Mục tiêu của đề tài: Xác định được tỷ lệ nhiễm, định danh loài tiên mao trùng gây bệnh và áp dụng phác đồ điều trị hiệu quả cho đàn trâu của tỉnh Tuyên Quang. Chế tạo được Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN PHẠM THỊ TRANG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VÀ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG (TRYPANOSOMIASIS) Ở ĐÀN TRÂU TẠI TỈNH TUYÊN QUANG Ngành: Ký sinh trùng vi sinh vật học thú y Mã số: 62.64.01.04 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y Thái Nguyên, 2017 Luận án hoàn thành tại: TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan PGS TS Phạm Công Hoạt Ngƣời phản biện 1: Ngƣời phản biện 2: Ngƣời phản biện 3: Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Họp tại: TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia - Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên - Thƣ viện Trƣờng Đại học Nông Lâm - ĐH Thái Ngun DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Văn Quang, Nguyễn Thị Ngân, Lê Minh, Phan Thị Hồng Phúc, Phạm Diệu Thùy, Phạm Thị Trang, Trần Nhật Thắng (2014), “Tình hình nhiễm Tiên mao trùng đàn trâu tỉnh Tuyên Quang xác định phác đồ điều trị hiệu quả”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn, số tháng 6, tr 91 - 95 Nguyễn Thị Thu Hiền, Phạm Thị Tâm, Trương Quốc Phong, Nguyễn Thị Kim Lan, Phạm Thị Trang (2014), “Nghiên cứu biểu gien mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng gây bệnh trâu, bị Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn, chuyên đề Khoa học công nghệ Nông lâm nghiệp miền núi, số 24, tr 90 - 95 Nguyễn Mạnh Hùng, Phạm Thị Tâm, Phạm Thị Trang, Nguyễn Thị Kim Lan (2015), “Nghiên cứu chế tạo sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây cho trâu, bò Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, Tập XXII, số 7, tr 48 - 59 Phạm Thị Trang, Nguyễn Thị Kim Lan, Phạm Công Hoạt (2017), “Thử nghiệm Kit CATT để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho trâu tỉnh Tuyên Quang”, Tạp chí Khoa học Công nghệ (Đại học Thái Nguyên), tập 168, số 08, tr 125 - 130 MỞ ĐẦU Bệnh tiên mao trùng đơn bào T evansi gây ra, chẩn đốn điều trị khơng kịp thời gia súc chết, gây thiệt hại lớn cho người chăn ni Chính vậy, u cầu cấp thiết phải tìm phương pháp chẩn đốn bệnh nhanh, độ xác cao, chi phí thấp, dễ dàng áp dụng phạm vi rộng để điều trị kịp thời, giảm tỷ lệ chết bệnh gây Tuyên Quang tỉnh miền núi phía Bắc có điều kiện thích hợp cho bệnh tiên mao trùng phát triển Cơ sở hạ tầng phục vụ công tác chẩn đoán điều trị bệnh cho đàn gia súc địa phương nhiều hạn chế, dẫn tới hệ bệnh tiên mao trùng trở nên phổ biến hơn, nghiêm trọng gây thiệt hại lớn Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết thực tiễn, để có sở khoa học xây dựng quy trình chẩn đốn, quy trình phịng trị bệnh tiên mao trùng hiệu cho đàn trâu tỉnh Tuyên Quang, thực đề tài: "Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) đàn trâu tỉnh Tuyên Quang" * Mục tiêu đề tài - Xác định tỷ lệ nhiễm, định danh loài tiên mao trùng gây bệnh áp dụng phác đồ điều trị hiệu cho đàn trâu tỉnh Tuyên Quang - Chế tạo Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng có độ nhạy độ đặc hiệu cao * Ý nghĩa khoa học đề tài Kết đề tài thông tin khoa học tỷ lệ nhiễm, nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán biện pháp phòng chống bệnh tiên mao trùng hiệu đàn trâu tỉnh Tuyên Quang Sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ chế tạo Kit chẩn đốn hướng nghiên cứu cơng nghệ cao khẳng định việc làm chủ công nghệ, sản phẩm công nghệ cao ứng dụng vào thực tiễn sản xuất Việt Nam * Ý nghĩa thực tiễn đề tài Chế tạo Kit từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 loài T evansi phục vụ cơng tác chẩn đốn bệnh nhanh kịp thời, áp dụng phác đồ điều trị bệnh hiệu quả, từ góp phần nâng cao số lượng chất lượng đàn trâu, cải thiện đời sống cho người chăn ni * Những đóng góp đề tài Chế tạo Kit từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 loài T evansi, Kit chế tạo có độ nhạy độ đặc hiệu 97%, áp dụng chẩn đoán nhanh bệnh tiên mao trùng địa phương * Bố cục Luận án Luận án gồm 147 trang chia thành chương, phần: mở đầu trang; chương 1: Tổng quan tài liệu 34 trang; chương 2: Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu 27 trang; chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận: 66 trang; Kết luận đề nghị: trang; Tài liệu tham khảo: 15 trang; Phụ lục: 14 trang Luận án có 20 bảng, 40 hình (15 hình vẽ sơ đồ, đồ thị, biểu đồ; 25 hình ảnh kết phân tích kỹ thuật sinh học phân tử), 128 tài liệu tham khảo (32 tài liệu tiếng việt, 96 tài liệu tiếng nước ngoài) CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Theo Phạm Sỹ Lăng cs (2008), Hasan M U cs (2006), Youssif F cs (2008), bệnh tiên mao trùng - Trypanosomiasis - bệnh ký sinh trùng đơn bào Protozoa, lớp trùng roi Flagellata gây Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh hầu hết lồi thú ni thú hoang, thấy phổ biến trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo, sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi, thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch , không ký sinh người Haridy F M cs (2011), Sumbria D cs (2014) cho biết, phân bố địa lý bệnh liên tục từ khu vực phía bắc châu Phi, qua Trung Đông đến khu vực Đông Nam Á Bệnh phổ biến trâu, bò, ngựa nước nhiệt đới châu Phi, châu Á Nam Mỹ Việc chẩn đốn bệnh tiên mao trùng tương đối khó khăn bệnh có có mạch máu ngoại vi, có khơng Biểu lâm sàng bệnh tiên mao trùng lúc phát Chính vậy, việc chẩn đốn qua triệu chứng lâm sàng trâu, bị có độ xác khơng cao Do đó, ngồi chẩn đốn qua triệu chứng lâm sàng, cần phải tiến hành phương pháp chẩn đoán phịng thí nghiệm để có kết chẩn đốn xác Theo Tổ chức Thú y giới OIE (2012), chưa có vắc xin đặc hiệu để phịng bệnh tiên mao trùng cho gia súc Tuy nhiên, phòng bệnh tiên mao trùng biện pháp phòng bệnh tổng hợp Nhiều loại hóa dược sử dụng để điều trị bệnh tiên mao trùng cho gia súc Naganin, novarsenobenzol, trypamidium, berenil (azidin) loại hóa dược sử dụng nhiều năm nước ta cho kết khơng ổn định Vì vậy, muốn nâng cao biện pháp điều trị bệnh tiên mao trùng cần điều trị bệnh biện pháp tổng hợp, vừa ý chăm sóc vật ốm, vừa dùng thuốc đặc hiệu thu kết tốt (Nguyễn Thị Kim Lan, 2012) CHƢƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Bệnh tiên mao trùng đơn bào T evansi gây trâu huyện tỉnh Tuyên Quang: huyện Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên Chiêm Hóa - Kháng nguyên RoTAT 1.2 T evansi - Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 2.1.2.1 Địa điểm triển khai: tỉnh Thái Nguyên Bắc Giang 2.1.2.2 Địa điểm xét nghiệm mẫu - Đề tài thực nông hộ huyện tỉnh Tuyên Quang: huyện Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên Chiêm Hóa - Địa điểm xét nghiệm mẫu: + Phịng thí nghiệm Khoa Chăn ni thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên + Trung tâm Chẩn đốn thú y Trung ương + Khoa Cơng nghệ sinh học - Viện đại học mở Hà Nội 2.1.3 Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2013 - 2017 2.2 Vật liệu nghiên cứu * Các loại mẫu nghiên cứu: Mẫu máu trâu thu thập huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang; Đơn bào T evansi: phân lập từ máu trâu mắc bệnh tiên mao trùng tỉnh Tuyên Quang * Thiết bị dụng cụ: Tủ ấm ổn nhiệt; Lò vi sóng: Sanyo (Nhật) Máy PCR (Gen Amp PCR system 9700); Máy phân tích trình tự ADN ABI 3100 - Avant: Applied BioSiences (Mỹ) Máy PCR (Thermo cycle): Bio - Rad (Pháp) Máy ly tâm lạnh (Biofuge