Nghiên cứu các phương pháp phân tích cây thuốc lá chuyển gen

MỞ ĐẦU Cho tới nay đã có khoảng 2000 loại virus hại thực vật được phát hiện, trong đó có nhiều loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất và chất lượng cây trồng. Để hạn chế sự l

MỞ ĐẦU

Cho tới nay đã có khoảng 2000 loại virus hại thực vật được phát hiện, trong đó có nhiều loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất và chất lượng cây trồng Để hạn chế sự lây lan của virus thực vật , những biện pháp truyền thống đang được áp dụng hi ện nay như loại bỏ những cây bị bệnh ngay khi mới phát hiện , phun thuốc diệt môi giới truyền bệnh…t ỏ ra kém hiệu quả l ại đòi hỏi nhiều thời gian , công sức và ảnh hưởng xấu tới môi trường Việc tìm ra các biện pháp để ngăn chặn sự phát triển và lây lan của virus gây b ệnh trên thực vật đang là một vấn đề được quan tâm nghiên cứu Sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học trong thời gian gần đây thúc đẩy nhiều nghiên cứu theo hướng tạo giống cây trồng có khả năng kháng virus gây hại bằng công nghệ gen, góp phần phát triển một xu thế mới trong công cuộc phòng chống bệnh hại thực vật

Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, đã có nhiều ứng dụng sinh học phân tử trong chọn tạ o giống cây trồng kháng virus , trong đó , công nghệ RNA interference (RNAi) tỏ ra là một giải pháp hữu hiệu nhất thông qua việc sử dụng các vật liệu di truyền từ virus gây bệnh chuyển vào cây trồng tạo cây chuyển gen kháng chính virus đó với hiệu quả có thể lên tới 80-95%

Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trên mô hình cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) hoặc kháng đồng thời cả 2 loại virus trên Nhằm tiếp tục phân tích các đặc tính di truyền của gen chuyển ở thế hệ sau, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

tài: “Nghiên cứu các phương pháp phân tích cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá thế hệ T1”

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh virus thực vật

1.1.1 Giới thiệu chung về bệnh virus hại thực vật

Virus thực vật được phát hiện vào cuối thế kỉ 19 và đến đầu thế kỉ 20 có rất nhiều virus gây bệnh cho thực vật lần lượt được phát hiện như virus khảm thuốc lá, virus thoái hóa khoai tây, virus hại cà chua,… Virus thực vật gây hại nặng nề tới năng suất và chất lượng nông sản, mức độ thiệt hại có khi lên tới 100% Theo ước tính thiệt hại hàng năm do bệnh virus gây ra trên thế giới vào khoảng 70 tỉ USD

Cho đến nay, với sự phát triển của sinh học và sự trợ giúp của trang thiết bị, phương tiện hiện đại, trên 4 ngàn loại virus đã được phát hiện, trong đó có hơn 2000 loài là virus hại thực vật

Virus thực vật là những vi sinh vật vô cùng nhỏ bé và có nhữn g đặc đi ểm : (PGS.TS Vũ Triệu Mẫn và PGS.TS Lê Lương Tề, 2002)

 Virus có cấu tạo rất đơn giản : có hai phần chính là lõi axit nucleic và vỏ protein  Thông thường virus thực vật có vật chất di truyền là RNA , một số ít còn lại c ó

vật chất di truyền là DNA

 Virus là vi sinh vật kí sinh ở mức độ tế bào Virus thực vật có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài cây , và mỗi loài cây có thể nhiễm một hay nhiều loài virus

 Virus thực vật cũng như virus động vật, sau khi xâm nhiễm vào tế bào chủ chúng bắt đầu tác động đến sự trao đổi chất của tế bào, virus sử dụng vật chất của tế bào để tạo thành một số virus con mới Do vậy cơ thể thực vật bị kiệt quệ dần dần, thoái hóa và suy tàn có khi bị chết Khoảng thời gian từ lúc virus bắt đầu xâm nhiễm đến khi cây thoái hóa và chết phụ thuộc vào đặc điểm gây bệnh của các loài khác nhau và phụ thuộc vào từng loại cây cũng như sức chống chịu của từng cây

 Virus không thể phòng chống, tiêu diệt bằng xử lí các chất hóa học như những bệnh vi khuẩn, nấm và sâu bọ Cách duy nhất để loại bỏ virus là phải loại bỏ những cây trồng bị bệnh

