Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN CẨM HÀ NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƯỚNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE, MỸ PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2020 Cơng trình hồn thành tại: Viện Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS TS Đặng Diễm Hồng Viện Công nghệ Sinh học Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … …, ngày … tháng … năm 202… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ (09 bài) Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Minh Hiền, Nguyễn Hoàng Ngân, Đặng Diễm Hồng, Đánh giá mức độ an toàn tác dụng squalene tách chiết từ Schizochytrium mangrovei PQ6 đến tăng cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao (HDL-C) động vật thực nghiệm Tạp chí Sinh học, 2019, 41(2), 39-48 Hoang Thi Lan Anh, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Pham Van Nhat, Hoang Thi Minh Hien, Ngo Thi Hoai Thu, Dang Diem Hong, Different fermentation strategies by Schizochytrium mangrovei strain PQ6 to produce feedstock for exploitation of squalene and omega-3 fatty acids Journal of Phycology, 2018, 54 (4), 550556 (SCI, Q1; IF-3,0) Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Minh Hiền, Đặng Diễm Hồng, Cơ chế giảm cholesterol squalene tách chiết từ Schizochytrium mangrovei PQ6 Báo cáo toàn văn Hội thảo Khoa học cơng nghệ sinh học tồn quốc 2018 Trung tâm Hội nghị quốc gia Hà Nội 26.10.2018, Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ; 2018, 589-594 Nguyen Cam Ha, Hoang Thi Minh Hien, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Dang Diem Hong, Optimization of fermentation conditions for squalene production by heterotrophic marine microalgae Schizochytrium mangrovei Academia Journal of Biology, 2017, 39(3), 449-458 Hoang Thi Minh Hien, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Dang Diem Hong, Squalene promotes cholesterol homeostasis in macrophage and hepatocyte cells via activation of liver X receptor (LXR) α and β Biotechnology Letters, 2017, 39 (8), 1101-1107 (SCI, Q2; IF-1,7) Đặng Diễm Hồng, Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Lưu Thị Tâm, Hồng Thị Lan Anh, Ngơ Thị Hồi Thu, Nhiên liệu sinh học từ vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam: Biodiesel tận thu sản phẩm phụ (acid béo khơng bão hịa đa nối đơi - PUFAs, glycerol squalene) trình sản xuất biodiesel Tạp chí Sinh học, 2017, 39 (1), 51-60 Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Pham Van Nhat, Hoang Thi Lan Anh and Dang Diem Hong, Extraction of squalene from Vietnam heterotrophic marine microalga Proceeding of The the Academic conference on natural Science for Yong Scientists, Master & PhD Student from Asian Countries 15-18 December, 2015 Bangkok, Thailand, 2016, 46-56 Hoang Thi Lan Anh, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Dang Diem Hong, Optimization of culture conditions and squalene enrichment from heterotrophic marine microalga Schizochytrium mangrovei PQ6 for squalene production Research Journal of Biotechnology, 2016, 14 (2), 337-346 (SCI-E) Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Đặng Diễm Hồng, Hoàng Minh Hiền, Nghiên cứu tác dụng giảm lipid squalene tách chiết từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium sp tế bào Hep G2 Tạp chí Dược liệu, 2016, 21 (4), 270 -274 4 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Việt Nam có 3.200 km bờ biển với nguồn sinh vật biển nhiệt đới đa dạng, phong phú thành phần lồi giàu hợp chất tự nhiên ứng dụng công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y dược Vi tảo với ưu điểm giàu dinh dưỡng, kích thước nhỏ (< 10 µm), dễ tiêu hóa, khơng độc, có tốc độ sinh trưởng sức chống chịu cao với điều kiện khắc nghiệt môi trường, coi mắt xích đầu tiên, nguồn sinh khối sơ cấp quan trọng chuỗi thức ăn hệ sinh thái nước Ngoài ra, sinh khối vi tảo chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng cho người động vật như: loại sắc tố, vitamin, khoáng chất, protein, acid béo khơng bão hịa đa nối đơi (polyunsaturated fatty acid - PUFAs) đặc biệt squalene Squalene- tripterpene tự nhiên tiền chất steroid động, thực vật thường sử dụng sản phẩm dinh dưỡng, chăm sóc sức khỏe, mỹ phẩm y học Squalene ứng dụng rộng rãi công nghiệp mỹ phẩm với tác dụng chống khô da làm mềm da, bảo vệ da khỏi tác hại ánh sáng tia UV gây Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy squalene ức chế hiệu tác nhân hóa học có khả gây ung thư ruột kết, phổi, da động vật thực nghiệm Squalene chất chống oxy hoá tự nhiên, bảo vệ tế bào khỏi gốc tự oxy phân tử có hoạt tính cao, có khả tăng cường hoạt động hệ miễn dịch Việc cung cấp thực phẩm chức có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày) chứng minh cần thiết cho sức khỏe dinh dưỡng người, làm giảm đáng kể bệnh tim mạch ung thư Vì vậy, chúng dùng phổ biến dược phẩm Cho đến nay, nguồn sản xuất squalene biết đến nhiều loại dầu động, thực vật Tuy nhiên, việc khai thác mức làm ảnh hưởng đến bảo tồn nguồn lợi cá biển tự nhiên, phụ thuộc vào thổ nhưỡng, mùa vụ loại trồng có dầu dẫn đến nguồn khai thác squalene bị giảm sút Trong đó, nhu cầu squalene ngành công nghiệp dược phẩm mỹ phẩm ngày tăng Do vậy, việc tìm kiếm phát triển nguồn nguyên liệu thay nguồn truyền thống để tách chiết squalene cần thiết nhà khoa học nước quan tâm nghiên cứu Trong đó, vi sinh vật nói chung vi tảo biển nói riêng nguồn tiềm cho sản xuất squalene quy mô lớn Gần đây, số loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) thraustochytrids xem nhà máy tế bào tiềm để sản xuất chất có giá trị cao có squalene Tuy nhiên, việc nghiên cứu squalene Việt Nam 2012, kết nghiên cứu dừng lại việc cung cấp sở khoa học ban đầu hàm lượng squalene từ số chủng vi tảo, chưa có phương pháp tối ưu cho tách chiết, làm giàu tinh squalene; chưa có điều kiện ni trồng tối ưu vi tảo tiềm có sức sản xuất sinh khối có hàm lượng squalene cao; chưa có quy trình cơng nghệ tạo chế phẩm squalene có hoạt tính sinh học bảo đảm an tồn cho sử dụng theo định hướng làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm dược phẩm Việt Nam Chính vậy, với mục tiêu lớn cung cấp sản phẩm giàu squalene phục vụ cho sức khỏe cộng đồng từ nguồn tài nguyên thiên nhiên sẵn có nước có vi tảo, chúng tơi mong muốn thực đề tài “Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm dược phẩm” Mục tiêu nghiên cứu luận án - Sàng lọc xác định điều kiện ni trồng thích hợp chủng Schizochytirum mangrovei PQ6 Việt Nam tiềm lựa chọn cho sản xuất squalene - Xác định điều kiện thích hợp cho tách chiết, làm squalene từ sinh khối chủng S mangrovei PQ6 lựa chọn được; đánh giá độ an toàn tác dụng sinh học, dược lý squalene tách chiết theo định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm dược phẩm Các nội dung nghiên cứu luận án - Sàng lọc chủng/loài vi tảo biển Việt Nam tiềm cho sản