Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên.
2.3.2. Phổ khối lƣợng (ESI-MS)
Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization mass spectra) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.4. Độ quay cực []D
Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4. Dụng cụ và thiết bị
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:
+ Máy cô quay chân không
+ Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm + Tủ sấy chân không
+ Máy sấy + Micropipet
+ Bình sắc ký loại phân tích và điều chế + Cột sắc ký pha thường các loại đường kính + Cột sắc ký pha ngược trung áp
+ Máy phun dung dịch thuốc thử + Bếp điện
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc
+ Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer.
+ Máy sắc kí lỏng cao áp ghép nối khối phổ (ESI) AGILENT 1100 LC- MSD Trap spectrometer.
+Thiết bị đo điểm nóng chảy Kofler micro-hotstage. + Thiết bị đo độ quay cực JASCO.
2.5. Hoá chất
+ Silica gel 60 (0,04-0,063 mm) Merck.
+ Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).
+ Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715).
+ Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
+ Các loại dung môi hữu cơ như methanol, etanol, ethyl acetate, chlorofrom, hexane, acetone, v.v.. là loại hoá chất tinh khiết của Merck.
2.6. Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất
Mẫu lá của cây đề (15 kg tươi), được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 50oC, sau cùng đem nghiền nhỏ thành bột thu được 3 kg bột khô.
Phần lá khô của Ficus religiosa L.(3kg) được đem nghiền nhỏ sau đó đem chiết với MeOH 3 lần:
+ Phần dịch chiết được quay khô với áp suất giảm để tạo thành dịch chiết MeOH (100g).
+ Phần cặn chiết sau đó được phân bố trong nước cất và chiết phân lớp với dung môi CHCl3 thu được cặn chiết CHCl3 (FR-1) và cặn nước (FR-2).
Tiến hành sắc ký cột phân lớp FR-2 với các hệ dung môi thích hợp (hình 2.1) thu được 2 hợp chất là FR-2.1 và FR-2.2.
Bột lá khô F. religiosa (3 kg) FR - Cặn MeOH (100g) FR-2: Cặn H2O (40 g) FR-1: Cặn CHCl3 (40 g) FR-21 (12g) FR-22 (6g) FR-23 (9g) FR-2.1 (20 mg) FR-2.2 (15mg) Chiết MeOH Bổ sung nước Bổ sung CHCl3 Dianion HP20 H2O:MeOH (1:0 ~ 0:1) CHCl3:MeOH (10 : 1) CHCl3 : MeOH : H2O (10 : 1 : 0,1)
Hình 2.1: Quy trình chiết và phân lập 2 hợp chất từ dịch chiết MeOH của lá
cây đề.
CHƢƠNG 3: KếT QUả Và THảO LUậN
3.1. Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất
3.1.1. Hợp chất FR-2.1: Quercetin
Hợp chất FR-2.1 nhận được ở dạng bột màu vàng cam.
- Trên phổ 1H-NMR của FR-2.1 : xuất hiện các tín hiệu của 1 vòng
benzene có hệ tương tác ABX tại 7,75 (1H, brs), 6,90 (1H, brd, J = 9,0Hz) và 7,65 (1H, brd, J = 9,0Hz). Ngoài ra còn có tín hiệu của 2 proton thơm khác cộng hưởng ở 6,20 (1H, brs) và 6,41 (1H, brs).
Các số liệu này chỉ ra rằng hợp chất FR-2.1 có khung quercetin. Kết
quả phổ 1
H-NMR của FR-2.1 được trình bày ở bảng 3.1.1.
Công thức phân tử của FR-2.1 được xác định là C15H10O7 (M = 302) bởi sự xuất hiện của các tín hiệu m/z 324,8 [M+Na]+ và 300,9 [M-H]- trên phổ khối lượng ESI-MS.
