Hoạt tính kháng khuẩn và kháng ung thư vú MCF 7 của một số cao trích và hợp chất cô lập được từ các cây thuộc chi hedyotis

Kết quả thử nghiệm tính kháng khuẩn cho thấy cao etanol của H. nigricans có hoạt tính trên ba chủng B. subtilis, E. coli và S. typhi.

TẠP CHÍ ĐẠI HỌC SÀI GỊN, tháng 10, 2009 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG UNG THƯ VÚ MCF-7 CỦA MỘT SỐ CAO TRÍCH VÀ HỢP CHẤT CƠ LẬP ĐƯỢC TỪ CÁC CÂY THUỘC CHI HEDYOTIS PHẠM NGUYỄN KIM TUYẾN (*) NGUYỄN KIM PHI PHỤNG (**) PHẠM ĐÌNH HÙNG (***) TĨM TẮT Kết thử nghiệm tính kháng khuẩn cho thấy cao etanol H nigricans có hoạt tính ba chủng B subtilis, E coli S typhi Kết thử nghiệm độc tính Brine Shrimp khả gây độc tế bào dòng tế bào ung thư vú MCF-7 cho kết tương đồng, ngoại trừ arbutin (LC50=20 g/ml) rutin (LC50=50 g/ml) có độc tính Brine Shrimp mạnh khơng độc dịng tế bào ung thư vú MCF-7 (I%= 1,33 arbutin I%= 3,53 rutin) Hai hợp chất 4'-butyloxy-5,7-dihydroxyflavanon (I%= 92,60) -amyrin (I%= 98,23) cho hoạt tính mạnh dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Các nghiên cứu hoạt tính chi Hedyotis tiếp tục ABSTRACT The ethanol extract of H nigricans exhibited strong antibaterial activity on Bacillus subtilis, Escherichia coli and Salmonela typhi Arbutin and rutin exhibited strong Brine shrimp toxicity (LC50 20 g/ml and 50 g/ml, respectively) but showed mild inhibition on breast cancer cell MCF-7 (1.33 and 3.53% inhibition, respectively) The remaining extracts and compounds showed the correlation on Brine Shrimp toxicity and cytotoxicity against breast cancer cell MCF7 Two compounds, 4'-butyloxy-5,7-dihydroxyflavanone and -amyrin (92.60 and 98.23 % inhibition, respectively) showed the strongest cytotoxicity against breast cancer cell MCF-7 The further researche sare underinvestigated TỔNG QUAN Ở Việt Nam quốc gia khác khu vực Đông Nam Á, thuốc thuộc chi Hedyotis, họ Cà phê Rubiaceae H corymbosa, H diffusa v.v sử dụng rộng rãi y học cổ truyền để chữa trị vết rắn cắn, viêm nhiễm vết thương đặc biệt bệnh ung thư [46] Các nghiên cứu khoa học cho thấy, thuốc thường có chứa hợp chất acid ursolic acid oleanolic hai hợp chất chứng minh có hoạt tính kháng TS, (**)Th.S, Khoa Khoa học Mơi trường, Trường Đại học Sài Gịn ***) TS, Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP HCM (*) ( dòng tế bào ung thư như: tế bào ung thư phổi A549, tế bào ung thư buồng trứng SK-OV-3, tế bào ung thư da SK-MEL-2, tế bào ung thư não XF498, tế bào ung dày SNU-1, tế bào ung thư bạch cầu L1210 [3-5] Do đặc điểm Hóa Thực vật, lồi chi chứa hợp chất giống có đặc điểm dược tính tương tự nhau, nên việc nghiên cứu thành phần hóa học dược tính c a thuốc m i thuộc chi Hedyotis cần thiết Chính v l trên, ch ng tiến hành kh o sát thành phần hóa học c a ba lồi thuộc chi Hedyotis H auricularia, H biflora H nigricans Kết qu kh o sát cho thấy lồi Hedyotis có chứa hợp chất steroid, acid triterpenoid, flavonoid, antraquinon glycosid, c ba lồi Hedyotis kh o sát có chứa acid ursolic acid oleanolic