xuất squalene từ số chủng vi tảo biển Việt Nam - Tối ưu điều kiện ni cấy để thu sinh khối tảo có hàm lượng squalene cao chủng tiềm lựa chọn quy mơ bình tam giác; bình lên men 30 Lít - Tối ưu điều kiện tách chiết, làm giàu tinh squalene từ sinh khối chủng vi tảo biển lựa chọn được; xây dựng quy trình tách chiết tinh squalene; xác định độ cấu trúc squalene tách chiết 5 - Đánh giá tính an tồn squalene bao gồm độc tính cấp bán trường diễn, tác dụng sinh dược mô hình in vivo (mơ hình động vật thực nghiệm) - Bước đầu nghiên cứu chế tác dụng giảm cholesterol squalene mơ hình in vitro (mơ hình tế bào) Chương Tổng quan Squalene (2,6,10,15,19,23-hexanmethyltetracosa 2,6,10,14,18,22 -hexane) hydrocacbon hợp chất béo khơng bão hịa (C30H50), với liên kết đôi, chứa đơn vị isoprene để cung cấp khung cho tổng hợp cholesterol, acid mật steroid Squalene đóng vai trị quan trọng hoạt động miễn dịch, chống oxy hóa, giảm cholesterol, bảo vệ tim mạch giải độc gan, làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm hỗ trợ bảo vệ sức khỏe hay sử dụng chủ yếu công nghiệp mỹ phẩm chất có tác dụng giữ ẩm làm mềm da Ngồi ra, cịn có hiệu cao việc điều trị bệnh ứng dụng tốt dược phẩm hoạt tính chống phát triển khối u rõ rệt mơ hình động vật thực nghiệm Các nghiên cứu gần cho thấy vi tảo nguồn thay tiềm cho việc sản xuất squalene Trong tất nhóm vi tảo, VTBDD Schizochytrium xem nhà máy tế bào tiềm cho sản xuất chất có giá trị cao có squalene Theo cơng bố Martins cộng (2018) cho thấy loài Aurantiochytrium sp sau 48 h nuôi cấy điều kiện độ mặn 1,5%, nồng độ glucose ban đầu 3%, 26°C cho sản lượng squalene cao 7,3 g/100 g Ở Việt Nam, chủng VTBDD S mangrovei PQ6 phân lập huyện đảo Phú Quốc, Kiên Giang từ 2006-2008 chủng vi tảo tiềm năng, dễ ni trồng hệ thống bình lên men tích 5, 10, 30 150 lít, lượng sinh khối tươi (SKT) đạt 70-100 g/L tương đương với sinh khối khơ (SKK) 20-30 g/L, hàm lượng lipid lên tới 50-70 % SKK Vì vậy, lồi vi tảo biển xem tiềm cho sản xuất sinh khối chất chuyển hóa PUFAs squalene quy mô lớn Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu 2.1.1 Mẫu vật - 40 chủng VTBDD có 31 chủng thuộc chi Schizochytrium, chủng thuộc chi Thraustochytrium phân lập từ vùng bờ biển rừng ngập mặn Hải Phịng, Nam Định, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An Bình Định năm 2013-2014, chủng S mangrovei PQ6 phân lập Huyện đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang năm 20062008 sử dụng cho nghiên cứu 2.1.2 Các kit sinh phẩm: Kit tinh sản phẩm PCR (Genjet Purification, Thermo ScientificTM (EU)), kit tách chiết ARN tổng số RNAiso Plus (Takara, Tokyo, Nhật Bản), kit tổng hợp cDNA (RevertAid First Strand cDNA Thermo Fisher Scientific Inc., Singapore) sử dụng nghiên cứu Trình tự cặp mồi nhân gen (CYP7A1, LDL-R, ABCA-1, LXRα, ABCA-1, ABCG-1, ApoE, LXRß GADPH) Phịng Cơng nghệ tảo, Viện Cơng nghệ sinh học thiết kế 2.1.3 Động vật thí nghiệm: Chuột cống trắng, chuột nhắt trắng Ban động vật thí nghiệm - Học Viện Quân Y cung cấp 2.1.4 Các dòng tế bào: Dòng tế bào gan người HepG2 tế bào đại thực bào từ chuột RAW264.7 có nguồn gốc từ ngân hàng Tế bào sống, trường Đại Học Seoul, Hàn Quốc GS TS Sung-Joon Lee, Trường Đại học Korea, Hàn Quốc tặng 2.1.5 Hóa chất: Các hóa chất sử dụng hóa chất thơng dụng phịng thí nghiệm, đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu 2.1.6 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm: Sử dụng máy móc thiết