So sánh kết quả phổ 1
H-NMR của FR-2.1 với hợp chất quercetin [14]
(bảng 3.1.1) thấy phù hợp hoàn toàn, kết hợp với kết quả phổ khối lượng trên, có thể xác định hợp chất FR-2.1 là quercetin, một hợp chất rất phổ biến trong các loài thực vật. O OH OH O HO OH OH 2 3 4 10 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 6' 5'
Hình 3.1.1.3: Cấu trúc hoá học của FR-2.1 Bảng 3.1.1: Kết quả phổ 1 H-NMR của FR-2.1 Proton H # ; Mult. (J in Hz) H a,c ; Mult. (J in Hz) 6 6,18; d (2,0) 6,20; brs 8 6,40; d (2,0) 6,41; brs 2’ 7,67; d (2,2) 7,75; brs 5’ 6,89; d (8,3) 6,90; d (9,0) 6’ 7,53; dd (8,6, 2,2) 7,65; brd (9,0)
aĐo trong CD3OD, c500MHz
#Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất quercetin từ tài
liệu [14].
Hợp chất FR-2.2 nhận được ở dạng bột màu vàng.
Trên phổ 1H-NMR: xác định 3 tín hiệu proton của một vòng thơm có hệ tương tác ABX [ 7.68 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.64 (1H, dd, J = 2.0; 8.5 Hz) và 6.89 (1H, d, J = 8.5 Hz)] cùng với 2 proton thơm của một vòng thơm bị thế 4 vị trí [ 6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz) và 6.41 (1H, d, J = 2.0 Hz)], và tín hiệu của một nhóm metyl tại 1.11 (3H, d, J = 6.0 Hz). Ngoài ra trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu của 2 proton anome [ 5.13 (1H, d, J = 7.5) và 4.54 (1H, d, J = 1.5)] cho thấy hợp chất FR-2.2 chứa 2 đơn vị đường. Chi tiết phổ 1H-NMR được trình bày ở bảng 3.1.2.
Hình 3.1.2.1: Phổ 1H-NMR của hợp chất FR-2.2
Phổ Dept: xác định sự có mặt của 10 tín hiệu cacbon bậc bốn, 15 tín hiệu nhóm metin, một tín hiệu metylen và một tín hiệu metyl.
Hình 3.1.2.2: Phổ Dept của hợp chất FR-2.2
Trên phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của một cacbon cacbonyl tại 179.41 (C-4), 6 tín hiệu cacbon bậc bốn mang oxy [ 135.61 (C-3), 162.94 (C- 5), 166.05 (C-7), 159.34 (C-9), 145.83 (C-3’) và 149.79 (C-4’)] và 2 tín hiệu cacbon bậc bốn khác tại 105.62 (C-10) và 123.14 (C-1’). Tín hiệu của năm nhóm metin thơm cũng thể hiện trên phổ 13C-NMR tại [ 99.98 (C-6), 94.90 (C-8), 117.70 (C-2’), 116.08 (C-
5’) và 123.56 (C-6’)]. Phổ 13C-NMR xác nhận các tín hiệu của 2 cacbon anome 104.69 (C-1”) và 102.40 (C-1’’’), và 8 nhóm metin mang oxy của vùng đường 69.70- 78.18 cùng với một nhóm metylen mang oxy tại 68.55 (C-6”) và một nhóm metyl ở 17.86 (C-6’’’), kết hợp với các số liệu trên phổ 1H-NMR khẳng định sự có mặt của 2 đơn vị đường -glucopyranoside và - rhamnopyranoside. Từ các số liệu trên, có thể dự đoán hợp chất FR-2.2 là một flavonoid liên kết với 2 đường là -glucopyranoside và -rhamnopyranoside. Chi tiết phổ 13C-NMR được trình bày ở bảng 3.1.2.