1.1.2 Những thiệt hại của bệnh virus ở thực vật

Do virus có cấu trúc di truyền đơn giản, nên khả năng nhân lên và lây lan trong tế bào vật chủ rất nhanh chóng và gây ra biểu hiện bệnh trong thời gian ngắn Tác hại lớn nhất của virus là làm cho cây bị thoái hoá, giảm sức sống, dần tàn lụi Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hưởng tới phẩm chất của các sản phẩm nông nghiệp Sản phẩm từ cây bị nhiễm virus thường có chất lượng kém xa so với cây trồng bình thường Hạt lúa bị bệnh vàng lụi thường bị lép không cho thu hoạch, trong trường hợp được thu hoạch hạt thường rất nhỏ và hạt gạo bị đen, khi ăn có vị đắng Khoai tây bị virus gây hại làm cho cây cằn cỗi, lá khảm loang lổ, củ khoai nhỏ, hàm lượng tinh bột và các chất dinh dưỡng đều thấp Citrus tristeza virus hại cam quít rất nặng tại vùng bờ biển Địa Trung Hải, Trung Mỹ và Đông Nam Á Bệnh làm cho quả cam chín ép và rụng sớm, quả còn non đã úa vàng vỏ, nước cam nhạt không mùi vị

Việt Nam có chiều dài gần 2.000 km, khí hậu nhiệt đới gió mùa do vậy cây trồng, thảm thực vật Việt Nam và hệ sinh vật ở nước ta rất phong phú Đây là điều kiện để bệnh virus ở Việt Nam đa dạng về chủng loại lại dễ lây lan, gây thiệt hại nghiêm trọng tới sản xuất Gây hại nghiêm trọng nhất có thể kể tới các virus gây bệnh trên cây lúa (bảng 1.1) Trong lịch sử trồng lúa ở nước ta đã xảy ra rất nhiều trận dịch lớn vào các năm 1910, 1920, 1940 -1945, 1964 -1969, 2006-2010 đã tiêu huỷ mấy chục vạn ha lúa, tốc độ lây lan rất nhanh Cây lúa bị bệnh lúc đầu lá sẫm màu, sau đó cây lùn thấp lá xoè ngang, thâm lâu rễ đen, cây chết lụi nhanh chóng Bệnh có thể xuất hiện từ một vài m2 sau đó lây lan ra hàng trăm, hàng nghìn ha Làm cánh đồng lúa từ màu xanh biến thành màu nâu và chết lụi trong vòng 10 -15 ngày sau khi phát hiện bệnh Gạo thu được từ lúa bị bệnh thường có màu sẫm, đắng không ăn được Do đó, thiệt hại của bệnh có thể tính là 100% (1964 - 1968); đặc biệt dịch bệnh lúa lùn xoắn lá, lúa cỏ, lúa vàng lùn đã

phá hoại ở miền tây Nam bộ trên diện tích trên 500.000 ha (năm 2006 - 2007) Gần đây (2009-2010) virus gây bệnh lùn sọc đen trên lúa cũng đã xuất hiện ở một số tỉnh phía Bắc như Nam Định, Thái Bình,…(Bệnh cây chuyên khoa - Vũ Triệu Mân ) M ột số virus gây bệnh khác trên cây cà chua, khoai tây, lạc, đậu tương (bảng 1.1),… cũng có thể làm ảnh hưởng đến 80% năng suất cây trồng

Bảng 1.1 Một số loại virus gây bệnh trên cây lương thực và hoa màu

Lúa Bệnh vàng lá tungro Rice Tungro Sperical virus-RTSV

Bệnh lúa cỏ Rice Grassy Stunt Virus- RGSV

Bệnh lùn xoăn lá Rice Ragged Stunt Virus- RRSV

Bệnh sọc đen lùn Rice Black Streaked Drap Virus- RBSDV Ngô Bệnh khảm lá ngô Maize Mosaic Virus- MMV

Bệnh khảm lùn ngô Maize Dawrf Mosaic Virus- MDMV Cà chua Bệnh xoăn vàng lá cà chua Tomato Yellow Leafcurl Virus- TYLV

