công, Quảng Ngạn), Phong Điền (xã Phong Hải, Điền Môn, Điền Hương, Phong Lộc), xã tỉnh Thừa Thiên Huế có vùng ni tơm thẻ chân trắng phát triển đại diện cho vùng sinh thái đầm phá Tam Giang 2.2 Phương pháp phân lập định danh xạ khuẩn 2.2.1 Phương pháp phân lập xạ khuẩn Các chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu bùn đáy thu thập từ trang trại nuôi tôm tỉnh Thừa Thiên Huế Các mẫu bùn đáy thu vào bình nhựa 50 mL sau xử lý để phân lập chọn lọc xạ khuẩn theo phương pháp Lakshmi cs (2008) Mẫu thu xử lý nhiệt độ 50 - 60°C 60 phút Trộn Nguyễn Ngọc Phước cs TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP g mẫu bùn đáy với 0,1 g CaCO3 ủ tủ ấm nhiệt độ 28°C khoảng thời gian tuần Các mẫu sau pha lỗng, trộn cấy lên môi trường xạ khuẩn MT1 (tinh bột 15 g/L, K2HPO4 0.5 g/L, MgSO4 0.5 g/L, FeSO4 0.01 g/L, agar g/L) có bổ sung bavistin (Biostadt, Ấn độ) để kháng nấm novobiocin (Công ty Dược Hậu Giang, Việt Nam) để ức chế phát triển vi khuẩn Khuẩn lạc với đặc điểm xạ khuẩn nuôi cấy lên môi trường đặc trưng xạ khuẩn MT2 (tinh bột 10 g/L, nấm men g/L, peptone 20 g/L) thu khuẩn lạc Lấy khuẩn lạc cấy lên môi trường thạch nghiêng đặc trưng xạ khuẩn nước mặn Sau đó, lấy khuẩn lạc xạ khuẩn ống thạch nghiêng tiến hành tăng sinh 20 mL môi trường đặc trưng lỏng, nuôi cấy máy lắc 100 vòng/phút nhiệt độ 33oC để tiến hành thí nghiệm 2.2.2 Định danh xạ khuẩn Các chủng xạ khuẩn định danh phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA, đoạn gen khuếch đại phương pháp PCR với cặp mồi sử dụng 27F 5’AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ 1492R 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’ (Weisburgh cs., 1994) DNA chủng xạ khuẩn (DH A1, DM A1, DM A2, PH A1, QN A1) trích ly phịng thí nghiệm Bệnh học thuỷ sản, khoa Thuỷ sản, trường Đại học Nông Lâm Huế trước gửi giải trình tự gen Chọn - 10 khuẩn lạc rời cho vào ống ly tâm 2,2 mL, sau đó, cho viên bi sắt vào ống lắc máy lắc Tiếp tục cho vào mL dung dịch lysis buffer, lắc đều, ủ nhiệt độ phòng 10 phút Ly tâm 13000 vòng phút, lấy phần dung dịch chuyển sang ống ly tâm Sau đó, cho lượng tương đương ethanol 95%, ly tâm 13000 vòng/5 phút, bỏ http://tapchi.huaf.edu.vn/ ISSN 2588-1256 Tập 4(1)-2020:1799-1810 phần dung dịch phía Rửa phần kết tủa 500 L ethanol 70%, ly tâm 13000 rpm/5 phút Sấy khơ chân khơng 10 phút (45oC) Hịa tan 100 L dung dịch TE 0,1X Dung dịch DNA chủng xạ khuẩn gửi tới phịng thí nghiệm BIOLAB (Hàn Quốc) để định danh Kết giải trình tự gen tra cứu phần mềm BLAST so sánh với liệu gen GENBANK Dùng phần mềm MEGA 6.0 để vẽ phả hệ 2.3 Nghiên cứu khả sản xuất enzyme chủng xạ khuẩn phân lập Khuẩn lạc xạ khuẩn khác sau thu dòng cấy môi trường khác để xác định khả sản xuất amylase, lipase, gelatinase cellulase xạ khuẩn 2.3.1 Khảo sát khả sản xuất amylase xạ khuẩn Cấy xạ khuẩn phân lập vào môi trường thạch tinh bột ủ - ngày nhiệt độ phịng (28 ± 2oC) Sau đó, nhỏ dung dịch Iodine lên khuẩn lạc xạ khuẩn phát triển đĩa thạch, xạ khuẩn có sản xuất amylase dung dịch Iodine không chuyển sang màu xanh 2.3.2 Khảo sát khả sản xuất lipase xạ khuẩn Cấy xạ khuẩn phân lập môi trường tributyrin agar pH 7, ủ - ngày nhiệt độ phòng Sự sản xuất lipase phát vòng phân giải xuất xung quanh khuẩn lạc xạ khuẩn 