Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa
vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300-3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C = O trong khoảng 1700-1750 cm- 1…
1.5.2. Phổ khối lƣợng (Mass spectroscopy, MS).
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:
- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV.
- Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn pha thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các píc đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
- Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
- Ngoài ra, hiện nay ngưòi ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí
kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí -khối phổ), LC-MS (sắc kí lỏng-khối phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược).
1.5.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy, NMR).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1
H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin
coupling).
1.5.3.1. Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1
H-NMR, độ chuyển dịch hoá học (ọ) của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ chuyển dịch hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
1.5.3.2. Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi
nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13
C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng 0- 230ppm.
1.5.3.3. Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer): Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH
và CH3 nằm về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350. Trên phổ DEPT 90O
chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
1.5.3.4. Phổ 2D-NMR: Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép
xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:
- Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
- Phổ 1H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation
Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H- H, chủ yếu là các
proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc.
- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn.
Ngoài ra, còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể. Nhưng phạm vi sử dụng của nó hạn chế vì yêu cầu cần tiên quyết của phương pháp này là cần phải có đơn tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người còn sử dụng kết hợp với các chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích, so sánh kết hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều khó xác định chính xác được chiều dài các mạch. Đối với phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.
Chƣơng 2:đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1. Mẫu thực vật.
Cây đề được thu hái vào tháng 09 năm 2007 tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc. Mẫu cây được TS. Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế
Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp.
2.2.3. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silicagel pha
thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất chất
2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)
Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên.
2.3.2. Phổ khối lƣợng (ESI-MS)
Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization mass spectra) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.3. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.4. Độ quay cực []D
Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4. Dụng cụ và thiết bị
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:
+ Máy cô quay chân không
+ Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 368 nm + Tủ sấy chân không
+ Máy sấy + Micropipet
+ Bình sắc ký loại phân tích và điều chế + Cột sắc ký pha thường các loại đường kính + Cột sắc ký pha ngược trung áp
+ Máy phun dung dịch thuốc thử + Bếp điện
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc
+ Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer.
+ Máy sắc kí lỏng cao áp ghép nối khối phổ (ESI) AGILENT 1100 LC- MSD Trap spectrometer.
+Thiết bị đo điểm nóng chảy Kofler micro-hotstage. + Thiết bị đo độ quay cực JASCO.
2.5. Hoá chất
+ Silica gel 60 (0,04-0,063 mm) Merck.
+ Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).
+ Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715).
+ Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
+ Các loại dung môi hữu cơ như methanol, etanol, ethyl acetate, chlorofrom, hexane, acetone, v.v.. là loại hoá chất tinh khiết của Merck.
2.6. Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất
Mẫu lá của cây đề (15 kg tươi), được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 50oC, sau cùng đem nghiền nhỏ thành bột thu được 3 kg bột khô.
Phần lá khô của Ficus religiosa L.(3kg) được đem nghiền nhỏ sau đó đem chiết với MeOH 3 lần:
+ Phần dịch chiết được quay khô với áp suất giảm để tạo thành dịch chiết MeOH (100g).
+ Phần cặn chiết sau đó được phân bố trong nước cất và chiết phân lớp với dung môi CHCl3 thu được cặn chiết CHCl3 (FR-1) và cặn nước (FR-2).
Tiến hành sắc ký cột phân lớp FR-2 với các hệ dung môi thích hợp (hình 2.1) thu được 2 hợp chất là FR-2.1 và FR-2.2.
Bột lá khô F. religiosa (3 kg) FR - Cặn MeOH (100g) FR-2: Cặn H2O (40 g) FR-1: Cặn CHCl3 (40 g) FR-21 (12g) FR-22 (6g) FR-23 (9g) FR-2.1 (20 mg) FR-2.2 (15mg) Chiết MeOH Bổ sung nước Bổ sung CHCl3 Dianion HP20 H2O:MeOH (1:0 ~ 0:1) CHCl3:MeOH (10 : 1) CHCl3 : MeOH : H2O (10 : 1 : 0,1)
Hình 2.1: Quy trình chiết và phân lập 2 hợp chất từ dịch chiết MeOH của lá
cây đề.
CHƢƠNG 3: KếT QUả Và THảO LUậN
3.1. Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất
3.1.1. Hợp chất FR-2.1: Quercetin
Hợp chất FR-2.1 nhận được ở dạng bột màu vàng cam.
- Trên phổ 1H-NMR của FR-2.1 : xuất hiện các tín hiệu của 1 vòng
benzene có hệ tương tác ABX tại 7,75 (1H, brs), 6,90 (1H, brd, J = 9,0Hz) và 7,65 (1H, brd, J = 9,0Hz). Ngoài ra còn có tín hiệu của 2 proton thơm khác cộng hưởng ở 6,20 (1H, brs) và 6,41 (1H, brs).
Các số liệu này chỉ ra rằng hợp chất FR-2.1 có khung quercetin. Kết
quả phổ 1
H-NMR của FR-2.1 được trình bày ở bảng 3.1.1.
Công thức phân tử của FR-2.1 được xác định là C15H10O7 (M = 302) bởi sự xuất hiện của các tín hiệu m/z 324,8 [M+Na]+ và 300,9 [M-H]- trên phổ khối lượng ESI-MS.