Primo R): Heraeus (Mỹ) Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320): Thommas Scientific (Mỹ) Máy chụp ảnh Gel - Doc: Dolphin (Mỹ), Tủ lạnh - 20oC, - 80oC; Tủ an toàn sinh học cấp II: Nuaire (Mỹ), xi lanh, kim tiêm, lam kính lamen * Hóa chất: Các loại hóa chất hãng Fementas, Sigma, BioLabs Applied BioSiences (Mỹ) sản xuất bao gồm: acrylamide, Bis-acrylamide, Tris-HCl, Tris base, Tricine, glycerol, sucrose, ethylene glycol, benzamidine, xanh methylene, X - gal, agarose, peptone, yeast extract, EDTA, PMSF, SDS, APS, TEMED, Tween 20, TMB, IPTG, NaHPO4, NaCl, NaH2PO4, K2HPO4, KH2PO4, NaOH, MgSO4, MgCl2, CaCl2, * Thuốc điều trị tiên mao trùng: azidin, trypamidium samorin, trypanosoma, cafein natri benzoat 20%, nước sinh lý mặn, vitamin C 5%, vitamin B1 2,5% 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng đàn trâu tỉnh Tuyên Quang áp dụng phác đồ điều trị - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu tỉnh Tuyên Quang - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu theo lứa tuổi - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu theo tính biệt - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu theo mùa vụ - Xác định loài tiên mao trùng gây bệnh đàn trâu tỉnh Tuyên Quang - Áp dụng phác đồ hiệu điều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu tỉnh Tuyên Quang 2.3.2 Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu tỉnh Tuyên Quang 2.3.2.1 Nghiên cứu điều kiện tách dòng xác định trình tự gen mã hóa kháng ngun bề mặt RoTAT 1.2 loài tiên mao trùng T evansi - Tách ADN tổng số từ tiên mao trùng T evansi - Khuếch đại gen RoTAT 1.2 kỹ thuật PCR - Tách dịng xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T evansi 2.3.2.2 Nghiên cứu biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T evansi - Tạo dòng vector biểu pET22b (+) mang gen đích RoTAT 1.2 - Chọn dịng mang cấu trúc biểu pET22 - RoTAT 1.2 tái tổ hợp - Biểu protein RoTAT 1.2 tái tổ hợp - Xác định điều kiện biểu gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 vi khuẩn E coli 2.3.2.3 Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng - Nghiên cứu xác định điều kiện gắn kháng nguyên lên hạt latex - Đánh giá ảnh hưởng chất nhuộm màu kháng nguyên đến mức độ ngưng kết - Xác định điều kiện bảo quản kháng nguyên tái tổ hợp - Xây dựng quy trình sử dụng Kit CATT chế tạo - Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu Kit CATT chế tạo để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng - Xác định điều kiện bảo quản Kit CATT - Thử nghiệm Kit CATT chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng đàn trâu tỉnh Tuyên Quang áp dụng phác đồ điều trị - Thu thập mẫu máu trâu huyện tỉnh Tuyên Quang theo phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc Mẫu thu thập ngẫu nhiên hộ nuôi trâu - Xét nghiệm mẫu phương pháp sau: xem tươi, tiêm truyền chuột nhắt trắng - Định danh tiên mao trùng kỹ thuật sinh học phân tử, giải trình tự gen 18S tiên mao trùng, đối chiếu hình ảnh BLAST với Ngân hàng gen giới (genBank) để có kết mức độ tương đồng gen, từ xác định lồi tiên mao trùng - Áp dụng phác đồ điều trị diện hẹp, phác đồ điều trị cho trâu Sau đó, áp dụng phác đồ diện rộng cho trâu nhiễm tiên mao trùng tỉnh Tuyên Quang để đánh giá hiệu 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu tỉnh Tuyên Quang 2.4.2.1 Phương pháp nghiên cứu tách dịng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng T evansi Từ mẫu máu chuột có chứa T evansi phân lập từ trâu bị mắc bệnh tiên mao trùng tỉnh Tuyên Quang, tiến hành tách ADN tổng số Kết tách ADN tổng số kiểm tra đánh giá phương pháp điện di gel agarose 1% Gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 tiên mao trùng khuếch đại cặp mồi gồm mồi xuôi RoTAT 1.2F: 5’-ATA