bị thơng dụng phịng thí nghiệm 2.1.7 Mơi trường nuôi cấy - Môi trường giữ giống cấy chuyển chi Schizochytrium: ký hiệu GPY bao gồm glucose (2 g/L), polypepton (1 g/L), cao nấm men (0,5 g/L), muối biển nhân tạo (17,5 g/L), agar (15 g/L) - Các chủng tảo thuộc chi Schizochytrium ni bình tam giác 1.000 mL chứa 300 mL môi trường M1, chế độ lắc 200 vòng/phút 25-28oC 6 - Chủng tảo thuộc chi Thraustochytrium nuôi môi trường Bajpai cải tiến, chế độ lắc 200 vòng/ phút 25-28oC - Mơi trường ni trồng Schizochytrium spp bình lên men 30L gồm Môi trường M12 cho lên men theo mẻ (9% glucose, 1% cao nấm men, muối biển nhân tạo 17,5 g/L); Môi trường sử dụng để nhân giống cấp (CNT1), giống cấp (CNT2), cho lên men theo mẻ (CNT3) có bổ sung chất gồm: Mơi trường CNT1 (%): glucose - 3, cao nấm men -0,4, monosodium glutamate- 6,42, NaCl - 1,25, MgSO4 - 0,4, KCl - 0,05, CaCl2 - 0,01, NaHCO3 - 0,05, KH2PO4 - 0,4, hỗn hợp vitamin - 0,14 (vitamin B1 - 45 g/L, vitamin B6 - 45 g/L vitamin B12 0,25 g/L) vi lượng - 0,8; Môi trường CNT2 (%) gồm: glucose - 8,57, cao nấm men - 0,64, monosodium glutamate - 6,42, NaCl - 2, KH2PO4 - 0,64, MgSO4 - 2,29, CaCl2 - 0,03, NaHCO3 - 0,03, Na2SO4 - 0,03, hỗn hợp vitamin - 0,14, vi lượng - 0,2; Môi trường CNT3 (%) gồm: glucose- 7,5, cao nấm men - 1,2, monosodium glutamate- 6,42, NaCl - 0,25, KH2PO4- 0,96, MgSO4- 1,2, CaCl2- 0,12, NaHCO3- 0,12, KCl-0,08, hỗn hợp vitamin - 0,4 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nhóm phương pháp xác định chủng/loài; đặc điểm sinh học; điều kiện ni trồng tối ưu chủng/lồi tiềm cho sản xuất squalene cao 2.2.1.1 Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào sinh khối khô: sử dụng buồng đếm Burker - Turk (Đức), sấy sinh khối tảo 105oC đến khối lượng không đổi (Dang Diem Hong cs, 2011) 2.2.1.2 Phương pháp chụp ảnh hình thái: chụp máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY 7.0 Nhật Bản kính hiển vi quang học Olympus CX21 2.2.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số sinh khối tảo: theo phương pháp Bligh Dyer (1959) với số cải tiến 2.2.1.4 Phương pháp nhuộm lipid Nile Red (Doan Obbard, 2010) 2.2.1.5 Phương pháp xác định đường khử DNSA: theo Miller (1959) 2.2.1.6 Phương pháp xác định sơ hàm lượng squalene: định lượng squalene phương pháp so màu (Rothblat cs, 1962) 2.2.1.7 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu chủng/loài tiềm thuộc chi Schizochytrium cho sản xuất squalene cao Cấp độ bình tam giác Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, nồng độ cao nấm men, nồng độ glucose ban đầu, nồng độ terbinafie (TBNF): sử dụng bình tam giác 250 mL chứa 100 mL môi trường M1, lắc 200 vòng/phút ngày để nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy (15oC, 20oC, 25oC, 30oC), nồng độ glucose ban đầu (15, 30, 40, 60 90 g/L), cao nấm men (0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4%); TBNF (0, 0,1, 1, 10, 100, 150, 200 µg/mL) thành phần khác giữ nguyên môi trường Nghiên cứu ảnh hưởng hỗn hợp vitamin (B1, B6, B12): Tảo nuôi bình tam giác 250 mL chứa 100 mL mơi trường CNT3 có bổ sung 0; 0,2; 0,4; 0,6% hỗn hợp vitamin (vitamin B1- 45 g/L, vitamin B6- 45 g/L B12- 0,25 g/L) Sau 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 h nuôi, tiến hành thu, đếm mật độ tế bào (MĐTB), xác định sinh khối tươi (SKT), SKK, squalene Cấp độ bình lên men 30 L Nghiên cứu ảnh hưởng glucose: - Giống cấp 1: S mangrovei PQ6 nuôi cấy môi trường thạch