Hình 3.1.2.3: Phổ 13C-NMR của hợp chất FR-2.2 Công thức phân tử của hợp chất FR-2.2 được xác định là C27H30O16 do sự xuất hiện của tín hiệu m/z
Hình 3.1.2.4: Phổ ESI-MS của hợp chất FR-2.2
So sánh kết quả phổ NMR của hợp chất FR-2.1 với dữ liệu phổ NMR của hợp chất rutin [13] thấy hoàn toàn phù hợp (Bảng 3.1.2). Dựa vào những kết quả trên, hợp chất FR-2.2 được xác định là rutin.
O OH 1'' 3'' 4'' 5'' 6'' OH O HO 2'' O O HO OH OH OH O 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' OH OH 1''' 3''' 4''' 5''' 6''' O 2''' OH CH3
Bảng 3.1.2: Kết quả phổ NMR của hợp chất FR-2.2 Cacbon C # (ppm) C a,b (ppm) Dept H a,c (ppm), (mult., J in Hz) 2 158,52 158,50 - 3 135,62 135,61 - 4 179,44 179,41 - 5 162,98 162,94 - 6 99,95 99,98 CH 6,22 (1H, d, J = 2,0) 7 166,01 166,05 - 8 94,87 94,90 CH 6,41 (1H, d, J = 2,0) 9 159,35 159,34 - 10 105,66 105,62 - 1’ 123,15 123,14 - 2’ 117,69 117,70 CH 7,68 (1H, d, J = 2,0) 3’ 145,84 145,83 - 4’ 149,81 149,79 - 5’ 116,06 116,08 CH 6,89 (1H, d, J = 8,5) 6’ 123,55 123,56 CH 7,64 (1H, dd, J = 2,0, 8,5) 1” 104,69 104,69 CH 5,13 (1H, d, J = 7,5)
2” 75,74 75,72 CH 3,29-3,66* 3” 78,20 78,18 CH 3,29-3,66* 4” 71,42 71,40 CH 3,29-3,66* 5” 77,25 77,21 CH 3,29-3,66* 6” 68,56 68,55 CH2 Ha: 3,82 (dd, 1,0, 11,0) Hb: 3,38* 1’’’ 102,42 102,40 CH 4,54 (1H, d, J = 1,5) 2’’’ 72,12 72,09 CH 3,29-3,66* 3’’’ 72,26 72,25 CH 3,29-3,66* 4’’’ 73,94 73,94 CH 3,29-3,66* 5’’’ 69,71 69,70 CH 3,29-3,66* 6’’’ 17,87 17,86 CH3 1,11 (3H, d, J = 6,0)
a: Đo trong CD3OD, b125 MHz, c500MHz
*: Tín hiệu bị che lấp
#: Số liệu phổ 13
Kết luận
Trong quá trình hoàn thành khóa luận với đề tài:
“Nghiên cứu thành phần Flavonoit của cây Đề (Ficus religiosa L.)”
Từ lá cây Đề (Ficus religiosa L.), bằng các phương pháp chiết và sắc ký hết hợp như sắc ký cột nhồi silica gel pha thường, sắc ký cột nhồi silica gel pha đảo, sắc ký lớp mỏng điều chế tôi đã phân lập được 2 hợp chất sau:
Hợp chất FR-2.1: Quercetin
Hợp chất FR-2.2: Rutin
Cấu trúc của các hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ hiện đại bao gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1
H-NMR, 13C- NMR, DEPT 135, DEPT 90) và phổ khối lượng.
Bảng 1: Bảng tổng hợp hai hợp chất đã phân lập được từ cặn nước FR-2. Hợp chất FR-2.1: Quercetin M = 302, C15H10O7 MS: 324,8 [M+Na]+ và 300,9 [M-H]- O OH OH O HO OH OH 2 3 4 10 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 6' 5' Hợp chất FR-2.2: Rutin M = 610, C27H30O16 MS: 633,1 [M+Na]+ và 609,2 [M-H]- O OH 1'' 3'' 4'' 5'' 6'' OH O HO 2'' O O HO OH OH OH O 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' OH OH 1''' 3''' 4''' 5''' 6''' O 2''' OH CH3
Các kết quả nghiên cứu trên đây bước đầu đã đóng góp vào việc làm sáng tỏ thành phần hoá học của cây Đề (Ficus religiosa L.) và còn giải thích
được tác dụng chữa bệnh cũng như định hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm khai thác
Tài liệu tham khảo
[1] Hayerman A.E., Butler I.G., Assay of condensed tanin or flavonoid
oligomers and related flavonoid in plant, Meth, Enz, 234, pp 249
(1994).