GAA TTC AGG GGT GTT TAA AGC AA-3’ mồi ngược RoTAT 1.2R: 5’-AAT GTC GAC TAG TGC GTG TGT TCG-3’ Phản ứng PCR thực với 35 chu kỳ theo chu trình nhiệt: 95ºC/5 phút, 95ºC/30 giây, 57ºC/30 giây, 72ºC/30 giây Sau phản ứng tiếp tục 10 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tình hình nhiễm tiên mao trùng đàn trâu huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang áp dụng phác đồ điều trị hiệu 3.1.1 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang Bằng phương pháp tiêm truyền chuột nhắt trắng, xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu Tuyên Quang Kết trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang Địa phƣơng (Huyện) Số trâu kiểm tra (con) Số trâu nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Yên Sơn 257 28 10,89 Hàm Yên 264 35 13,26 Chiêm Hóa 252 41 16,27 Sơn Dương 132 15 11,36 Tính chung 905 119 13,15 So sánh tỷ lệ nhiễm huyện χ2Yên Sơn, Hàm Yên = 0,684 P = 0,408 χ Hàm Yên, Chiêm Hóa = 0,931 P = 0,334 χ Chiêm Hóa, Sơn Dương = 1,674 P = 0,196 χ2 Yên Sơn, Sơn Dương = 0,019 P = 0,889 χ2 Hàm Yên, Sơn Dương = 0,286 P = 0,593 χ Yên Sơn, Chiêm Hóa = 3,137 P = 0,077 χ tính chung = 3,664 P = 0,300 11 Kết bảng 3.1 cho thấy: Trong tổng số 905 trâu kiểm tra huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang có 13,15% số trâu nhiễm tiên mao trùng Mặc dù tỷ lệ khơng cao, song tính chất nguy hiểm bệnh tiên mao trùng nên tỷ lệ nhiễm có ý nghĩa dịch tễ học bệnh 3.1.2 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo lứa tuổi trâu tỉnh Tuyên Quang Kết tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng theo tuổi trâu trình bày đồ thị hình 3.2 Tỷ lệ nhiễm (%) 30 26,36 25 20 14,29 15 10 10,34 6,40 ≤2 >2-5 >5-8 >8 (Tuổi) Hình 3.2 Đồ thị biến động nhiễm tiên mao trùng trâu theo lứa tuổi Hình 3.2 cho thấy: Tỷ lệ nhiễm trâu tăng dần theo tuổi Trâu năm tuổi nhiễm với tỷ lệ thấp (6,40%), tiếp đến trâu năm tuổi (10,34%), trâu - năm tuổi nhiễm với tỷ lệ cao (14,29%), đặc biệt trâu tuổi tỷ lệ nhiễm cao (26,36%) Theo kết xử lý thống kê, tỷ lệ nhiễm lứa tuổi trâu sai khác rõ rệt 12 3.1.3 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu theo tính biệt Kết tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu theo tính biệt trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu theo tính biệt Tính biệt Đực Cái Số trâu kiểm tra (con) 536 369 Số trâu nhiễm (con) 69 50 Tỷ lệ nhiễm (%) 12,87 13,55 So sánh tỷ lệ nhiễm trâu đực trâu χ2đực, = 0,088 P = 0,767 Tính chung 905 119 13,15 Qua kết bảng 3.3 cho thấy: Kiểm tra 536 trâu đực có 69 trâu nhiễm tiên mao trùng; 369 trâu kiểm tra có 50 trâu bị nhiễm tiên mao trùng Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu đực 12,87%, tỷ lệ nhiễm trâu 13,55% Theo đó, tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu cao so với trâu đực Tuy nhiên, qua xử lý thống kê cho thấy sai khác không rõ rệt (P > 0,05) 3.1.4 Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu theo mùa vụ Kết tỷ lệ nhiễm theo mùa trình bày biểu đồ hình 3.4 Tỷ lệ nhiễm (%) 17,21 18 16 14 12 10 14,46 12,39 8,21 Xn Hè Thu Đơng Hình 3.4 Biểu đồ tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu theo mùa năm 13 Biểu đồ hình 3.4 cho thấy, trâu bị nhiễm tiên mao trùng mùa điều tra có khác mùa Mùa xuân, trâu có tỷ lệ nhiễm thấp (8,21%) Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng tăng dần từ mùa xuân đến hè, thu cao vào mùa đông (17,21%) 3.1.5 Kết xác định loài tiên mao trùng gây bệnh đàn trâu tỉnh Tuyên Quang Sau phân lập chủng tiên mao trùng ký sinh trâu nuôi 13 xã thuộc huyện tỉnh Tuyên Quang, kỹ thuật sinh học phân tử, định danh loài tiên mao trùng gây bệnh Trên sở liệu thu nhận được, xây dựng phả hệ dựa trình tự nucleotide chuỗi gen 18S 19 mẫu (bao gồm bốn mẫu nghiên