GPY, sau cấy chuyển sang bình ni L có chứa 300 mL mơi trường M1, lắc 200 v/p, nhiệt độ nuôi 28C thời gian 96 h - 2% giống cấp bổ sung vào bình lên men 30 L chứa 15 L môi trường M12 với nồng độ glucose thay đổi từ 3, 6, 9, 12, 22% Sau 24, 48, 72, 96 120 h lên men, tiến hành thu mẫu, chụp ảnh hình thái tế bào, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng lipid squalene Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ: 2% giống cấp bổ sung vào bình lên men 30 L chứa 15 L môi trường M12 với nguồn nitơ 1% cao nấm men kết hợp 1,2% cao nấm men (Y) 6,42% monosodium glutamate (YM) Sau 24, 48, 72, 96 120 h lên men, tiến hành thu, chụp ảnh hình thái tế bào, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng đường dư squalene Nghiên cứu ảnh hưởng trình lên men theo mẻ có bổ sung chất (fed-batch): - Giống cấp 1: Khuẩn lạc S mangrovei PQ6 cấy chuyển sang bình ni 500 mL có chứa 200 mL môi trường CNT1, nuôi lắc 28oC, 200 v/p 24 h - Giống cấp 2: 1% giống cấp bổ sung vào bình tam giác L có chứa L môi trường CNT2, nuôi lắc 28oC, 200 v/p 24 h - 2% giống cấp bổ sung vào bình lên men 30 L có chứa 15 L môi trường CNT3 Tại thời điểm 48 h, bổ sung glucose đến nồng độ 22% Sau 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 108 h, thu mẫu, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng đường dư squalene Nghiên cứu ảnh hưởng vitamin lên men theo mẻ có bổ sung chất - Giống cấp 1: Khuẩn lạc S mangrovei PQ6 cấy chuyển sang bình ni 500 mL có chứa 200 mL môi trường CNT1, nuôi lắc 28oC, 200 v/p 24 h - Giống cấp 2: 1% giống cấp bổ sung vào bình tam giác L có chứa L mơi trường CNT2, có khơng có bổ sung 0,14% hỗn hợp vitamin, ni lắc 28oC, 200 v/p 24 h - 2% giống cấp bổ sung vào bình lên men 30 L có chứa 15 L mơi trường CNT3 có khơng có bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin Sau 12, 24, 36, 48 h xác định hàm lượng đường dư môi trường nuôi Khi hàm lượng đường dư nhỏ 2% bổ sung glucose để đạt nồng độ 22% Sau bổ sung glucose 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108 h tiến hành thu mẫu, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng đường dư squalene 2.2.2 Nhóm phương pháp xác định điều kiện tách chiết tinh squalene từ S mangrovei PQ6 2.2.2.1 Phương pháp xác định điều kiện tách chiết tinh lượng nhỏ squalene từ sinh khối S mangrovei PQ6 - Phương pháp tách chiết lipid khơng xà phịng hóa (KXPH) từ lipid tổng số: theo phương pháp Lewis cs (2001) Lipid KXPH sử dụng để chạy sắc ký lớp mỏng (TLC) - Tối ưu điều kiện tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S mangrovei PQ6: nghiên cứu ảnh hưởng dung môi khác (n-hexane, chloroform, petroleum ether; nhiệt độ (0, 30, 50 80C); thời gian phản ứng (1, 3, 4, giờ); điều kiện khuấy trộn (không khuấy trộn, khuấy trộn liên tục, gián đoạn); số lần chiết (1, 2, lần); tỷ lệ sinh khối/dung môi (1:8, 1:10, 1:12), nhiệt độ sấy sinh khối (60, 70, 80, 90C) độ ẩm sinh khối 3, 30, 50, 80%) - Tối ưu điều kiện tách chiết lipid KXPH từ lipid tổng số: nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ hỗn hợp dung môi nhexane: chloroform 1:1; 2:1; 3:1; 4:1 5:1 bước cịn lại quy trình giữ nguyên - Tách chiết, tinh làm giàu squalene phương pháp dung môi mô tả báo cáo Choo cộng (2005) 2.2.2.2 Phương pháp xây dựng quy trình tách chiết làm squalene quy mô pilot từ sinh khối tảo S mangrovei PQ6 - Tách chiết squalene thô từ sinh khối tế bào theo phương pháp Lu cộng (2003) Nghiên cứu ảnh hưởng dung môi (ethanol methanol), độ ẩm sinh khối (20% đến 100%) lên tách chiết hàm lượng squalene - Tách chiết squalene thô từ dịch tế bào theo công bố Pora cộng (2015), tinh squalene thô sắc ký cột 2.2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng độ tinh squalene phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) (Định Thị Ngọc cs., 2013) 2.2.