[2] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễ Tập và Trần Toàn, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tập I, trang 827-828 (2004).
[3] Ternai B., Markham K.R., C13-NMR of flavonoids-1-Flavones and
flavonols, Tetrehedron 32, pp 565 (1976).
[4] Chi, Võ Văn, 1999. Từ điển cây thuốc Việt Nam. NXB Y học, Hà Nội, tr. 471.
[5] Duc Do Khac, Sung Tran Van, Angela Martha Campos, Jean-Yves Lallemand and Marcel Fetizon, Ellagic acid compounds from
Diplopanax stachyanthus, Phytochemistry, Vol.29(1), pp 251-256
(1990).
[6] Mabry F.J., Markman R.B., Thomas M.B., The syrematic
indentification of flavonoids, springer Verlag-Berlin-Heidelberg-New
york, (1970).
[7] Harborn J.B., The flavonoids advance in research since 1986, Chaprman & Hall, (1994).
[8] Peter J. Houghton and Lu Minh Lian, Triterpenes from Desfontainia
[9] GS. TS. Lã Đình Mỡi (chủ biên), TS. Trần Minh Hợi, TS. Dương Đức Huyến, TS. Trần Huy Thái, TS. Ninh Khắc Bản, Tài nguyên thực vật
Việt Nam Những cây chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học, tập 1,
Nhà xuất bản nông nghiệp, trang 125-127, (2005).
[10] Liang Guang-Yi, Alexander I. Gray and Peter G. Waterman,
Pentacylic triterpenes from the fruits of Rosa sterilis, Journal of
Natural Products, Vol.52, pp 162-167 (1989).
[11] Agrawal P.K., Carbon-13 NMR of flavonoids, Elsevier Science Pub B.V., (1989).
[12] Cannell R.J.P., Natural Products Isolation, Humana Press, pp 354 (1998).
[13] Kohei Kazuma, Naonou Noda, Masahiko Suzuki, 2003. Malonylated flavonol glycosides from the petals of Clitoria ternatea.
Phytochemistry, 62, pp. 229-237.
[14] Shen, C-C., Chang, Y-S., Ho, L-K. (1993), “Nuclear magnetic resonance studies of 5,7-dihydroxyflavonoids”, Phytochemistry, 34 (3), pp. 843-845.
Mở đầu
Như chúng ta đã biết Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, độ ẩm cao trên 80%, lượng mưa lớn, nhiệt độ trung bình khoảng 15 đến 270
C. Đó là điều kiện rất thích hợp cho thực vật phát triển. Do vậy hệ thực vật Việt Nam vô cùng phong phú, đa dạng với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược [2] . Điều này thực sự có ý nghĩa to lớn cho sự phát triển của ngành y tế, ngành hoá học và một số ngành khác. Hệ thực vật phong phú trên được coi như là tiền đề cho sự phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta.
Theo tài liệu [8] công bố hiện nay có khoảng 60% - 70% các loại thuốc chữa bệnh đang được lưu hành hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên.
Với sự phát hiện ra nhiều chất có hoạt tính sinh học có giá trị từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã có những đóng góp đáng kể trong việc tạo ra các loại thuốc điều trị những bệnh nhiệt đới và bệnh hiểm nghèo như: penicillin (1941); artemisinin (những năm 1970);...để kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lượng cuộc sống của con người. Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu cung cấp các hoạt chất quý hiếm để tạo ra các biệt dược mà còn cung cấp các chất dẫn đường để tổng hợp ra các loại thuốc mới. Từ những tiền chất được phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã chuyển hóa chúng thành những hoạt chất có khả năng trị bệnh rất cao.