cứu) Kết xây dựng mối quan hệ phả hệ trình bày hình 3.8 96 T.evansi-DH4-India(KY114580) T.evansi-India(KT023565) T.evansi-Sam-Thailand(AY912269) T.evansi-Cairo-Egypt-Egypt(AB551919) T.evansi-Cairo-Egypt(AB551921) T.evansi-PH1-India(KY114576) 66 T.evansi-PK6-India(KY114578) 67 T.evansi-Cairo-Egypt(AB551920) T.evansi-CB2-India(KY114579) T.evansi-Cairo-Egypt(AB551922) T.evansi-KAI-Thailand(AY912268) T.evansi-B18-Thailand(AY904050) T.evansi-CK5-India(KY114577) T.evansi-Tansui-Taiwan(D89527) T.evansi-Batongtani-Thailand(U75507) TEV-HY-VN TEV-SD-VN 99 TEV-CH-VN 78 66 TEV-YS-VN 0.001 Hình 3.8 Cây phả hệ dựa trình tự nucleotide gen 18S Tev-CH-VN; Tev-HY-VN; Tev-SD-VN Tev-YS-VN với mẫu Trypanosoma evansi đƣợc đăng ký Ngân hàng gen Ghi chú: Ký hiệu (♦) mẫu nghiên cứu 14 Hình 3.8 cho thấy: Các mẫu Tev-CH-VN; Tev-HY-VN; TevSD-VN Tev-YS-VN định danh xác tiên mao trùng Trypanosoma evansi 3.1.6 Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu tỉnh Tuyên Quang 3.1.6.1 Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng diện hẹp Để có sở cho việc chọn lựa phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng đạt hiệu cao an toàn, tiến hành điều trị diện hẹp cho trâu thí nghiệm Kết tổng hợp trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng diện hẹp Kết (-)/(+) Số Phác Sau - Sau - 15 Sau 16 - 25 Sau 26 - 35 TT đồ ngày dùng ngày dùng ngày dùng ngày dùng trâu thuốc thuốc thuốc thuốc + I + II III + Kết bảng 3.6 cho thấy: Cả phác đồ có hiệu lực diệt tiên mao trùng, đó, phác đồ II có tác dụng trị tiên mao trùng nhanh triệt để Từ sau ngày thứ đến ngày thứ 35 sau điều trị, kiểm tra thấy trâu tiên mao trùng, khơng thấy trâu có phản ứng cục toàn thân 15 3.1.6.2 Áp dụng phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng diện rộng Từ kết áp dụng diện hẹp, tiến hành áp dụng phác đồ diện rộng cho số trâu bị nhiễm tiên mao trùng huyện tỉnh Tuyên Quang Kết trình bày bảng 3.7 Bảng 3.7 Thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh tiên mao trùng diện rộng Số trâu điều Số trâu (-) sau điều Tỷ lệ Phác đồ trị (con) trị (con)* (%) I 38 36 94,74 II 42 42 100 III 39 38 97,44 Tính chung 119 116 97,48 Ghi chú: * Kiểm tra khơng cịn tiên mao trùng vòng 30 ngày sau điều trị Kết bảng 3.7 cho thấy: Thuốc azidin điều trị cho 38 trâu bị nhiễm tiên mao trùng Sau 30 ngày dùng thuốc, kiểm tra mẫu máu thấy 36/38 trâu khơng cịn tiên mao trùng, hiệu lực đạt 94,74% Thuốc trypanosoma điều trị 39 trâu bị nhiễm tiên mao trùng có 38/39 trâu tiên mao trùng, hiệu lực điều trị đạt 97,44% Thuốc trypamidium samorin điều trị cho 42 trâu bị nhiễm tiên mao trùng, hiệu lực điều trị đạt 100% 3.2 Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu tỉnh Tuyên Quang 3.2.1 Kết tách dòng xác định trình tự gen mã hóa kháng ngun bề mặt RoTAT 1.2 T evansi 3.2.1.1 Kết tách ADN tổng số T evansi Từ mẫu máu chuột có chứa T evansi phân lập từ trâu bị mắc bệnh tiên mao trùng tỉnh Tuyên Quang, tiến hành tách ADN tổng số Kết tách ADN tổng số kiểm tra đánh giá phương pháp điện di gel agarose 1% ghi lại hình 3.9 16 Hình 3.9 Kết điện di ADN tổng số Ghi chú: (Giếng 1: ADN tổng số tách được; Giếng 2: Marker) Hình 3.9 cho thấy, hình ảnh điện di gel agarose 1% ADN tổng số tách chiết đảm bảo đủ điều kiện để thực thí nghiệm nghiên cứu 3.2.1.2 Kết khuếch đại gen RoTAT 1.2 kỹ thuật PCR Chúng tiến hành khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 phục vụ cho việc tách dòng biểu gen tế bào vi khuẩn E coli Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu ADN tổng số Ghi chú: (Giếng 1: marker; Giếng 2, 3: sản phẩm PCR mẫu ADN tổng số) Kết điện di đồ hình 3.10 cho thấy, sản phẩm PCR mẫu ADN tổng số tách từ tiên mao trùng phân lập có kích thước khoảng 205 bp Kích thước phù hợp với kích thước lý