2.3.3 Khảo sát khả sản xuất gelatinase xạ khuẩn Môi trường thạch Fraziers gelatin pH sử dụng để phát hoạt động enzyme gelatinase xạ khuẩn Cấy xạ khuẩn phân lập vào đĩa ủ - ngày nhiệt độ phòng Ngâm với Fraziers có chlorua thủy ngân đặc vào 1801 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY đĩa có xạ khuẩn phát triển, tiến hành đo vòng phân giải xuất để xác định khả sản xuất gelatinase xạ khuẩn 2.3.4 Khảo sát khả sản xuất cellulase xạ khuẩn Cấy xạ khuẩn phân lập vào môi trường dinh dưỡng cellulose agar pH 6,8 ủ vòng - ngày nhiệt độ phòng Sự sản xuất cellulase phát xuất vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc xạ khuẩn 2.3.5 Phương pháp xác định khả gây độc máu tôm chủng xạ khuẩn phân lập Tôm thẻ chân trắng thu thập trang trại ni tơm đem phịng thí nghiệm ni vịng tuần Sau tôm khử trùng dung dịch sodium hypochlorite, lấy mL máu tôm cho vào ống eppendorf vơ trùng có chứa 200 µL dung dịch chống đơng máu Heparin (Vaxcel Heparin Sodium Injection 500 IU/mL, Kotra Pharma (M) Sdn Bhd, Malaysia) Lấy mL máu tôm thêm vào môi trường Rose-Bengal hấp khử trùng, lắc nhẹ để trộn Môi trường đổ vào đĩa peptri Xạ khuẩn cấy lên đĩa thạch, ủ 48 h nhiệt độ phịng Khi khơng có xuất vòng dung huyết chứng tỏ xạ khuẩn khơng có khả dung giải tế bào máu tôm 2.4 Thử khả kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phân lập Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus phân lập từ tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh cung cấp từ phịng thí nghiệm Bệnh học thủy sản, khoa Thủy Sản, trường Đại học Nông Lâm Huế sử dụng để kiểm tra khả kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu bùn đáy phương pháp đục lỗ thạch 1802 ISSN 2588-1256 Vol 4(1)-2020:1799-1810 Các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus tăng sinh 20 mL môi trường TSA (Tryptone Soy Agar) 2% NaCl ủ 28oC, sau 24 thu dịch ni cấy Cấy dàn 20 µL chủng vi khuẩn với mật độ 106 cfu/mL lên môi trường nuôi cấy tương ứng Dùng ống hút thuỷ tinh vô trùng khoan 3- lỗ đĩa thạch cấy vi khuẩn với đường kính lỗ mm Lấy 100 µL dịch ni cấy chủng xạ khuẩn phân lập qua ly tâm để loại bỏ xạ khuẩn đặt vào giếng Đĩa thạch ủ tủ ấm nhiệt độ 28oC - ngày Xác định hoạt tính kháng khuẩn xạ khuẩn cách đo đường kính vịng vơ khuẩn D-d (mm) tạo thành đĩa thạch KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập xạ khuẩn từ mẫu bùn đáy Các mẫu bùn đáy sau xử lý pha loãng 1000x cấy mơi trường MT1, sau ủ tủ ấm 28oC vòng ngày, lựa chọn khuẩn lạc có hình dạng mơ tả đặc điểm hình thái xạ khuẩn, tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình dạng kính hiển vi, sau tách dòng đến thu chủng xạ khuẩn Qua đợt thu mẫu, phân lập từ mẫu bùn đáy ao nuôi tôm thu chủng xạ khuẩn DH A1, DM A1, DM A2 xã Điền Hương Điền Môn, huyện Phong Điền; chủng xạ khuẩn PH A1 thu xã Phong Hải, huyện Phong Điền; chủng xạ khuẩn QN A1 thu xã Quảng Ngạn, huyện Quảng Điền Không phân lập xạ khuẩn từ mẫu bùn đáy thu xã thuộc huyện Phú Lộc Phú Vang Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn phân lập tóm tắt Bảng Nguyễn Ngọc Phước cs TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP Tên chủng DH A1 DM A1 DM A2 PH A1 QN A1 ISSN 2588-1256 Tập 4(1)-2020:1799-1810 Bảng Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn phân lập môi trường nuôi cấy MT1 MT2 Màu sắc Đặc điểm Đều, trịn, khuẩn lạc nhơ cao, mặt khơ khơng trơn, Màu xanh đậm Khuẩn lạc thời gian xuất ngày, đường kính mm (Hình giửa lớn có viền 1a, b) trắng mỏng bao Nhuộm Gram (+), dạng sợi dài, khơng có vách ngăn ngang, quanh Gram khơng sinh nhánh Đều, trịn, khuẩn lạc nhơ cao, mặt khơ khơng trơn, Khuẩn lạc thời gian xuất ngày, đừng kính 10 mm (Hình 2a, b) Màu xanh nhạt Nhuộm Gram (+), dạng sợi dài, khơng có vách ngăn ngang, Gram khơng phân nhánh Đều, trịn, khuẩn lạc nhơ cao xèo rộng, mặt khô Khuẩn lạc không trơn, thời gian xuất ngày, đường kính Màu trắng, có mm (Hình 3a, b) màu nâu nhạt Nhuộm Gram (+), dạng sợi dài, khơng có vách ngăn ngang, Gram khơng phân nhánh Đều, trịn, khuẩn lạc nhơ, mặt khơ không trơn, thời Khuẩn lạc gian xuất ngày, đường kính 12 mm (Hình 4a, Giữa màu xám, b) xung quanh mà trắng đục Nhuộm Gram (+), dạng sợi dài, khơng có vách ngăn ngang, Gram khơng phân nhánh Đều, trịn, khuẩn lạc xù xì, xịe rộng, mặt trơn không Khuẩn lạc khô, thời gian xuất ngày Đường kính 15 mm (Hình 5a, b) Màu trắng đục Nhuộm Gram (+), dạng sợi dài, khơng có vách ngăn ngang, Gram khơng phân nhánh Hình Khuẩn lạc xạ khuẩn chủng DH A1 phát triển môi trường MT1 (a), MT2 (b) http://tapchi.huaf.edu.vn/ 1803 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol 4(1)-2020:1799-1810 Hình Khuẩn lạc xạ khuẩn chủng DM A1 phát triển mơi trường MT1 (a), MT2 (b) Hình Khuẩn lạc xạ khuẩn chủng DM A2 phát triển môi trường MT1 (a), MT2 (b) Hình Khuẩn lạc xạ khuẩn chủng PH A1 phát triển môi trường MT1 (a), MT2 (b) 1804 Nguyễn Ngọc Phước cs TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 4(1)-2020:1799-1810 Hình Khuẩn lạc xạ khuẩn chủng QN A1 phát triển môi trường MT1 (a), MT2 (b) 3.2 Định danh xạ khuẩn Các chủng xạ khuẩn định danh phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen 16S rRNA, đoạn gen sau giải trình tự tra cứu phần mềm BLAST so sánh với liệu gen GENBANK Kết cho thấy: Chủng DH A1, DM A1, DM A2, PH A1, QN A1 có trình tự nucleotide tương đồng từ 94-98 so với chủng Streptomyces sampsonii ATCC 25495 Cây phát sinh loài dựa dựa trình tự phần gen 16S rRNA chủng xạ khuẩn vùng tương ứng đoạn gen 16S rRNA chủng Streptomyces sampsonii ATCC 25495 thể hình Hình Cây phát sinh lồi xây dựng dựa trình tự phần gen 16S rRNA chủng xạ khuẩn vùng tương ứng đoạn gen 16S rRNA chủng Streptomyces sampsonii ATCC 25495 Các số nhánh biểu thị tỷ lệ phần trăm trùng khớp Tỷ lệ phía biểu thị khoảng cách tiến hóa nucleotide thay vị trí Xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces (ngành: Actinobacteria) vi khuẩn Gram dương, có hàm lượng G + C cao (70%), xạ khuẩn sống nhiều mơi trường đất khác với hình thái sợi đặc trưng phân nhánh Streptomyces sp công nhận rộng rãi vi sinh vật công http://tapchi.huaf.edu.vn/ nghiệp quan trọng tiềm đa dạng sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp (Lee cs., 2014b; Ser cs., 2015; Tan cs., 2015) bao gồm thuốc kháng sinh (Lee cs., 2014a), thuốc chống ung thư, thuốc chống ký sinh trùng, thuốc ức chế miễn dịch enzyme 1805 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY (Manivasagan cs., 2013) Theo báo cáo số nghiên cứu xạ khuẩn S sampsonii phân lập từ đất nơng nghiệp (Jain cs., 2016) hay từ đất vườn ngập nước (Jain Jain, 2007) Từ kết nghiên cứu cho thấy S sampsonii cịn phân lập từ bùn đáy ao nuôi tôm Do khả sản xuất hợp chất hóa học phổ rộng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces tạo hợp chất kháng khuẩn kháng sinh tiềm năng, nên lồi xạ khuẩn có ISSN 2588-1256 Vol 4(1)-2020:1799-1810 giá trị probiotic nuôi trồng thủy sản 3.3 Một số đặc điểm sinh hoá chủng xạ khuẩn phân lập 3.3.1 Khảo sát khả sản xuất enzyme xạ khuẩn Kết khảo sát khả sản xuất enzyme cellulase, amylase, lipase, gelatinase chủng xạ khuẩn thể Bảng Bảng Kết khảo sát khả sản sinh enzyme chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn/môi trường phân giải Cellulase Amylase Lipase Gelatinase DH A1 + + + DM A1 + + + DM A2 + + + PH A1 + + + QN A1 + + + + (+) có khả phân giải enzyme; (-) khơng có khả phân giải enzyme Qua Bảng cho thấy chủng DH A1, DM A1, DM A2, PH A1, QN A1 có khả sản xuất enzyme cellulase, amylase, lipase (ngoại trừ chủng PH A1 khơng có khả sản xuất enzyme lipase) Các chủng xạ khuẩn phân lập khơng có khả sản xuất enzyme gelatinase, ngoại trừ hai chủng PH A1 QN A1 Actinomycetes vi khuẩn Gram dương dạng sợi, có mặt khắp nơi đất, biết đến loại vi sinh vật sản xuất nhiều enzyme ngoại bào với đặc tính phân hủy polymer, bao gồm chitinase (Gupta cs., 1995) Tất chủng phân lập cho thấy khả sản xuất loại enzyme ngoại bào cellulase, lipase, amylase, gelatinase chitinase Bên cạnh đó, chitin thành phần phổ biến sinh vật sống môi trường nước, thành phần cấu tạo lớp vỏ động vật không xương sống, vảy cá thành tế bào nhiều loại nấm (Souza cs., 2011) Cellulose chất phổ biến sinh vật xem polymer sinh học (Arjit cs., 2012) 1806 Xạ khuẩn lồi vi sinh vật có khả sản sinh cellulase áp dụng rộng rãi giới (Arjit cs., 2012; Ashutosh, 2008) Khi kiểm tra hoạt tính enzyme số chủng xạ khuẩn môi trường Starch Casein Agar (SCA), Lechevalier Lechevalier (1970) cho thấy xạ khuẩn có khả sản sinh nhiều loại enzyme, kết việc chọn lọc sinh học tự nhiên để tồn môi trường Shamar Choudhary (2014) báo cáo loại vi khuẩn mơi trường ảnh hưởng đến chức sinh học xạ khuẩn Khả sản xuất enzyme (protease, amylase, lipase), axit hữu ghi nhận từ loại xạ khuẩn nuôi trồng thủy sản You cs (2005) ghi nhận số chủng Streptomyces sinh enzyme làm tăng khả hấp thụ chất dinh dưỡng cho tôm nuôi Jain cs (2016) ghi nhận S sampsonii có khả thuỷ phân casein, gelatin, collagen sử dụng S sampsonii làm chế phẩm sinh học có khả phân giải chất hữu Nguyễn Ngọc Phước cs TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP mơi trường nhờ khả tiết enzyme Ngồi ra, cịn làm tăng vi khuẩn nitrate có khả kháng nấm cao 3.3.2 Kết kiểm tra tính dung huyết chủng xạ khuẩn phân lập ISSN 2588-1256 Tập 4(1)-2020:1799-1810 Khi nuôi cấy chủng xạ khuẩn mơi trường Rose-Bengal có bổ sung máu tơm, khơng thấy xuất vịng dung huyết (Bảng 3, Hình 8) chứng tỏ chủng xạ khuẩn khơng có khả dung giải tế bào máu tôm Bảng Khả dung huyết chủng xạ khuẩn phân lập Chủng xạ khuẩn Khả dung huyết máu tôm DH A1 DM A1 DM A2 PH A1 QN A1 - Theo Kumar Achuthankutty (2006), chủng xạ khuẩn phân lập từ trầm tích biển khơng gây bệnh cho tơm khơng có báo cáo xạ khuẩn tác nhân gây bệnh cho động vật thuỷ sản Trong nghiên cứu này, sau ngày ni