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc squalene: phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) sử dụng máy Bruker Avance-500 MHz spectrometer (Poucher cộng sự, 1993) 2.2.3 Nhóm phương pháp xác định tiêu chất lượng squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 Phương pháp xác định tiêu cảm quan theo TCVN 2627-1993 Phương pháp xác định tiêu hóa lý: độ ẩm theo TCVN 6120:2007; trị số acid, xà phịng hóa, peroxyt, Iod theo TCVN 6127:2010; TCVN 6126:2007; TCVN 6121:2010 TCVN 6122: 2010, tương ứng Phương pháp xác định tiêu vi sinh vật Phương pháp xác định tiêu kim loại 2.2.4 Nhóm phương pháp đánh giá tính an tồn tác dụng dược lý squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 động vật thực nghiệm (in vivo) mơ hình tế bào (in vitro) 2.2.4.1 Nhóm phương pháp đánh giá tính an tồn tác dụng dược lý squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 mô hình in vivo - Nghiên cứu độc tính cấp squalene theo phương pháp Litchfield - Wincoxon (Đỗ Trung Đàm, 2014), quy định Bộ Y tế Việt Nam (2018), hướng dẫn Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế (OECD) (2002) Tổ chức Y tế giới (2000) - Đánh giá độc tính bán trường diễn: qui định Bộ Y tế Việt Nam (2018), hướng dẫn Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế (OECD) (2000) Tổ chức Y tế giới (2000) - Tác dụng làm tăng HDL-C squalene chuột nhắt trắng tiến hành đánh giá theo phương pháp mô tả Clara Gaba´s-Rivera cộng (Đỗ Trung Đàm, 2006) 2.2.4.2 Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu chế tác dụng giảm lipid squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 mơ hình in vitro - Tế bào HepG2 RAW264.7 ni cấy mơi trường DMEM/high glucose có chứa 10% FBS, 100 U/mL penicillin, 0,1 mg/mL streptomycin tủ nuôi cấy vô trùng 37C, 5% CO2 - Độc tính squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 tế bào HepG2 phân tích theo phương pháp MTT - Nhuộm lipid Oil red O (ORO) theo phương pháp Hoang cộng (2012) - Tách chiết lipid nội bào - Hàm lượng cholesterol triglyceride nội bào xác định phương pháp enzyme - Tách chiết RNA tổng số (theo kit RNAiso PlusTakara - Tokyo, Nhật Bản), tổng hợp cDNA (theo kit RevertAid First Strand cDNA - Thermo Fisher, Scientific Ins., Singapore) Các cDNA sau sử dụng khn mẫu cho phản ứng qPCR Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase sử dụng để chuẩn hóa số liệu 2.2.5 Thống kê phân tích số liệu Số liệu trình bày số trung bình ± sai số chuẩn Sự sai khác coi có ý nghĩa thống kê mức P 98%) qua phân tích cấu trúc bằng 1H NMR 1H (500 MHz, CDCl3) khẳng định chất tách chiết squalene 3.3.2 Xây dựng quy trình tách chiết tinh squalene quy mô pilot từ S mangrovei PQ6 3.3.2.1 Ảnh hưởng tác nhân lên hiệu tách chiết squalene từ sinh khối S mangrovei PQ6 Ảnh hưởng dung môi: Hỗn hợp KOH/ ethanol cho kết tốt với hàm lượng squalene thô đạt (123 ± 11) mg/g SKK, hàm lượng squalene thực tế (0,32 ± 0,04) mg/mg squalene thô Ảnh hưởng độ ẩm sinh khối: độ ẩm sinh khối không ảnh hưởng đến hàm lượng squalene tách chiết Hàm lượng squalene thô thực tế tách