v i hàm lượng cao (0,07 – 0,14 % so v i bột khơ) [9-12] Sau đó, cao trích hợp chất cô lập thử nghiệm hoạt tính kháng sốt rét, kháng khuẩn, độc tính Brine Shrimp kh gây độc dòng tế bào ung thư v MCF-7 nhằm góp phần phát hoạt tính sinh học c a thuốc m i thuộc chi Hedyotis KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Các cao trích hợp chất tinh khiết tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học như: kháng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum, kháng khuẩn bốn ch ng Escherichia coli (Gram âm), Salmonela typhi (Gram âm), Staphylococus (Gram dương) Bacillus subtilis (Gram dương), độc tính Brine shrimp kh gây độc tế bào dòng tế bào ung thư v MCF-7 Cấu tr c hóa học hợp chất thử nghiệm hoạt tính sinh học tr nh bày h nh 29 30 29 12 25 26 19 COOH 25 HO (11) 24 18 13 26 12 23 19 20 4' HO HO 18 13 26 23 12 11 13 14 10 HO OH O O 10 6' O H C HO3 HO O 10 OH O 2' 1' 3' 6' 4' 5' OMe (22) OMe MeO MeO O 10 OH S HO HO OH 2' 1' 3' 6' 4' 5' OMe (23) H 1"' O (17) MeO 4' 5' OH O (16) MeO 2' 1' 3' 5' 2' 3' O 1' 18 20 23 OH (14) Glc O 24 26 25 27 11 15 28 22 (15) OH O O OH O O (18) 19 O OHH (13) 24 H HO OH 6' 21 OH O OH HO (12) 24 25 COOH 23 29 19 20 12 18 13 HO 30 30 29 20 OH H 8 O1 10 1' 6' OH O 1" 2' 5' 3' 4' O 10 OH O OMe (19) OMe HO HO O2 10 2' 1' 3' 6' 4' 5' OH HO O2 10 2' 1' 3' 6' (24) 3' 6' 4' 5' O 10 2' 1' (25) 4' 5' (21) (20) HO 3' 6' OH S OC4H9 4' 5' OH O OH O 2' 1' O2 10 2' 1' 3' 6' 4' 5' OC4H9 OH S (26) Hình 1: Cấu tr c hóa học hợp chất thử nghiệm hoạt tính sinh học Kết qu thử nghiệm hoạt tính kháng sốt rét cao etanol thơ ban đầu c a hai lồi Hedyotis cho thấy, nồng độ 100 mg/ml, cao etanol H auricularia H nigricans khơng có hoạt tính kháng k sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum Chính v thế, cao etanol thơ cịn lại c a H biflora không nhận thử tiếp Như vậy, cao etanol thô ban đầu c a ba Hedyotis kh o sát khơng có kh gây chết k sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum, điều phù hợp v chưa có tài liệu nói đến hoạt tính kháng sốt rét c a thuộc chi Hedyotis Kết qu thử nghiệm tính kháng khuẩn bốn ch ng E coli, S typhi, S aureus B subtilis c a cao etanol thô ban đầu c a ba loài Hedyotis tr nh bày b ng Các mẫu thử nồng độ 100 mg/ml Các cao etanol thơ cho thấy có hoạt tính kháng khuẩn v i mức độ mạnh, yếu khác Cao etanol thơ ban đầu c a H auricularia có hoạt tính tốt v i ch ng S aureus E coli Cao etanol c a H nigricans có hoạt tính tốt v i ch ng B subtilis, E coli S typhi Bảng 1: Kết qu thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn c a cao etanol c a ba Hedyotis kh o sát (tính bán kính vịng vơ khuẩn kể từ đĩa giấy, mm) Cao alcol c a H auricularia Staphylococus aureus 3 Bacillus subtilis Escherichia coli Salmonela typhi 10 - 11 H biflora 12 - 13 - 14 15 16 H nigricans 17 - 18 19 20 Ghi chú: (-): khơng thấy rõ tính kháng khuẩn Kết qu thử nghiệm độc tính Brine shrimp c a cao trích số hợp chất trình bày b ng Kết qu tính liều LC50 (g/ml) nồng độ hoạt chất (g/ml) gây chết 