cấy mơi trường Rose-Bengal có bổ sung máu tôm, chủng xạ khuẩn không làm vỡ tế bào máu tôm chứng tỏ chủng khả gây bệnh cho tơm Do khả chủng xạ khuẩn phát triển môi trường nước mặn không gây bệnh cho tơm, nên ứng dụng chủng xạ khuẩn ao nuôi tôm chế phẩm sinh học Tuy nhiên, thử nghiệm sâu cần nghiên cứu để tìm liều dùng cách dùng phù hợp Hình Khả dung huyết chủng xạ khuẩn DH A1 (a), PH A1 (b), DM A1 (c) QN A1 (d) mơi trường Rose-Bengal có bổ sung máu tôm 3.4 Khả kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phân lập Khả kháng lại vi khuẩn V parahaemolyticus chủng xạ khuẩn thể Bảng Các chủng xạ khuẩn có khả kháng lại phát triển chủng vi khuẩn V http://tapchi.huaf.edu.vn/ parahaemolyticus, với khả kháng khuẩn chủng tương đối tốt thể qua cácc vịng vơ khuẩn mơi trường (Hình 9) Đường kính vịng trịn vơ khuẩn xuất khả khuếch tán kháng sinh xạ khuẩn sản sinh vào môi trường nuôi cấy 1807 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol 4(1)-2020:1799-1810 Bảng Đường kính vịng vơ khuẩn khả kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phân lập Đường kính lỗ Đường kính vịng vơ Khả kháng Vibrio Chủng xạ khuẩn thạch (mm) khuẩn (mm) parahaemolyticus DH A1 15-17 + DM A1 14-18 + DM A2 11-18 + PH A1 13-17 + QN A1 14-16 + Streptomyces chứng minh khả sản sinh hợp chất ức chế chất chuyển hóa có liên quan đến suy giảm việc hình thành màng bọc sinh học, hoạt động cảm biến chống lại tác nhân gây bệnh (You cs., 2007) hoạt động chống độc lực vi khuẩn Vibrio sp (Iwatsuki cs., 2008) Ngoài ra, số chủng Streptomyces có khả sản xuất bacteriocins, siderophores ảnh hưởng đến phát triển mầm bệnh Vibrio sp cạnh tranh sắt môi trường nước (Lechevalier Lechevalier, 1970; You cs., 2005) Đặc biệt, S sampsonii tiết chất thuộc nhóm kháng sinh polyene, ngồi khả kháng khuẩn cịn có khả kháng nấm Candida albicans, Aspergillus niger, Microsporum gypseum Trichophyton sp (Jain Jain, 2007) Hình Vịng vơ khuẩn chủng DM A2 lên vi khuẩn V parahaemolyticus Mohanraj Sekar (2013) cho sử dụng xạ khuẩn hệ thống ni thuỷ sản có khả ức chế phát triển vi khuẩn Vibrio Nghiên cứu Châu cs (2016) cho thấy chủng Streptomyces sp phân lập Thừa Thiên Huế có khả khăng ức chế phát triển vi khuẩn V harveyi V parahaemolyticus, nhiên, cho vào mơi trường ao ni tơm khả phát triển chủng khó để phân lập lại Khả kháng khuẩn xạ khuẩn phụ thuộc 1808 lớn vào mơi trường ni cấy (Jose Jebakumar, 2013), việc đưa xạ khuẩn vào ao ni tơm cần phải nghiên cứu sâu để đảm bảo phát triển chúng KẾT LUẬN Từ mẫu bùn thu từ ao nuôi tôm Thừa Thiên Huế, phân lập chủng xạ khuẩn: DH A1, DM A1, DM A2, PH A1, QN A1 Các chủng tuyển chọn định danh phương pháp giải trình tự gen Nguyễn Ngọc Phước cs TẠP CHÍ KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ NƠNG NGHIỆP 16S rRNA Kết chủng có trình tự nucleotide giống với chủng Streptomyces sampsonii ATCC 25495 từ 94%-98% Các chủng xạ khuẩn phân lập có khả sản sinh enzyme amylase, cellulase, lipase (trừ chủng PH A1 khơng có khả sản sinh lipase) chủng PH A1 QN A1 có khả sản sinh enzyme gelatinase Các chủng xạ khuẩn phân lập khơng có khả dung giải tế bào máu tơm nên sử dụng chủng xạ khuẩn chế phẩm sinh học phịng trị bệnh tơm Các chủng xạ khuẩn phân lập có khả kháng lại phát triển chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh tôm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Chi cục Thuỷ sản Thừa Thiên Huế (2019) Báo cáo tình hình ni trồng thuỷ sản tỉnh Thừa Thiên Huế năm 2018 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đồn Xn Mượu, Phạm Văn Ty (1978) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập Hà Nội: Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998) Vi sinh vật học Hà Nội: Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Hoàng Minh Huy (2006) Khảo sát đặc điểm vai trò chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii Luận văn Thạc sĩ khoa học, trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng nước ngồi Arjit, D., Mahdi, E.B., Prashanti, K., Sandeep, S & Sourav, B (2012) Enzymatic screening and random amplified polymorphic DNA fingerprinting of soil streptomycetes isolated from Wayanad district in Kerala, India Journal of Biological Sciences, 12, 43-50 Ashutosh, K (2008) Pharmaceutical Microbiology New Delhi: New Age http://tapchi.huaf.edu.vn/ ISSN 2588-1256 Tập 4(1)-2020:1799-1810 International (P) Ltd Châu, N T T., Thanh, L T H & Anh, N H T (2016) Characterization of Actinomycetes antagonistic to Vibrio parahaemolyticus isolated from shrimp pond sediment Vietnam National University of Journal of Science: Earth and Environmental Sciences, 32, 1-9 Gupta, R., Saxena, R K., Chaturvedi, P., & Virdi, J S (1995) Chitinase production by Streptomyces viridificans: its potential in fungal cell wall lysis Journal of Applied Bacteriology, 78, 378-383 Iwatsuki, M., Uchida, R., Yoshijima, H., Ui, H., Shiomi, K., Matsumoto, A., Takahashi, Y., Abe, A., Tomoda, H., & Omura, S (2008) Guadinomines, type III secretion system inhibitors, produced by Streptomyces sp K01-0509 I: taxonomy, fermentation, isolation and biological properties Journal of Antibiotics (Tokyo), 61, 230–236 Jain, P K & Jain, P C (2007) Isolation, characterization and antifungal activity of Streptomyces sampsonii GS 1322 Indian Journal of Experimetal Biology, 45, 203-206 Jain, R., Jain, A., Rawat, N., Nair, M., & Gumashta, R (2016) Feather hydrolysate from Streptomyces sampsonii GS 1322: A potential low cost soil amendment Journal of Bioscience and Bioengineering 121(6), 672-677 Jose, P A., & Jebakumar, S R D (2013) Phylogenetic appraisal of antagonistic, slow growing actinomycetes isolated from hypersaline inland solar salterns at Sambhar salt Lake, India Frontiers in Microbiology, 4, 190 Kumar, S S., Philip, R., & Achuthankutty, C T (2006) Antiviral property of marine actinomycetes against white spot syndrome virus in penaeid shrimps Current Science, 91, 807-811 Lakshmi, C V., Kumar, M & Khanna, S (2008) Biotransformation of chlorpyrifos and bioremediation of contaminated soil International Biodeterioration and Biodegradation, 62, 204-209 Lechevalier, M P & Lechevalier, H (1970) Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic actinomycetes 1809 HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY International Journal of Systematic Bacteriology, 20, 435–443 Lee, L H., Zainal, N., Azman, A S., Eng, S K., Ab Mutalib, N S., Yin, W F., & Chan, K G (2014a) Streptomyces pluripotens sp nov., a bacteriocin-producing streptomycete