Bệnh đốm héo cà chua Tomato Spotted Wilt Virus- TSWV

Bệnh khảm lá cà chua Tomato Mosaic Virus- ToMV Khoai

tây

Bệnh virus Y khoai tây Potato Virus Y- PVY

Bệnh virus A khoai tây Potato Virus A- PVA

Bệnh virus X khoai tây Potato Virus X- PVX

Bệnh virus S khoai tây Potato Virus S- PVS

Bệnh virus M khoai tây Potato Virus M-PVM

Bệnh cuốn lá khoai tây Potato Leafroll Virus- PLRV

Bệnh khảm Aucuba Potato Aucuba Mosaic Virus- PAMV Dưa

chuột

Bệnh khảm dưa chuột Cucumber Mosaic Virus- CMV

2.1.3 Biện pháp phòng chống

Trên thế giới, nhiều biện pháp phòng trừ bệnh virus hại thực vật đã được áp dụng như loại bỏ nguồn bệnh, tiêu diệt côn trùng trung gian, diệt cỏ dại, luân canh cây trồng, dùng giống sạch bệnh hoặc giống chống bệnh, chịu bệnh Dựa vào đặc điểm của từng loại virus gây hại và đặc tính cây trồng, người ta đã đề ra những biện pháp phòng trừ cho từng nhóm bệnh theo khả năng truyền lan và sự tồn tại của nguồn bệnh

2.1.3.1 Sử dụng giống cây trồng có khả năng kháng b ệnh virus

Phương pháp này đem lại hiệu quả cao, không gây ô nhiễm môi trường và tạo được cây sạch bệnh Tuy nhiên biện pháp g ặp nhiều hạn chế về số lượng giống kháng bệnh cũng như nguồn vật liệu di truyền kháng virus phục vụ cho cho công tác lai tạo giống Hơn nữa, năng suất và chất lượng của giống kháng cũng là điều đáng lưu tâm vì rất khó tích hợp được nhiều phẩm chất trong một giống cây trồng

2.1.3.2 Sử dụng hạt, giống cây trồng sạch bệnh

Sử dụng nguồn vật liệu giống sạch bệnh được xem là biện pháp quan trọng nhất để hạn chế bệnh virus ở nhiều loại cây trồng Có thể tạo nguồn hạt giống, củ, cây giống sạch bệnh bằng những biện pháp như xử lý củ/hạt bằng nhiệt hoặc hóa

chất hoặc nhân giống in vitro tạo củ hoặc cây con sạch bệnh Nhược điểm của biện

pháp này là các loại cây trồng có thể bị nhiễm virus trong quá trình canh tác trên đồng ruộng

2.1.3.3 Biện pháp canh tác

Luân canh và xen canh có thể giảm bớt thiệt hại do sâu bệnh gây ra so với trồng thuần một loại cây trồng Mặt hạn chế của biện pháp này là rất khó chọn được hệ thống luân canh và xen canh vừa có hiệu quả đối với một số bệnh quan trọng mà vẫn đem lại lợi ích cao về mặt kinh tế Mùa vụ thích hợp giúp giảm thiệt hại do sâu bệnh gây ra mà còn giúp gia tăng năng suất rất đáng kể Gieo trồng tránh mùa phát triển của côn trùng trung gian truyền bệnh (còn gọi là né bệnh) có thể hạn chế được một phần thiệt hại do virus gây ra

2.1.3.4 Kiểm soát côn trùng trung gian truyền bệnh và loại bỏ các loại ký chủ trung gian nhƣ cỏ dại ,… Hiện nay phổ biến nhất là dung các loại thuốc trừ

sâu và diệt cỏ để hạn chế các trung gian này Tuy nhiên, nhiều loại virus như TMV lây truyền qua đường cơ giới, virus lây lan trực tiếp qua khí khổng hoặc vết thương trên vật chủ Hơn nữa, việc lạm dụng thuốc trừ sâu có thể gây ô nhiễm môi trường, gây nguy hiểm cho nông dân và người tiêu dùng Bên cạnh đó, virus có thể đượ c lây nhiễm với số lượng rất ít môi giới truyền bệnh , ví dụ: chỉ cần 1 con rầy nâu / cây lúa đã có thể truyền virus lùn lúa cỏ (RGSV)

