Bài viết Hoạt tính kháng khuẩn in vitro của cao chiết từ chè dây (Ampelopsis cantoniensis) thu hái tại Đà Nẵng trên vi khuẩn Staphyloccus aureus phân lập từ bệnh nhân nhiễm trùng da trình bày việc phân lập vi khuẩn S. aureus từ bệnh nhân nhiễm trùng da và tiến hành khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn này bởi các cao chiết từ chè dây thu hái tại khu vực Đà Nẵng.
TNU Journal of Science and Technology 227(10): 235 - 242 IN VITRO ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF AMPELOPSIS CANTONIENSIS EXTRACTS CULTIVATED AT DANANG AGAINST CLINICALLY ISOLATED STAPHYLOCOCCUS AUREUS Ngo Thai Bich Van1, Dao Thi Thu Thao1, Hoang Thanh Trung2, Trieu Tuan Anh3 Vo Duong Nguyen Sa4, Kim Van Hung4, Pham Tran Vinh Phu3* 1University of Danang - Danang University of Science and Technology Hospital, 3Dong A University - Danang, 4Danang Dermato-Venereology Hospital 2Danang Family ARTICLE INFO ABSTRACT Received: 18/4/2022 The Gram-positive Staphylococcus aureus is a common pathogen that causes many serious infectious diseases in humans, especially in hospital settings Therefore, discovery and development of new antibiotics or new generations of antibiotics to treat infections caused by S aureus is an urgent issue in Vietnam and all over the world In this study, we isolated S aureus from patient sample and investigated the antibacterial potency of Ampelopsis cantoniensis extracts collected in Da Nang The results showed that ethanolic crude extract can suppress in vitro growth of this strain after 24 hours The ethylacetate fraction has the highest inhibitory effect on the growth of S.aureus bacteria, with minimum inhibitory concentration (MIC) of 0,1 mg/ml and minimum bactericidal concentration (MBC) of 0,4 mg/ml Whereas, extract of n-hexane fraction does not show antibacterial activity against S aureus These initial results are the premise for further studies on the antibacterial mechanism of Ampelopsis cantoniensis in the future Revised: 20/7/2022 Published: 20/7/2022 KEYWORDS Staphylococcus aureus Extracts Ampelopsis cantoniensis Antimicrobial activity MIC HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN IN VITRO CỦA CAO CHIẾT TỪ CHÈ DÂY (AMPELOPSIS CANTONIENSIS) THU HÁI TẠI ĐÀ NẴNG TRÊN VI KHUẨN STAPHYLOCCUS AUREUS PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN NHIỄM TRÙNG DA Ngơ Thái Bích Vân1, Đào Thị Thu Thảo1, Hoàng Thanh Trung2, Triệu Tuấn Anh3 Võ Dương Nguyên Sa4, Kim Văn Hùng4, Phạm Trần Vĩnh Phú3* 1Trường 3Trường Đại học Bách Khoa – ĐH Đà Nẵng, 2Bệnh viện Gia đình Đà Nẵng Đại học Đơng Á Đà Nẵng, 4Bệnh viện Da liễu Đà Nẵng THÔNG TIN BÀI BÁO TÓM TẮT Vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) mầm bệnh phổ biến gây nhiều bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng người, Ngày hồn thiện: 20/7/2022 đặc biệt mơi trường bệnh viện Do đó, việc tìm kiếm phát triển loại thuốc kháng sinh hệ kháng sinh để điều trị Ngày đăng: 20/7/2022 nhiễm trùng S aureus vấn đề cấp thiết y học Việt Nam nói riêng tồn giới nói chung Trong nghiên cứu này, TỪ KHĨA phân lập vi khuẩn S aureus từ bệnh nhân nhiễm trùng da Staphylococcus aureus tiến hành khảo sát khả ức chế vi khuẩn cao chiết từ chè dây thu hái khu vực Đà Nẵng Kết cho thấy cao tổng ethanol chè Cao chiết dây ức chế phát triển chủng vi khuẩn sau 24 nuôi Chè dây cấy in vitro Trong cao phân đoạn, cao ethylacetate có hiệu ức Hoạt tính kháng khuẩn chế tăng sinh vi khuẩn S.aureus cao nhất, với nồng độ ức chế tối thiểu