that inhibits meticillin-resistant Staphylococcus aureus International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, (64), 3297–3306 Lee, L H., Zainal, N., Azman, A S., Eng, S K., Goh, B H., Yin, W.F., Ab Mutalib, N S., & Chan, K G (2014b) Diversity and antimicrobial activities of actinobacteria isolated from tropical mangrove sediments in Malaysia Scientific World Journal, 1-14 Manivasagan, P., Venkatesan, J., Sivakumar, K., & Kim, S K (2013) Marine actinobacterial metabolites: current status and future perspectives Microbiolical Research, (168), 311–332 Mohanraj, G & Sekar, T (2013) Isolation and screening of actinomycetes from marine sediments for their potential to produce antimicrobials International Journal of Life Science Biotechnology and Pharma Research, 2(3), 115-126 Ser, H L., Palanisamy, U D., Yin, W F., Abd Malek, S N., Chan, K G., Goh, B H., & Lee, L H (2015) Presence of antioxidative agent, Pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione, hexahydro- in newly isolated Streptomyces mangrovisoli sp nov Frontiers in Microbiology, (6), 854 Sharma, M., Dangi, P., & Choudhary, M (2014) Actinomycetes: Source, 1810 ISSN 2588-1256 Vol 4(1)-2020:1799-1810 identification, and their applications International Journal of Current Microbiology and Appiled Sciences, 3(2), 801-83 Souza, C M., Schwabe, T M., Pichler, H., Ploier, B., Leitner, E., Guan, X L., Wenk, M R., Riezman, I., & Riezman, H (2011) A stable yeast strain efficiently producing cholesterol instead of ergosterol is functional for tryptophan uptake, but not weak organic acid resistance Metabolic Engineering, 13(5), 555-69 Tan, L T.-H., Ser, H.-L., Yin, W.-F., Chan, K.G., Lee, L.-H., & Goh, B.-H (2015) Investigation of antioxidative and anticancer potentials of Streptomyces sp MUM256 isolated from Malaysia mangrove soil Frontiers in Microbiology, (6), 1316 Weisburg, W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., & Lane D.J (1991) 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study Journal of bacteriology, 173(2), 697-703 You, J., Cao, L., Liu, G., Zhou, S., Tan, H., & Lin, Y (2005) Isolation and characterization of actinomycetes antagonistic to pathogenic Vibrio spp from nearshore marine sediments World Journal of Microbiology and Biotechnololy, (21), 679–682 You, J., Xue, X., Cao, L., Lu, X., Wang, J., Zhang, L., & Zhou, S (2007) Inhibition of Vibrio biofilm formation by a marine actinomycete strain A66 Applied Microbiology and Biotechnology, (76), 1137–1144 Nguyễn Ngọc Phước cs  ... sản Thừa Thiên Huế, 2018) Xuất phát từ vấn đề nêu trên, nghiên cứu nhằm tìm hiểu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn phân lập từ ao nuôi tơm Thừa Thiên Huế, từ tìm chủng xạ khuẩn có khả kháng vi khuẩn. .. bổ sung máu tôm 3.4 Khả kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phân lập Khả kháng lại vi khuẩn V parahaemolyticus chủng xạ khuẩn thể Bảng Các chủng xạ khuẩn có khả kháng lại phát triển chủng vi khuẩn V http://tapchi.huaf.edu.vn/... khuẩn Các chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu bùn đáy thu thập từ trang trại nuôi tôm tỉnh Thừa Thiên Huế Các mẫu bùn đáy thu vào bình nhựa 50 mL sau xử lý để phân lập chọn lọc xạ khuẩn theo phương