2.1.3.5 Biện pháp công nghệ sinh học: Trong 15 năm qua một số virus đã

có thể kiểm soát được thông qua biện pháp tạo cây trồng chuyển gen mang các gen hoặc đoạn gen có nguồn gốc từ chính các virus gây bệnh (Reddy el al., 2009) Các cấu trúc gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh được sử dụng chuyển vào cây trồng để tạo tính kháng có thể là các loại khác nhau như: các cấu trúc của vius theo chiều xuôi (sense) hay chiều ngược (antisense) (Boogaart et al., 1998), các cấu trúc dạng kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) (Yin et al., 2005) và các miRNA nhân tạo có đích là các trình tự gen của virus gây bệnh (Niu et la., 2006; Qu và Fang, 2008) Thành công trong việc ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo giống cây trồng kháng bệnh virus được đánh dấu bởi công bố của Beachy và cộng sự năm 1986 khi những cây thuốc lá chuyển gen mã hóa protein vỏ của TMV (cấu trúc dạng sense) đã biểu hiện tính kháng với virus này (Beachy, 1990; Register và Nelson, 1992) Sau đó Beachy và cộng sự đã phát triển những thí nghiệm của mình thành phương pháp CP tạo cây trồng kháng virus Phương pháp này đã được áp dụng tạo những dòng cây chuyển gen kháng nhiều loại virus gây bệnh trên thực vật hai lá mầm và sau đó là thực vật một lá mầm (xem tổng quan của Hull và Davies, 1992) Tuy vậy, các cây chuyển gen này chỉ kháng được duy nhất một chủng virus mang gen mã hóa protein vỏ mà nó chuyển vào Điều này gây trở ngại trong việc phát triển các giống cây trồng kháng virus dựa trên phương pháp CP do độ đa dạng của virus thường khá cao (Scholthof et al., 1993) Tương tự như phương pháp CP, biểu hiện gen mã hóa cho enzyme liên quan tới quá trình tự sao chép hoặc sao mã (các replicase) cũng có thể tạo các cây chuyển gen kháng virus Cũng nghiên cứu trên

đối tượng TMV, Carr và cộng sự nhận thấy những dòng thuốc lá mang gen mã hóa cho replicase có khối lượng phân tử là 183kDa hoặc 54kDa có khả năng kháng TMV tốt hơn những dòng cây chuyển gen CP Biểu hiện replicase của virus khoai tây X (potato virus X: PVX) hay virus khảm dưa chuột (cucumber mosaic virus: CMV) chứng minh hiệu quả bảo vệ thực vật của phương pháp này (Braun và Hemenway, 1992; Anderson và cộng sự, 1992) Tuy vậy, tương tự như phương pháp CP, phương pháp bảo vệ qua trung gian gen replicase cũng chỉ có tác dụng trên từng chủng virus Hơn nữa, gen mã hóa cho các replicase thường rất lớn, gây trở ngại khi biểu hiện trên thực vật Nhằm khắc phục những hạn chế của cấu trúc “dạng sense”, các cấu trúc dạng antisense mang một đoạn DNA có trình tự bổ sung với RNA của virus có thể ức chế sự phiên mã với những trình tự RNA tương đồng đã được nghiên cứu và phát triển Nhiều dòng thuốc lá, khoai tây, cà chua,… kháng virus đã được tạo ra dựa trên kỹ thuật này.Việc sử dụng những đoạn DNA thay vì cả đoạn gen mã hóa đã làm những dòng cây chuyển gen có khả năng kháng với nhiều dòng virus thay vì chỉ một vài dòng nhất định (Boogart et al, 1998)

Cho tới những năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu nhất trong việc chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật Các bước chính trong kỹ thuật này bao gồm: (1) thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector chuyển mang cấu trúc RNAi

vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA

của virus gây bệnh, (3) sàng lọc các cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của các cây chuyển gen (Tenllado et al., 2004) Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của virus (gen mã hóa protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp,…) có khả năng kháng lại chính virus đó đã được chứng minh bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại virus khác nhau như: Potato virus Y PVY (Waterhouse et al., 1998; Smith et al., 2000), cucumber mosaic virus CMV (Kalantidis et al., 2002), Plum pox potyvirus PPV (di Nicola-Negri et al., 2005), Tobacco mosaic virus