50% số ấu thể Artemia salina thử nghiệm Các nghiên cứu khoa học cho thấy mẫu thử cho độc tính Brine shrimp có hoạt tính kháng ung thư Một số cao chiết cho độc tính Brine shrimp mạnh cao etanol cao cloroform c a loài H auricularia; cao etanol, cao cloroform, cao etyl acetat cao metanol c a loài H nigricans Một số hợp chất cho độc tính Brine shrimp mạnh h ợ p c h ấ t arbutin, -amyrin, 1,4-dihydroxy-9,10-antraquinon, 5hydroxyflavon, 5,7,4'-trihydroxyisoflavon, rutin, 5,7-dihydroxyflavon, 5-hydroxythioflavon, 5,7-dihydroxyflavon, 4'-butyloxy-5,7-dihydroxyflavanon, 5,7,4'-trihydroxyflavanon, acid oleanolic acid ursolic Kết qu thử nghiệm kh gây độc tế bào dòng tế bào ung thư vú MCF-7 c a cao trích số hợp chất trình bày b ng Kết qu tính giá trị I%, biểu thị kh kháng phân bào c a chất thử Giá trị I% l n, chất thử có hoạt tính mạnh Một số cao chiết có hoạt tính tốt cao etanol thô ban đầu, cao cloroform c a H auricularia cao metanol c a H nigricans Trong số hợp chất thử nghiệm, hai hợp chất 4'-butyloxy5,7-dihydroxyflavanon (I%= 92,60) -amyrin (I%= 98,23) cho hoạt tính mạnh nhất, hai hợp chất 5,7,4'-trihydroxyflavanon 5,7,4'-trihydroxyisoflavon cho hoạt tính dịng tế bào ung thư vú MCF-7 Thử nghiệm độc tính Brine shrimp kh gây độc tế bào dòng tế bào ung thư vú MCF-7 cho kết qu tương đồng, ngoại trừ hợp chất arbutin (LC50=20 g/ml) rutin (LC50=50 g/ml) có độc tính Brine shrimp mạnh khơng độc đối v i dòng tế bào ung thư vú MCF-7 (I%= 1,33 đối v i arbutin I%= 3,53 đối v i rutin) So sánh hoạt tính kháng ung thư dòng tế bào ung thư vú MCF-7 c a số hợp chất thioflavon flavon tương ứng cho thấy số hợp chất thử nghiệm, hai cặp hợp chất 5hydroxythioflavon (I%= 21,83) 5-hydroxyflavon (I%= 20,39); 3,7,2',4'- tetrametoxy-5hydroxythioflavon (I%= 9,89) 3,7,2',4'-tetrametoxy-5-hydroxyflavon (I%= 9,59) cho hoạt tính gần tương tự nhau, hợp chất 4'-butyloxy-5,7- dihydroxythioflavon (I%= 28,04) cho hoạt tính yếu nhiều so v i 4'-butyloxy-5,7- dihydroxyflavanon (I%=92,60) Bảng 2: Kết qu thử nghiệm độc tính Brine shrimp kh gây độc tế bào dòng tế bào ung thư vú MCF-7 c a cao trích hợp chất tinh khiết 21 N0 22 Loại cao chiết 23 hợp chất tinh khiết 24 Độc tính 25 Brine shrimp 26 LC50 (g/ml) 27 Gây độc tế bào 28 ung thư vú 29 MCF-7 (I%) 30 31 Gossypol (Mẫu chứng dương) 32 10 33 97,10 34 35 Cao etanol thô ban đầu H auricularia 36 100 37 40,86 38 39 Cao cloroform H auricularia 40 100 41 47,97 42 43 Cao etanol thô ban đầu H biflora 44 1000 45 - 4,78 46 47 Cao metanol H biflora 48 500 49 9,63 50 51 Cao etanol thô ban đầu H nigricans 52 100 53 24,27 54 55 Cao eter dầu hỏa H nigricans 56 500 57 1,25 58 59 Cao cloroform H nigricans 60 100 61 31,07 62 63 Cao etyl acetat H nigricans 64 100 65 13,54 66 10 67 Cao metanol H nigricans 68 10 69 65,13 70 11 71 Acid ursolic 72 0,1 73 64,59 74 12 75 Acid oleanolic 76 10 77 19,16 78 13 79 -Amyrin 80 10 81 98,23 82 14 83 Arbutin 84 20 85 1,33 86 15 87 -Sitosterol 3--O-D-glucopyranosid 90 16 91 1,4-Dihydroxy-9,10-antraquinon (Quinizanin) 