thuyết đoạn gen RoTAT 1.2 17 3.2.1.3 Tách dịng xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T evansi Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 thực cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR xử lý cắt đầu vào vector tách dòng pJET1.2/blunt hãng Fermentas - Giải trình tự đoạn gen RoTAT 1.2 tạo dòng Plasmid pJET1.2 - RoTAT 1.2-1 gửi xác định trình tự đoạn gen đích cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) Trình tự đoạn gen so sánh với trình tự cơng bố Ngân hàng gen Quốc tế phần mềm BLAST Kết so sánh cho thấy, trình tự xác định có độ tương đồng 100% so với trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T evansi công bố Ngân hàng gen Quốc tế Kết khẳng định đoạn gen gắn vào vector tách dịng pJET1.2/blunt đoạn gen đích RoTAT 1.2 Điều chứng tỏ chúng tơi tách dịng thành cơng gen RoTAT 1.2 mã hóa kháng ngun bề mặt tiên mao trùng T evansi 3.2.2 Kết biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T evansi Vector lựa chọn để biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng T evansi vector pET22b (+) hãng Novagen, có chiều dài 5.493 bp Sản phẩm cắt enzyme gen RoTAT 1.2 vector pET22b (+) xuất băng nhất, có kích thước 205 bp 5,5 kb, tương tự kích thước lý thuyết gen RoTAT 1.2 vector pET22b (+) Kết chứng tỏ, sản phẩm PCR sau cắt hai enzyme giới hạn EcoRI SalI có chất lượng tốt cho phép tiến hành việc nối đoạn gen RoTAT 1.2 vào vector biểu pET22b (+) 18 Sự biểu protein gen RoTAT 1.2 khẳng định phương pháp lai Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng RoTAT 1.2 Kết lai Western blot thể hình 3.24 10 kDa kDa Hình 3.24 Phản ứng western blot kiểm tra tính đặc hiệu protein RoTAT 1.2 Ghi chú: M: Thang protein chuẩn; 1: Kháng nguyên hòa tan T evansi với kháng thể đặc hiệu; 2: Protein RoTAT 1.2 với kháng thể đặc hiệu T evansi; 3: Đối chứng âm Kết phản ứng western blot hình 3.24 cho thấy: Protein nhận biết đặc hiệu kháng thể kháng T evansi, vạch phản ứng protein RoTAT 1.2 với kháng thể đặc hiệu với T evansi tương đương với vạch phản ứng kháng nguyên hòa tan T evansi với kháng thể đặc hiệu Kết cho phép kết luận rằng, kháng nguyên RoTAT 1.2 chế tạo thành công công nghệ tái tổ hợp gen * Nghiên cứu xác định điều kiện biểu gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 vi khuẩn E coli Từ kết thử nghiệm điều kiện biểu gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 vi khuẩn E coli, rút kết luận: Điều kiện biểu gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 vi khuẩn E coli 37°C thời gian giờ, pH môi trường 7, vi khuẩn có mật độ OD600 = 0,8; nồng độ kháng sinh ampicillin 100 g/ml Điều kiện cảm ứng IPTG thích hợp để biểu kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 là: nồng độ 0,1 mM, thời gian giờ, nhiệt độ 30°C 19 3.2.3 Kết nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 3.2.3.1 Kết xác định điều kiện gắn kháng nguyên lên hạt latex Chúng tơi làm thí nghiệm với yếu tố sau: Mật độ hạt latex: sử dụng mật độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 0,5 Nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2: 200, 250, 300, 350, 400, 450 500 µg/ml Huyết dương tính chuẩn lấy từ trâu gây nhiễm T evansi, pha loãng dung dịch PBS theo tỷ lệ 1: 16 Huyết âm tính chuẩn sử dụng huyết bào thai bê pha loãng theo tỷ lệ 1: 16 Chúng tơi thực thí nghiệm gắn kháng nguyên RoTAT 1.2 lên hạt latex điều kiện nhiệt độ 37ºC điều kiện nhiệt độ 37ºC 30 phút tiếp tục lắc 4ºC 24 Kết nghiên cứu cho thấy: Hàm lượng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 tối ưu q trình tạo Kit CATT chẩn đốn bệnh tiên mao trùng nồng độ 300 µg/ml mật độ hạt latex: OD600= 0,3 Kháng nguyên RoTAT 1.2 gắn lên hạt latex tốt điều kiện lắc 37ºC 30 phút tiếp tục lắc 4ºC thời gian 24 3.2.3.2 