chiết từ sinh khối có độ ẩm 20 100% tương ứng (128 ± 31) mg/g SKK (0,30 ± 0,02) mg/mg squalene thô; (126 ± 14) mg/g SKK (0,32 ± 0,03) mg/mg squalene thô 3.3.2.2 Tách chiết squalene từ dịch tế bào chủng S mangrovei PQ6 sau trình ni cấy lên men theo mẻ có bổ sung chất Mơi trường kiềm nhiệt độ cao phá vỡ màng tế bào loài thuộc chi thraustochytrids (Pora cs, 2014) Dịch tế bào chủng PQ6 có mật độ tương đương với 250-300 g/L chỉnh pH đến 10 KOH 45%, khuấy 60oC, 150 vòng/phút h Kết thu cho thấy, khơng có khác biệt đáng kể hàm lượng squalene tách chiết từ dịch lên men ((0,29 ± 0,02) mg/mg squalene thô) từ sinh khối khô ((0,28 ± 0,03) mg/mg squalene thơ) Vì vậy, để hướng tới việc sản xuất squalene theo quy mô công nghiệp, phương pháp tách chiết squalene trực tiếp từ dịch chiết lên men lựa chọn 3.3.2.3 Điều kiện tinh chế squalene phương pháp pháp sắc ký cột Các phân đoạn squalene thu sau qua cột sắc ký với hệ dung môi rửa giải n-hexane, squalene thu sau qua cột có độ tinh cao (chiếm 90-95% so sánh phần trăm diện tích peak) Bên cạnh đó, hiệu suất thu hồi đạt khoảng 50-60% Kết nghiên cứu Watanabe cộng (2013) cho thấy n-hexane cho phép thu squalene có độ tinh cao hiệu suất thu hồi đạt tới 70-80% Do vậy, dung môi rửa giải cho sắc ký cột để tinh chế squalene n-hexane lựa chọn 3.3.2.4 Xây dựng quy trình tách chiết làm nguyên liệu squalene từ sinh khối tảo S mangrovei PQ6 Hình 3.26 Quy trình tách chiết squalene từ S mangrovei PQ6 Dựa vào nghiên cứu tách chiết tinh chế squalene có tính ổn định lặp lại cao, quy trình tách chiết làm nguyên liệu squalene từ dịch lên men sau trình lên men có bổ sung chất chủng PQ6 xây dựng (Hình 3.26) Sử dụng quy trình này, tách chiết squalene tinh khiết dạng dịch lỏng không màu, không mùi với độ tinh đạt 90-95% 3.3.3 Tách chiết tinh chế lượng lớn squalene từ S mangrovei PQ6 Với quy trình xây dựng (Hình 3.26), từ 46 L dịch lên men (khoảng (3,9 ± 0,1) kg SKK) tách chiết (1,08 ± 0,29) kg squalene thô, tinh chế khoảng 131 mL squalene tinh khiết dạng dịch lỏng khơng 12 màu, khơng mùi, có hàm lượng squalene (305,23 ± 2,34) g (Hình 3.27) Kết phân tích sắc ký HPLC cho thấy squalene thu có độ tinh cao (chiếm từ 90-95%; Hình 3.28) khơng bị tạp nhiễm Phân tích phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3), phân tích khối phổ 13C NMR (125 MHz, 140 CDCl3) (Hình 3.29) so sánh với squalene chuẩn (Pouchert Behnke, 1993), khẳng định tách squalene từ VTBDD S mangrovei PQ6 3.3.4 Phân tích tiêu cảm quan, hóa lý, vi sinh vật kim loại squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 Kết phân tích chất lượng squalene tách chiết Trung tâm Chứng nhận phù hợp (Quacert), Trung tâm Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng, Bộ KH CN cho thấy squalene đạt yêu cầu chất lượng để làm nguyên liệu cho định hướng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm dược phẩm: dạng lỏng, không màu, không mùi; số acid- 0,524 mgKOH/g; số peroxyt- 4,2 Meq O2/kg, khơng có chứa dư lượng urê, tiêu kim loại nặng nằm giới hạn cho phép B A Hình 3.27 Ảnh minh họa sản phẩm squalene thơ (A), squalene tinh hỗn hợp acid béo (B) tách từ dịch lên men theo mẻ có bổ sung chất từ sinh khối tảo chủng PQ6 Hình 3.28 Sắc ký đồ HPLC squalene chuẩn (A) squalene (B) tinh từ sinh khối S mangrovei PQ6 Hình 3.29 Phổ 1H (A) 13C (B) NMR squalene tinh từ sinh khối S mangrovei PQ6 3.4 Tính an toàn tác dụng dược lý squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 