94 17 95 5,7-Dihydroxyflavon (Chrysin) 88 500 89 - 3,34 92 100 93 23,63 96 100 97 19,69 98 18 99 3,5,7,3',4'-Pentametoxyflavon 3-rutinosid (Rutin) 102 19 103 5,7,4’-Trihydroxyisoflavon (Biochanin A) 100 50 101 3,53 104 20 105 73,37 106 20 107 5-Hydroxyflavon (Primuletin) 108 100 109 20,39 110 21 111 5-Hydroxythioflavon 112 100 113 21,83 114 22 115 3,7,2',4'-Tetrametoxy-5-hydroxyflavon 116 500 117 9,59 118 23 119 3,7,2',4'-Tetrametoxy-5-hydroxythioflavon 122 24 123 5,7,4'-Trihydroxyflavanon (Naringenin) 120 500 121 9,89 124 50 125 71,92 126 25 127 4'-Butyloxy-5,7-dihydroxyflavanon 130 26 131 4'-Butyloxy-5,7-dihydroxythioflavon 128 50 129 92,60 132 100 133 28,04 Riêng đối v i hợp chất 5,7,4'-trihydroxyflavanon (I%=71,92) sau t h ự c h i ệ n p h n ứ n g alkyl hóa thành 4’-butyloxy-5,7-dihydroxyflavanon (I%= 92,60) cho hoạt tính mạnh thấy rõ Dựa kết qu nghiên cứu c a Trần Thành Đạo [1], thioflavon có hoạt tính kháng khuẩn mạnh có kh ức chế tạo NO tế bào vi thần kinh đệm BV-2 từ so v i flavon tương ứng Tuy nhiên, v i hoạt tính kháng dịng tế bào ung thư vú MCF-7, hợp chất thioflavon thử nghiệm cho hoạt tính yếu so v i hợp chất flavon tương ứng Nghiên cứu thuốc nội dung nghiên cứu quan tâm nhằm đóng góp thuốc giá trị vào nguồn dược liệu c a Việt Nam Những kết qu thử nghiệm hoạt tính tiền đề quan trọng cho nghiên cứu lâm sàng tr nh t m kiếm th o dược m i THỰC NGHIỆM 1.1 Các cao trích hợp chất tinh khiết thử nghiệm hoạt tính sinh học thu từ việc kh o sát thành phần hóa học c a ba lồi thuộc chi Hedyotis H auricularia (L.) Lam., H biflora (L.) Lam H nigricans (L.) Lam ) [9-12] Các hợp chất thioflavon điều chế từ ph n ứng flavon tương ứng tác chất Lawesson điều kiện chiếu xạ vi sóng khơng dung mơi [13] 1.2 Thử tính kháng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum: gửi mẫu thử Phịng thí nghiệm Sinh học kí sinh trùng Sinh hóa trị liệu, Viện B o tàng thực vật Quốc gia, Cộng hịa Pháp, Tiến sĩ Tơn Thất Quang thực 1.3 Thử tính kháng khuẩn: gửi mẫu thử Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học phân tử, Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TP HCM 1.4 Thử độc tính Brine shrimp: mẫu thử thực phịng thí nghiệm Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TP HCM Một mẫu xem không độc liều LC50> 1000 g/ml Một mẫu xem có nhiều hứa hẹn có hoạt tính liều LC50< 200 g/ml 1.5 Thử kh gây độc tế bào dòng tế bào ung thư vú MCF-7: gửi mẫu thử phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học phân tử, Khoa Sinh, trường ĐH KHTN Thử nghiệm tiến hành phương pháp MTT tế bào ung thư vú MCF-7 Phương pháp MTT: phương pháp so màu nhạy có tính định lượng, dùng để xác định sống, tăng sinh hoạt động c a tế bào Phương pháp dựa kh c a enzym dehydrogenase tế bào sống chuyển hợp chất màu vàng, tan nư c bromur 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium thành s n phẩm formazan màu xanh đen, không tan nư c Số lượng formazan tạo thành ph n ánh trực tiếp số lượng tế bào không phân chia sống Đo OD giếng thử nghiệm