Kết đánh giá ảnh hưởng chất nhuộm màu kháng nguyên đến mức độ ngưng kết Việc lựa chọn chất nhuộm màu phản ứng bước quan trọng để kết phản ứng dễ dàng quan sát Các chất nhuộm màu kháng nguyên dùng nghiên cứu xanh methylene, xanh malachite safranin 0,5% Kết thí nghiệm cho thấy, chất tạo màu phản ứng xanh methylene cho hiệu quan sát tốt lựa chọn tối ưu để sử dụng cho Kit CATT chẩn đoán tiên mao trùng 3.2.3.3 Kết xác định điều kiện bảo quản kháng nguyên tái tổ hợp Kháng ngun tái tổ hợp có chất protein Vì vậy, để bảo quản kháng nguyên cần phải xác định điều kiện bảo quản protein, nhằm đảm bảo chất lượng kháng nguyên 20 Kết thử nghiệm lựa chọn chất ức chế phân giải, chất ổn định protein chất diệt khuẩn nhiệt độ - 20oC, 4oC, nhiệt độ phịng cho phép chúng tơi nhận xét: Điều kiện bảo quản kháng nguyên tái tổ hợp là: bổ sung EDTA, glycerol, sodium azide 0,02% bảo quản 12 tháng - 20oC, tháng 4oC 3.2.3.4 Xây dựng quy trình sử dụng Kit CATT chế tạo Chúng nghiên cứu xây dựng quy trình sử dụng Kit CATT gồm bước sau: Chuyển Kit nhiệt độ phòng trước sử dụng; Sử dụng pipette, lấy 0,5 ml dung dịch pha loãng huyết vào ống eppendorf; Lấy 0,1 ml huyết cần chẩn đoán trộn vào ống eppendorf có chứa dung dịch pha lỗng huyết thanh, pha loãng theo tỷ lệ 1/32; Nhỏ lên vòng tròn card phản ứng, vòng tròn 20 µl dung dịch kháng nguyên gắn lên hạt latex; Nhỏ mẫu huyết cần chẩn đoán, huyết dương tính chuẩn, huyết âm tính chuẩn vào vòng tròn chứa kháng nguyên Mỗi vòng tròn nhỏ 20 µl dung dịch huyết (huyết cần chẩn đốn, huyết dương tính chuẩn, huyết âm tính chuẩn); Dùng que trộn, trộn giọt kháng nguyên huyết Giữ card phản ứng nhiệt độ phòng 10 phút đọc kết dựa hình thành đám ngưng kết 3.2.3.5 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu phản ứng sử dụng Kit CATT chế tạo trâu thí nghiệm Ngay sau chế tạo Kit, để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trâu Kết phản ứng sử dụng Kit CATT với mẫu huyết nói thể bảng 3.16 21 Bảng 3.16 Kết phản ứng sử dụng Kit CATT phát kháng thể kháng T evansi huyết trâu Xét nghiệm (+) Mẫu huyết trâu nhiễm T evansi 49 Các mẫu huyết trâu không nhiễm T evansi Xét nghiệm (-) 75 75 Tổng số 49 76 125 Các xét nghiệm Tổng số 50 Kết bảng 3.16 cho thấy: Trong mẫu huyết trâu nhiễm T evansi, Kit CATT phát 49 mẫu (số mẫu dương tính thật 49), khơng có mẫu có kết âm tính giả Trong số 76 mẫu huyết trâu khơng nhiễm T evansi, có 75 âm tính thật phát Kit CATT, có mẫu dương tính giả Từ kết trên, độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng sau: Độ nhạy phản ứng (Se) 100% Độ đặc hiệu phản ứng (Sp) 98,68% 3.2.3.6 Kết xác định điều kiện bảo quản Kit CATT Chúng tiến hành nghiên cứu điều kiện nhiệt độ thời gian bảo quản Kit Chúng tơi bố trí thí nghiệm đánh giá Kit bảo quản 4ºC nhiệt độ phòng Định kỳ hàng tháng kiểm tra lại độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng sử dụng Kit Kết theo dõi ảnh hưởng nhiệt độ thời gian bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu phản ứng sử dụng Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho thấy: Sau tháng bảo quản, độ nhạy phản ứng giảm từ 98% xuống 90% 4ºC 62% nhiệt độ phòng, độ đặc hiệu Kit giảm từ 98% 92% 4ºC giảm 58% nhiệt độ phịng Qua kết kết luận: Kit CATT bảo quản o C tháng, nhiệt độ phòng tháng 22 3.2.3.7 Kết thử nghiệm Kit CATT chế tạo từ kháng nguyên tái tổ hợp để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho trâu tỉnh Tuyên Quang Kết so sánh hiệu chẩn đoán bệnh Kit CATT với kỹ thuật ELISA phương pháp tiêm truyền chuột tổng hợp bảng 3.20 Bảng 3.20 So sánh hiệu sử dụng Kit CATT với kỹ thuật ELISA phƣơng pháp tiêm truyền chuột Độ Giá trị dự Độ đặc Giá trị dự Phƣơng pháp nhạy báo dƣơng hiệu báo âm chẩn đốn (%) tính (%) (%) tính (%) Kit CATT 98,48 84,42 97,52 