MIC (MIC) 0,1 mg/ml nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) 0,4 mg/ml Ngược lại, cao phân đoạn n-hexane khơng có tác dụng kháng lại chủng vi khuẩn S.aureus Kết bước đầu tiền đề cho nghiên cứu xa chế kháng khuẩn chè dây tương lai DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.5869 Ngày nhận bài: 18/4/2022 * Corresponding author Email: ptvphu0603biotech@gmail.com http://jst.tnu.edu.vn 235 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 235 - 242 Giới thiệu Hiện nay, kháng kháng sinh vấn đề mang tính tồn cầu, đặc biệt nước phát triển Việt Nam Trong đó, vi khuẩn S aureus tác nhân phổ biến gây nên bệnh nhiễm trùng người [1] Chủng vi khuẩn gây hàng loạt bệnh cho người mức độ khác nhiễm trùng da nhỏ, viêm mô tế bào, viêm nang lơng, hội chứng da có vảy, áp xe, viêm phổi, viêm màng não, viêm tủy xương, viêm nội tâm mac, nhiễm trùng huyết,… [2] Một vấn đề đáng lo ngại quần thể S aureus có khả hình thành màng sinh học (biofilm), khả kháng kháng sinh vốn có màng sinh học kèm với bảo vệ lý tưởng hàng rào bên ngoài, giúp cho chủng vi khuẩn có khả khơng dung nạp liệu pháp kháng sinh [3] Những năm gần đây, nhiều hợp chất kháng sinh tổng hợp, có nguồn gốc từ tự nhiên sử dụng rộng rãi để giảm thiểu tình trạng kháng thuốc lâm sàng Việt Nam với thảm thực vật phong phú đa dạng nên có nhiều nghiên cứu cao chiết, hợp chất thiên nhiên có khả kháng lại vi khuẩn S aureus công bố [3]-[5] Cây chè dây (Ampelopsis cantoniensis) thảo dược quen thuộc, mọc nhiều vùng núi phía Bắc Trung [6] Nghiên cứu Nguyễn Văn Thu cộng (2015) cho thấy chè dây có nhiều hợp chất có khả kháng viêm, hợp chất 5,7,3’-tetrahydroxyflavanone phloretin làm giảm trình tổng hợp nitric oxit (NO) lipopolysaccharide (LPS) gây tế bào [7] Năm 2016, Phạm Thị Kim Thảo cộng có cơng bố khả kháng oxy hóa kháng khuẩn chè dây thu hái Quảng Nam Đà Nẵng, cho thấy tác dụng ức chế phát triển chủng vi khuẩn S aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus Salmonella typhi [8] Tuy nhiên, nghiên cứu khảo sát tác động cao chiết tổng ethanol chủng vi khuẩn S.aureus thông thường Trong nghiên cứu này, tiến hành phân lập vi khuẩn S.aureus từ bệnh phẩm bệnh nhân nhiễm trùng da khảo sát khả kháng lại vi khuẩn cao tổng ethanol cao phân đoạn có độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexane, n-butanol ethylacetate chiết xuất từ chè dây địa thu hái xã Hoà Bắc, huyện Hoà Vang, thành phố Đà Nẵng Kết nghiên cứu bước đầu sở cho việc tìm hợp chất từ chè dây có tiềm ứng dụng hỗ trợ điều trị bệnh nhân nhiễm trùng, từ định hướng tiếp tục phát triển thành sản phẩm thực phẩm chức Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1.Vật liệu nghiên cứu Vi khuẩn Staphylococcos aureus phân lập từ bệnh nhân nhiễm trùng da Bệnh viện Da liễu Đà Nẵng Việc sử dụng mẫu bệnh phẩm cho nghiên cứu chấp thuận hội đồng Y đức Bệnh viện Da liễu Đà Nẵng Vi khuẩn nuôi cấy bảo quản Phịng thí nghiệm Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Đà Nẵng Mẫu chè dây (bao gồm thân) thu hái khu vực đồi núi thuộc xã Hòa Bắc, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng từ tháng 6-7/2021 Hình thái phân loại mẫu chè dây xác định TS.Nguyễn Thị Thuỳ Linh, Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược – Đại học Huế 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chiết xuất cao tổng Mẫu chè dây gồm thân sau sửa sạch, cắt nhỏ sấy 50oC đến khối lượng không đổi máy sấy Memmert UFE 600 (Buechenbach, Germany) Cân 100 g chè dây sau sấy ngâm 1500 ml