So sánh kết quả phổ 1
H-NMR của FR-2.1 với hợp chất quercetin [14]
(bảng 3.1.1) thấy phù hợp hoàn toàn, kết hợp với kết quả phổ khối lượng trên, có thể xác định hợp chất FR-2.1 là quercetin, một hợp chất rất phổ biến trong các loài thực vật. O OH OH O HO OH OH 2 3 4 10 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 6' 5'
Hình 3.1.1.3: Cấu trúc hoá học của FR-2.1 Bảng 3.1.1: Kết quả phổ 1 H-NMR của FR-2.1 Proton H # ; Mult. (J in Hz) H a,c ; Mult. (J in Hz) 6 6,18; d (2,0) 6,20; brs 8 6,40; d (2,0) 6,41; brs 2’ 7,67; d (2,2) 7,75; brs 5’ 6,89; d (8,3) 6,90; d (9,0) 6’ 7,53; dd (8,6, 2,2) 7,65; brd (9,0)
aĐo trong CD3OD, c500MHz
#Số liệu phổ 1H-NMR của hợp chất quercetin từ tài
liệu [14].
Hợp chất FR-2.2 nhận được ở dạng bột màu vàng.
Trên phổ 1H-NMR: xác định 3 tín hiệu proton của một vòng thơm có hệ tương tác ABX [ 7.68 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.64 (1H, dd, J = 2.0; 8.5 Hz) và 6.89 (1H, d, J = 8.5 Hz)] cùng với 2 proton thơm của một vòng thơm bị thế 4 vị trí [ 6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz) và 6.41 (1H, d, J = 2.0 Hz)], và tín hiệu của một nhóm metyl tại 1.11 (3H, d, J = 6.0 Hz). Ngoài ra trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu của 2 proton anome [ 5.13 (1H, d, J = 7.5) và 4.54 (1H, d, J = 1.5)] cho thấy hợp chất FR-2.2 chứa 2 đơn vị đường. Chi tiết phổ 1H-NMR được trình bày ở bảng 3.1.2.
Hình 3.1.2.1: Phổ 1H-NMR của hợp chất FR-2.2
Phổ Dept: xác định sự có mặt của 10 tín hiệu cacbon bậc bốn, 15 tín hiệu nhóm metin, một tín hiệu metylen và một tín hiệu metyl.
Hình 3.1.2.2: Phổ Dept của hợp chất FR-2.2
Trên phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của một cacbon cacbonyl tại 179.41 (C-4), 6 tín hiệu cacbon bậc bốn mang oxy [ 135.61 (C-3), 162.94 (C- 5), 166.05 (C-7), 159.34 (C-9), 145.83 (C-3’) và 149.79 (C-4’)] và 2 tín hiệu cacbon bậc bốn khác tại 105.62 (C-10) và 123.14 (C-1’). Tín hiệu của năm nhóm metin thơm cũng thể hiện trên phổ 13C-NMR tại [ 99.98 (C-6), 94.90 (C-8), 117.70 (C-2’), 116.08 (C-
5’) và 123.56 (C-6’)]. Phổ 13C-NMR xác nhận các tín hiệu của 2 cacbon anome 104.69 (C-1”) và 102.40 (C-1’’’), và 8 nhóm metin mang oxy của vùng đường 69.70- 78.18 cùng với một nhóm metylen mang oxy tại 68.55 (C-6”) và một nhóm metyl ở 17.86 (C-6’’’), kết hợp với các số liệu trên phổ 1H-NMR khẳng định sự có mặt của 2 đơn vị đường -glucopyranoside và - rhamnopyranoside. Từ các số liệu trên, có thể dự đoán hợp chất FR-2.2 là một flavonoid liên kết với 2 đường là -glucopyranoside và -rhamnopyranoside. Chi tiết phổ 13C-NMR được trình bày ở bảng 3.1.2.
Hình 3.1.2.3: Phổ 13C-NMR của hợp chất FR-2.2 Công thức phân tử của hợp chất FR-2.2 được xác định là C27H30O16 do sự xuất hiện của tín hiệu m/z
Hình 3.1.2.4: Phổ ESI-MS của hợp chất FR-2.2
So sánh kết quả phổ NMR của hợp chất FR-2.1 với dữ liệu phổ NMR của hợp chất rutin [13] thấy hoàn toàn phù hợp (Bảng 3.1.2). Dựa vào những kết quả trên, hợp chất FR-2.2 được xác định là rutin.
O OH 1'' 3'' 4'' 5'' 6'' OH O HO 2'' O O HO OH OH OH O 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' OH OH 1''' 3''' 4''' 5''' 6''' O 2''' OH CH3
Bảng 3.1.2: Kết quả phổ NMR của hợp chất FR-2.2 Cacbon C # (ppm) C a,b (ppm) Dept H a,c (ppm), (mult., J in Hz) 2 158,52 158,50 - 3 135,62 135,61 - 4 179,44 179,41 - 5 162,98 162,94 - 6 99,95 99,98 CH 6,22 (1H, d, J = 2,0) 7 166,01 166,05 - 8 94,87 94,90 CH 6,41 (1H, d, J = 2,0) 9 159,35 159,34 - 10 105,66 105,62 - 1’ 123,15 123,14 - 2’ 117,69 117,70 CH 7,68 (1H, d, J = 2,0) 3’ 145,84 145,83 - 4’ 149,81 149,79 - 5’ 116,06 116,08 CH 6,89 (1H, d, J = 8,5) 6’ 123,55 123,56 CH 7,64 (1H, dd, J = 2,0, 8,5) 1” 104,69 104,69 CH 5,13 (1H, d, J = 7,5)
2” 75,74 75,72 CH 3,29-3,66* 3” 78,20 78,18 CH 3,29-3,66*