sau 72 Các giá trị thu được lặp lại lần thí nghiệm giá trị I%, biểu thị kh kháng phân bào c a hợp chất, đơn vị % AVE giá trị trung b nh c a I% c a lần lặp lại STD giá trị độ lệch chuẩn lần lặp lại I% tính theo cơng thức sau :  C T  I% =   x 100 %  C  I%: kh kháng phân bào c a hợp chất (%) C : giá trị OD c a lô đối chứng T : giá trị OD c a TÀI LIỆU THAM KHẢO Tran Thanh Dao (2005), T N Tuyen, H Park, Synthesis and iNOS inhibitory activities of thioflavones, Arch Pharm Res., 28, 652-656 Phan Đức Bình (2000), Tạp chí Thuốc Sức khỏe, 125, tr 31 Ho T-I., Chen G-P., Lin Y-C., Lin Y-M., Chen F-C (1986), An anthraquinone from Hedyotis diffusa, Phytochemistry, 25, pp 1988-1989 Hong X.X., Min W., Boon N.L (1996), Screening of traditional medicines for their inhibitory activity against HIV-1 protease, Phytother Res, 10, pp 207 - 210 Kim Sung Hoon, Ahn Byung-Zun, Ryu Shiyong (1998), Antitumour effects of ursolic acid isolated from Oldenlandia diffusa, Phytother Res, 12, pp 553-556 Phạm Hoàng Hộ (2006), Cây có vị thuốc Việt Nam, NXB Trẻ, tr 512-515 Montagnac A., Provost J T., Litaudon M., Pais M (1997), Antimitotic and cytotoxic constituents, Myodocarpus gracilis, Planta Med., 63, pp 365-366 Đỗ Tất Lợi (1986), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội, tr 264 -268 Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đ nh Hùng (2005), Khảo sát thành phần hóa học Hoa Kim Cương Hedyotis nigricans, họ Cà Phê (Rubiaceae), Tạp chí Hóa học Việt Nam, 43(6), 778-782 10 Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đ nh Hùng (2007), Khảo sát thành phần hóa học An Điền Tai Hedyotis auricularia, họ Cà Phê (Rubiaceae), Tạp chí Hóa học Việt Nam, 45(2), 233-236, 11 Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đ nh Hùng, Poul Erik Hansen (2007), Khảo sát thành phần hóa học An Điền hai hoa Hedyotis biflora, họ Cà phê (Rubiaceae), Tuyển Tập Các Cơng Trình Hội nghị Khoa Học Cơng nghệ Hóa học Hữu tồn quốc lần thứ 4, 252-255 12 Phạm Nguyễn Kim Tuyến, Nguyễn Kim Phi Phụng, Phạm Đình Hùng (2008), Cơ lập vài flavon antraquinon từ Hedyotis auricularia, họ Cà phê (Rubiaceae), Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 46, 237-243 13 Pham Nguyen Kim Tuyen, Nguyen Kim Phi Phung, Fadhil S Kamounah, Wei Zhang and Poul Erik Hansen, NMR of a series of novel hydroxyflavothiones, Magn Reson Chem, Published online in Wiley Interscience, July 2009  ... ung thư vú MCF- 7 c a cao trích số hợp chất trình bày b ng Kết qu tính giá trị I%, biểu thị kh kháng phân bào c a chất thử Giá trị I% l n, chất thử có hoạt tính mạnh Một số cao chi? ??t có hoạt tính. .. lượng cao (0, 07 – 0,14 % so v i bột khô) [9-12] Sau đó, cao trích hợp chất lập thử nghiệm hoạt tính kháng sốt rét, kháng khuẩn, độc tính Brine Shrimp kh gây độc dòng tế bào ung thư v MCF- 7 nhằm... 3,53 đối v i rutin) So sánh hoạt tính kháng ung thư dịng tế bào ung thư vú MCF- 7 c a số hợp chất thioflavon flavon tương ứng cho thấy số hợp chất thử nghiệm, hai cặp hợp chất 5hydroxythioflavon (I%=