dung dịch cồn 70% 72 Phần dung dịch lọc qua lọc mịn 0,2 cm, phần bã tiếp tục ngâm 1500 ml dung dịch cồn 70% 72 Sau đó, phần dịch lỏng lọc qua giấy lọc Whatman No.4, dung dịch sau lọc cô đặc http://jst.tnu.edu.vn 236 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 235 - 242 máy cô quay chân không (EYELA, Nhật Bản) Cuối cùng, dung dịch chiết xuất phân đoạn loại dung mơi có độ phân cực tăng dần, n-hexane, n-butanol ethylacetate 2.2.2 Phân lập vi khuẩn S.aureus Dùng tăm vô khuẩn loại dùng lần thu lấy dịch mủ từ vết thương bàn chân bệnh nhân, cấy trải môi trường chọn lọc Brain Heart Infusion (BHI-Himedia; thành phần bao gồm HM Infusion powder 12,5g/l; bột BHI 5g/l; Proteose peptone 10g/l; Glucose 2g/l; NaCl 5g/l; Na2HPO4 2,5g/l; Agar 15g/l; pH=7,4 ± 0,2) nuôi cấy 24 37oC Những khuẩn lạc có màu vàng tiếp tục cấy ria môi trường thạch máu BA (blood agar – Himedia; HM peptone 10g/l; tryptose 10g/l; NaCl 5g/l; agar 15g/l; pH 7,3 ± 0,2) có bổ sung 5% máu cừu (mã sản phẩm 79365V -Nam Khoa) Chủng S.aureus thuộc nhóm tan máu beta (β-hemolysis) Đồng thời, thực thử nghiệm catalase coagulase ống nghiệm để khẳng định nhóm vi khuẩn tụ cầu vàng [9] 2.2.3 Thử nghiệm catalase Lấy khuẩn lạc S.aureus nuôi cấy môi trường thạch sau 24 37oC chuyển sang lam kính Nhỏ giọt H2O2 3% lên khuẩn lạc quan sát tượng sủi bọt sau Vi khuẩn S.aureus thuộc nhóm catalase dương tính nên thủy phân H2O2 thành H2O giải phóng O2 [9] 2.2.4 Thử nghiệm coagulase Dùng bơm tiêm hút ml dịch canh trường S.aureus cho vào lọ huyết tương thỏ đơng khơ Xoay để hịa tan hỗn hợp, sau ủ 37oC 24h Quan sát ghi nhận kết quả, nghiêng nhẹ ống để phát đơng vón Coagulase dương tính đặc điểm sinh hóa đặc trưng nhóm S.aureus [9] 2.2.5 Xác định hoạt tính kháng khuẩn cao chiết phương pháp khuếch tán đĩa thạch Phương pháp dựa khả đối kháng chất cần khảo sát với vi khuẩn mơi trường thạch Chất có khả ức chế phát triển vi khuẩn tạo vòng vô khuẩn xung quanh giếng thạch Chủng vi khuẩn S aureus nuôi lắc qua đêm môi trường Meuller Hinton Broth (MHB – Himedia; HM infusion B 300g/l; acicase 17,5g/l; tinh bột 1,5g/l; pH 7,3 ± 0,1) 37oC, 200 vịng/ phút, pha lỗng để đạt độ đục tương đương ống chuẩn 0,5 Mcfarland (Nam Khoa) Cho vào 100 μl dịch vi khuẩn pha loãng vào đĩa petri đổ môi trường Meuller Hinton Agar (MHA – Himedia; HM infusion B 300g/l; acicase 17,5g/l; tinh bột 1,5g/l; agar 15g/l; pH 7,3 ± 0,1) có độ dày mm (tương đương 20 ml MHA) Dùng que cấy trang khử khuẩn trang dịch canh trường Để khô mặt thạch 15 phút Đục lỗ có đường kính 0,9 cm mặt thạch Cho vào giếng 100 μl cao chè dây (ở nồng độ 100 mg/ml 50 mg/ml) [9] Trong thí nghiệm này, đối chứng dương kháng sinh Ampicillin 50 µg/ml đối chứng âm dung mơi hịa tan cao chiết (DMSO 10%) Để yên 30 phút nhiệt độ phòng, sau nhẹ nhàng đặt đĩa vào tủ lạnh 4oC để chất khuếch tán vào mơi trường Ủ đĩa 37oC 24 đo đường kính vịng vơ khuẩn 2.2.6 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory concentration-MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (minimum bactericidal concentration- MBC) cao chiết chè dây lên vi khuẩn S aureus Trong thử nghiệm này, cao chiết pha loãng bậc từ nồng độ ban đầu 50 mg/ml DMSO 10% Dịch vi khuẩn nuôi qua đêm pha loãng đạt mật độ ban đầu 106 CFU/ml Cho vào giếng gồm 50 μl dịch vi khuẩn 50 μl dịch cao chiết nồng độ pha loãng khác Các giếng đối chứng âm chứa cao chiết nồng độ khác http://jst.tnu.edu.vn 237 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 235 - 242 môi trường