mơ hình động vật thực nghiệm (in vivo) mơ hình tế bào (in vitro) 3.4.1 Độc tính cấp squalene mơ hình động vật thực nghiệm Chưa xác định LD50 squalene theo đường uống chuột nhắt trắng với mức liều cao 50 mL/kg KLCT (tương đương 58,25 g/kg KLCT) sau 178 h Kết thu chúng tơi hồn tồn phù hợp với kết nghiên cứu CTFA (1971) không xác định ảnh hưởng gây độc gây chết chuột cho uống squalene với liều cao 50 mL/kg thể trọng vịng ngày Do đó, squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 khơng độc 3.4.2 Độc tính bán trường diễn squalene mơ hình động vật thực nghiệm 3.4.2.1 Ảnh hưởng squalene lên tình trạng chung thay đổi thể trọng chuột cống trắng dùng dài ngày 13 Squalene với mức liều 400 mg/kg KLCT/24 h 1.200 mg/kg KLCT/24 h chưa thấy gây thay đổi lên phát triển thể trọng chuột, chuột hoạt động bình thường, lơng mượt, da niêm mạc ăn uống bình thường, phân thành khn sau 30 60 ngày thí nghiệm 3.4.2.2 Ảnh hưởng squalene số tiêu huyết học sinh hóa chuột Squalene với mức liều 400 mg/kg KLCT/24 h 1.200 mg/kg KLCT/24 h không làm thay đổi tiêu huyết học sinh hóa máu sau 30 ngày 60 ngày nghiên cứu Tuy nhiên, thời điểm sau 60 ngày, số HDL-C tăng cao so với thời điểm ban đầu 3.4.2.3 Đánh giá mức độ tổn thương chức gan, thận chuột dùng squalene dài ngày Sau 60 ngày cho chuột uống liên tục squalene liều 1.200 mg/kg KLCT/ngày không làm thay đổi hoạt độ enzyme AST ALT, số bilirubin toàn phần, albumin huyết tương cholesterol tồn phần, khơng gây tổn thương tế bào gan không ảnh hưởng đến chức gan, không ảnh hưởng lên chức thận chuột nghiên cứu Kết giải phẫu mô bệnh gan, thận, lách cho thấy không xuất tổn thương quan chuột uống với liều 400 1.200 mg/kg KLCT/ngày sau 60 ngày dùng liên tục 3.4.3 Tác dụng dược lý squalene chuột nhắt trắng thí nghiệm Để làm rõ tác dụng squalene làm tăng số HDL-C máu chuột, khối lượng thể, cân nặng gan, số lipid máu chuột nhắt trắng thí nghiệm đánh giá Với liều 600 mg/kg/ngày liều 1.200 mg/kg/ngày, uống liên tục 60 ngày, squalene có tác dụng làm tăng hàm HDL-C tỷ lệ HDLC/cholesterol toàn phần máu, làm giảm hàm lượng LDL-C VLDL-C máu không ảnh hưởng đến số cholesterol toàn phần TG máu, cân nặng gan phát triển cân nặng thể Kết thu tương tự với nghiên cứu Pallavi cộng (2013), Gabas-Rivena cộng (2014) 3.5 Bước đầu nghiên cứu chế tác dụng giảm lipid squalene tách chiết từ S mangrovei PQ6 mơ hình in vitro 3.5.1 Đánh giá độc tính squalene dịng tế bào Kết đánh giá độc tính squalene dòng tế bào HepG2 RAW264.7 cho thấy squalene không gây độc tất nồng độ thử nghiệm Khoảng 95 đến 100% tế bào sinh trưởng bình thường sau bổ sung squalene 72 h 3.5.2 Tác dụng giảm lipid squalene lên tế bào gan tế bào đại thụ thể 3.5.2.1 Tối ưu hóa thời gian nồng độ ủ squalene lên thay đổi hàm lượng lipid tế bào gan HepG2 Khi nghiên cứu ảnh hưởng thời gian ủ nồng độ squalene lên thay đổi nồng độ lipid dòng tế bào HepG2 bị rối loạn chuyển hóa cho thấy, hàm lượng TG tế bào HepG2 ủ với acid oleic (OA) acid palmitic (PA) tăng 85% so với đối chứng không ủ với acid Sau 72 h ủ với squalene nồng độ 20, 50 100 M, tích lũy lipid nội bào HepG2 giảm 20% so với đối chứng Do đó, nồng độ 50 100 M squalene sử dụng để xử lý tế bào thí nghiệm thời gian 72 h 3.5.2.2 Tác dụng squalene lên thay đổi hàm lượng lipid nội bào tế bào gan HepG2 RAW64.7 Ủ tế bào HepG2 với 100 M squalene làm giảm cholesterol trigyceride từ 100% tế bào đối chứng xuống tương ứng 80% (P < 0,05) 65% (P