Cây đề (Ficus religiosa L.), thuộc họ Dâu tằm (Moraceae) là một loại cây đã được sử dụng từ lâu trong dân gian làm thuốc chữa bệnh, như vỏ, thân cây được sử dụng làm thuốc chữa sâu răng, làm chắc răng; Ở Ấn Độ cây được dùng để chữa bệnh lậu; ở Việt Nam cây dùng chữa lở loét ngoài da, trị ghẻ...Tuy nhiên cho tới nay chưa có một nghiên cứu chính thức nào về hóa thực vật của cây.
Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi đã chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là:
“Nghiên cứu thành phần Flavonoit của cây Đề – Ficus religiosa L.”.
Luận văn này tập trung nghiên cứu thành phần lignan từ lá cây đề bao gồm những nội dung chính là:
1. Thu mẫu lá cây đề (Ficus religiosa L.), xử lý mẫu và tạo dịch chiết metanol.
2. Tách chiết các hợp chất flavonoid.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã tách chiết được.
Chƣơng 1: Tổng quan
1.1.1. Mô tả.
Tên khoa học: Ficus religiosa L.
Tên tiếng Việt: Đề Họ: Dâu tằm (Moraceae)
Cây Đề là loại cây gỗ lớn hoặc nhỏ, thường xanh hay rụng lá, sống lâu năm, có thể cao từ 20 - 30 m và đường kính thân tới 3 m, tán cây xoè rộng, vỏ ngoài
thường có nhiều rãnh dọc. Hình 1.1:Đề (Ficus religiosa L.) Lá đơn mọc cách, xếp xoắn ốc;
Phiến lá hình trứng rộng hay hình trứng- tim, kích thước 6 x 26 – 4 x 16 cm; Gốc lá hình tim hay cụt, chóp lá có mũi dài, nhọn, mép lá nguyên nhẵn, có 6-9 đôi gân bên. Lá kèm tạo thành búp ở đầu
cành, dài tới 1,5 cm. Hình 1.2: Lá Đề
Cụm hoa sung thường mọc thành đôi ở nách lá, không cuống, gần hình cầu, đường kính 1-1,5 cm, nhẵn. Hoa đực không cuống, bao quanh lỗ mở. Hoa cái không cuống hoặc có cuống ngắn.
Quả nhỏ, chín có màu hồng, đỏ
đậm hoặc đen. [9] Hình 1.3: Quả Đề
1.1.2. Phân bố, sinh thái.
Cây có nguồn gốc ở các khu vực kéo dài từ dãy Himalaya (ấn Độ) đến miền Nam Trung Quốc, miền Bắc Thái Lan và Việt Nam. Hiện đã được trồng
rộng rãi ở khắp các nước thuộc miền Đông Nam á, các nước khu vực Trung Đông, Bắc Phi và cả ở Hoa Kỳ.
ở nước ta Đề được trồng làm cây bóng mát, cây cảnh quanh đền, chùa, đình, miếu, trên đường làng, đường phố và công viên...[9]
Sự thụ phấn: Cây đề được thụ phấn nhờ một loài côn trùng có tên là
Blastophaga quadraticeps.
Bộ phận được sử dụng: Vỏ cây, quả, lỏ.
Tính vị và tác dụng: Vỏ làm săn da; Quả nhuận tràng, làm toát mồ hôi, trấn kinh; Hạt làm mát, giải nhiệt; Lá và nhánh non làm thuốc xổ; Nước chiết từ vỏ có tác dụng ngăn cản hoạt động của các vi khuẩn Staphylococcus và
Escherichia coli.[4]
1.1.3. Thành phần hoá học.
Theo Võ Văn Chi [4], vỏ cây có chứa 4% tanin. Mủ chứa nhựa, trong mủ