MHB Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Ủ đĩa 37oC, qua đêm Sau 24 giờ, thêm 30 μl dung dịch resazurin 0,015% (Santa Cruz, USA) vào giếng Giá trị MIC nồng độ thấp dãy thử nghiệm cao chiết ức chế tăng trưởng vi khuẩn (giếng không làm đổi màu resazurin) [10] Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) xác định phương pháp trải đĩa: 100 μl dịch thử nghiệm giếng khơng có đổi màu resazurin trải lên đĩa thạch chứa môi trường MHA ủ 37oC, sau 24 quan sát tạo thành khuẩn lạc Giá trị MBC nồng độ thấp dãy nồng độ cao chiết tiêu diệt tồn vi khuẩn [10] 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu Kết trình bày giá trị trung bình lần lặp lại thí nghiệm Các số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excel 2010 Kết bàn luận 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn S.aureus từ mẫu lâm sàng Mẫu bệnh phẩm sau thu thập chuyển sang nuôi cấy môi trường BHI, môi trường giàu chất dinh dưỡng, thường sử dụng để phân lập chủng vi khuẩn gây bệnh Chúng tơi chọn khuẩn lạc có màu vàng đặc trưng môi trường BHI tạo vùng tan máu rõ ràng quanh khuẩn lạc nuôi cấy mơi trường bổ sung 5% máu cừu (nhóm tan máu beta) Kết phân lập thể hình Tiếp theo, chúng tơi làm chủng vi khuẩn nhuộm Gram, kết quan sát kính hiển vi cho thấy vi khuẩn thuộc nhóm Gram dương, tế bào hình cầu, tập trung thành cụm, kiểu hình đặc trưng nhóm tụ cầu vàng (Hình 2) Các thử nghiệm sinh hóa coagulase catalase dương tính cho phép khẳng định vi khuẩn thuộc loài S aureus Như vậy, phân lập chủng vi khuẩn S aureus từ bệnh nhân nhiễm trùng da sử dụng chủng làm đối tượng nghiên cứu khả kháng khuẩn cao chiết từ chè dây Hình Kết phân lập vi khuẩn S.aureus mơi trường BHI (trái) mơi trường BA (phải) Hình Kết nhuộm Gram chủng vi khuẩn phân lập kính hiển vi độ phóng đại 100X http://jst.tnu.edu.vn 238 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 235 - 242 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết tổng ethanol chè dây Để phục vụ cho nghiên cứu này, tiến hành thu cao chiết tổng số dung môi ethanol 70% phương pháp trích ly rắn-lỏng, sau phân lập bước đầu nhóm hoạt chất cao tổng cách chiết qua nhiều dung môi khác theo độ phân cực tăng dần bao gồm n-hexane, n-butanol ethylacetate phương pháp trích ly lỏng-lỏng Hiệu suất q trình chiết trình bày bảng Bảng Hiệu suất q trình thu cao chiết dung mơi khác Dung môi Hiệu suất chiết (%) Ethanol 70% n-hexane 10 n-butanol 40 ethylacetate 30 Trong thử nghiệm này, chúng tơi khảo sát hoạt tính cao tổng ethanol chè dây vi khuẩn S aureus phương pháp khuếch tán đĩa Dung môi ethanol 70% sử dụng cho trình thu cao định chuẩn ethanol đánh giá dung mơi tồn khơng độc Cao định chuẩn ethanol hòa tan DMSO 10% để đạt nồng độ 100 mg/ml 50 mg/ml Hiệu ức chế phát triển vi khuẩn đánh giá dựa đường kính vịng vơ khuẩn trừ kích thước lỗ thạch mm (Hình 3) Kết trình bày bảng + 100 50 Hình Kết khuếch tán đĩa thạch cao chè dây ethanol (100; 50: nồng độ cao chiết sử dụng (mg/ml);(+): chứng dương Ampiciline; (-): chứng âm DMSO 10% Thanh kích thước tương ứng cm) Bảng Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) cao chiết ethanol chè dây Cao tổng ethanol Nồng độ cao chiết (mg/ml) 100 50 13,5 ± 2,1 9,5 ± 2,1 (Số liệu thể hiện: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn) 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết phân đoạn chè dây Tiếp theo, so sánh hoạt tính kháng khuẩn cao phân đoạn n-hexane, nbutanol ethylacetate (Hình 4) Kết khuếch tán đĩa thạch cho thấy vi khuẩn S aureus nhạy