99,79 Phản ứng ELISA 98,48 82,50 97,11 99,79 Phương pháp tiêm truyền chuột 100 100 100 100 Từ kết trên, nhận thấy: phương pháp tiêm truyền chuột phương pháp chẩn đốn xác nhất, sau đến Kit CATT phản ứng ELISA Tất phương pháp có độ nhạy, độ đặc hiệu cao 97% 23 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Tỷ lệ nhiễm loài tiên mao trùng gây bệnh đàn trâu huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang áp dụng phác đồ điều trị hiệu - Trâu nuôi huyện thuộc tỉnh Tuyên Quang nhiễm tiên mao trùng với tỷ lệ 13,15%, biến động huyện 10,89% 16,27% - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu tăng dần theo tuổi, trâu năm tuổi tỷ lệ nhiễm thấp (6,40%), trâu năm tuổi tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng cao (26,36%) - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu đực 12,87%, trâu 13,55%, khác không rõ rệt - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu thấp vào mùa xuân (8,21%), tăng dần mùa hè, mùa thu tỷ lệ nhiễm cao vào mùa đơng (17,21%) - Lồi tiên mao trùng gây bệnh đàn trâu huyện Sơn Dương, Yên Sơn, Hàm Yên Chiêm Hóa tỉnh Tuyên Quang loài T evansi - Sử dụng phác đồ gồm trypamidium samorin liều 1,0 mg/kgTT; nước muối sinh lý 200 ml/con; cafein 20% 15 ml/con; vitamin C 5% 15 ml/con; vitamin B1 2,5% 15 ml/con điều trị bệnh tiên mao trùng cho trâu tỉnh Tuyên Quang đạt hiệu cao an toàn (100%), sau 28 ngày không thấy tái nhiễm tiên mao trùng 1.2 Kết nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng - Đã tạo dịng thành cơng gen mã hóa kháng ngun bề mặt T evansi có kích thước 205 bp vi khuẩn E coli BL21 vector nhân dòng pJET 1.2 - Đã thiết kế thành công vector tái tổ hợp pJET1.2 - RoTAT 1.2, thực tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T 24 evansi giải trình tự gen mã hóa kháng ngun RoTAT 1.2 Trình tự gen tương đồng 99 - 100% với trình tự cơng bố ngân hàng gen - Thiết kế thành công vector tái tổ hợp pET 22 - RoTAT 1.2 biểu gen mã hóa kháng nguyên bề mặt T evansi - Đã biểu thành cơng gen mã hóa kháng ngun RoTAT 1.2 T evansi vi khuẩn E coli BL21 (DE3) - Đã sản xuất kháng nguyên RoTAT 1.2 tái tổ hợp, kháng nguyên có trọng lượng kDa - Nồng độ kháng nguyên RoTAT 1.2 300 µg/ml, mật độ hạt latex OD600= 0,3 Điều kiện gắn kháng nguyên RoTAT 1.2 lên hạt latex tốt lắc 37ºC 30 phút tiếp tục lắc 4ºC 24 - Điều kiện bảo quản kháng nguyên tái tổ hợp là: bổ sung EDTA, glycerol, sodium azide 0,02% bảo quản 12 tháng 20oC, tháng 4oC - Kit CATT bảo quản 4oC tháng, nhiệt độ phòng tháng - Độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng với Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 98,48 % 97,50%, tương đương với kỹ thuật ELISA Đề nghị - Tiếp tục triển khai dự án sản xuất thử Kit CATT để sớm có nguồn Kit ứng dụng chẩn đoán bệnh tiên mao trùng rộng rãi địa phương tỉnh Tuyên Quang tỉnh khác - Sử dụng phác đồ gồm trypamidium samorin liều 1,0 mg/kgTT; nước muối sinh lý 200 ml/con; cafein 20% 15 ml/con; vitamin C 5% 15 ml/con; vitamin B1 2,5% 15 ml/con để điều trị bệnh tiên mao trùng cho đàn trâu, bò địa phương ... trị bệnh tiên mao trùng hiệu cho đàn trâu tỉnh Tuyên Quang, thực đề tài: "Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) đàn trâu tỉnh Tuyên Quang" ... nhiễm tiên mao trùng đàn trâu tỉnh Tuyên Quang áp dụng phác đồ điều trị - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu tỉnh Tuyên Quang - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trâu theo lứa tuổi - Tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng. .. tỷ lệ nhiễm, nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đốn biện pháp phịng chống bệnh tiên mao trùng hiệu đàn trâu tỉnh Tuyên Quang 2 Sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp phục vụ chế tạo Kit chẩn đoán hướng nghiên