với cao ethylacetate cao n-butanol có hình thành vịng vô khuẩn nồng độ khảo sát, ngược lại vi khuẩn kháng lại cao phân đoạn n-hexane Cụ thể, phân đoạn ethylacetate có hiệu kháng khuẩn cao với đường kính vịng vơ khuẩn nồng độ 100 mg/ml 13,5 ± 0,7 (mm) Cao phân đoạn n-butanol nồng độ 100 mg/ml có hiệu kháng khuẩn thấp hơn, đường kính vịng vơ khuẩn 9,50 ± 0,21 (mm) Khơng xuất vịng kháng khuẩn giếng đối chứng âm DMSO 10%, chứng tỏ dung môi sử dụng thử nghiệm không ảnh hưởng đến hoạt tính cao chiết (Hình 4) Từ kết khảo sát bước đầu khẳng định cao chè dây kháng lại vi khuẩn S aureus phân lập từ mẫu bệnh phẩm Kết Hình cho thấy cao ethylacetate chè dây cho hoạt tính kháng S aureus mạnh so với phân đoạn n-hexane n-butanol Vì phân đoạn ethylacetate lựa chọn http://jst.tnu.edu.vn 239 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 235 - 242 cho thí nghiệm để đánh giá chi tiết hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn cao chiết A B C Hình Kết khuếch tán đĩa thạch cao chè dây phân đoạn (A)- cao ethylacetate; (B)- Cao n-butanol; (C)- Cao n-hexane (100; 50: nồng độ cao chiết sử dụng (mg/ml);(+): chứng dương Ampiciline; (-): chứng âm DMSO 10% Thanh kích thước tương ứng cm) 3.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) cao phân đoạn ethylacetate chè dây lên vi khuẩn S aureus Chúng chọn cao phân đoạn ethylacetate để xác định giá trị MIC MBC Dựa vào thay đổi màu sắc thuốc thử resazurin đĩa 96 giếng xác định nồng độ ức chế tối thiểu cao chiết Ampicilin nồng độ 50 µg/ml ức chế phát triển chủng S aureus nên giếng có bổ sung kháng sinh thuốc thử resazurin giữ màu xanh, vi khuẩn mẫu có bổ sung dung mơi DMSO 10% phát triển bình thường nên chuyển hóa resazurin (màu xanh) thành resorufin (màu hồng) Các giếng có bổ sung cao chiết nồng độ từ 50 mg/ml đến 0,4 mg/ml giữ màu xanh thuốc thử resazurin, chứng tỏ vi khuẩn S aureus bị ức chế cao chiết Trong đó, chuyển màu thuốc thử từ xanh sang hồng bắt đầu xuất giếng có nồng độ cao chiết nhỏ 0,2 mg/ml Kết thể hình cho phép xác định giá trị MIC cao phân đoạn ethylacetate 0,1 mg/ml Ở giếng có cao chiết mơi trường ni cấy vi khuẩn MHB không làm thay đổi màu dung dịch resazurin, chứng tỏ thành phần hợp chất cao chiết không ảnh hưởng đến hoạt động thuốc thử (Hình 5) Hình Kết xác định giá trị MIC cao phân đoạn ethylacetate S.aureus: giếng bổ sung dịch vi khuẩn + cao chiết có nồng độ tương ứng với giá trị ghi bên trái (từ 50 mg/ml đến mg/ml); MHB+cao chiết: giếng bổ sung cao chiết có nồng độ tương ứng với giá trị ghi bên trái môi trường nuôi cấy vi khuẩn MHB; chứng dương giếng chứa dịch vi khuẩn có bổ sung kháng sinh Ampiciline nồng độ 50 µg/ml); chứng âm giếng chứa dịch vi khuẩn có bổ sung dung mơi DMSO 10% http://jst.tnu.edu.vn 240 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 235 - 242 Tiếp theo, chúng tối tiến hành xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC xử lý dịch vi khuẩn S.aureus (106 CFU/ml) với cao chiết phân đoạn ethylacetate có nồng độ 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml 0,8 mg/ml cấy trải môi trường MHA Kết cho thấy cao phân đoạn từ nồng độ 0,4 mg/ml ức chế hồn tồn phát triển vi khuẩn nghiên cứu (Hình 6) Như vậy, phân đoạn ethylacetate chè dây có khả kháng khuẩn S.aureus tỉ lệ MBC/MIC Đã có nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn S.aureus số thực vật Việt Nam Cao chiết dichloromethane Núc Nác (Oroxylum indicum L.) có tác dụng ức chế phát triển S aureus ATCC 6538 với giá trị MIC, MBC là: 320