TMV và Potato virus Y PVY (Sun et al., 2005), , Tomato yellow leaf curl virus TYLCV (Zrachya et al., 2007)Rice tungro bacilliform virus RTBV (Tyagi et al., 2008) African cassava mosaic virus ACMV (Vanderschuren et al., 2009 )… Trong những nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều thường được sử dụng để chuyển vào cây và sẽ được biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây Người ta đã nhận thấy rằng khi vùng đệm của hpRNA được lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo ra sự bất hoạt gen là cao nhất (Smith et al., 2000; Wesley et al., 2001) Năm 2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra được một dòng cây đậu chuyển

gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%

Cũng năm này, Shinichiro Kamachi và cộng sự đã công bố kết quả tạo ra được một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng cao với virus cucumber green mottle mosaic virus CGMMV đến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã được phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này Nói chung, hầu hết các cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus và làm chậm hoặc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh (Gottula et al, 2009)

Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus được công nhận và trồng thương mại như: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã được công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã được công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, được công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để được công nhận là giống cây trồng thương mại như: Sắn chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet

potato feathery mottle virus (Potyvirus)… (Reddy et al, 2009)

2.1.4 RNAi và cơ chế kháng bệnh bằng phương pháp chuyển gen virus

RNAi là một cơ chế căn bản để kiểm soát chuỗi thông tin di truyền hay cách vô hiệu hoá hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Andrew Z Fire và Craig C Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998

RNAi (RNA interference) được coi như một phương thức miễn dịch tự nhiên giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân huỷ các trình tự nucleotide tương đồng của chúng Nó làm trung gian kháng lại cả acid nucleic ngoại bào và nội bào, cũng nhờ điều khiển sự biểu hiện gen mã hóa protein Nó được thực hiện khi có sự xuất hiện của phân tử RNA mạch kép trong cơ thể sinh vật gây nên ức chế sự biểu hiện gen của một loại trình tự đặc hiệu

Hình 1.1: Cơ chế gây bất hoạt gen của RNAi

Cơ chế RNAi được bắt đầu bằng việc phân cắt phân tử RNA chuỗi kép (dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong những enzyme thuộc họ RNase III, tạo thành các phân tử RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thước khoảng 21 - 26 nucleotide Các siRNA này được giải xoắn và một mạch gắn kết với một phức hợp protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng sự bất hoạt RNA (RISC – RNA Induced Silencing Complex) Argonaute (protein Argonaute) trong RISC có

chứa RNase-H hoạt động nhờ một endonuclease sẽ tách siRNA thành những chuỗi RNA đơn, trong đó chỉ có một chuỗi đơn RNA có đầu 5‟ có lực bắt cặp base (base pairing) nhỏ nhất được chọn để tiếp tục đi vào phức hệ RISC Sau đó, RISC sẽ thu nhận các phân tử phiên mã mRNA nội sinh của tế bào có trình tự tương đồng với trình tự của chuỗi siRNA đang có mặt trong phức hệ bằng cách bắt cặp với các base theo nguyên tắc bổ sung Khi đã được nhận diện các mRNA nhanh chóng bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi xoắn kép siRNA-mRNA và bị tiêu hủy bởi các RNA nuclease (Helicase) có trong RISC Sợi RNA bị phân cắt, tiếp tục hình thành các siRNA Quá trình tiếp diễn liên tục nhờ vậy sẽ phân hủy các bản mã sao hình thành, kết quả là ức chế biểu hiện của gen mong muốn

2.1.5 Một số thành tựu của cây trồng chuyển gen kháng virus ở Việt Nam

Virus là nguyên nhân gây hại tới nhiều loại cây trồng trên thế giới cũng như ở Việt Nam Hầu hết các bệnh thực vật do virus gây ra cho tới nay chưa có thuốc đặc trị, do vậy tạo giống cây trồng kháng bệnh virus là mục tiêu nhiều nghiên cứu tại nước ta Từ năm 1999, phòng Công nghệ tế bào thực vật, viện Công nghệ sinh học phối hợp với 5 nước trong khu vực ASEAN tham gia vào chương trình nghiên cứ u phát triển cây đu đủ chuyển gen kháng virus đốm vòng (Papaya ringspot virus : PRSV) do tổ chức ISAAA (International Service for Acquisition of Agri -biotech Application) tài trợ Trong khuôn khổ đề tài nhóm thực hiện đã phân lập được g en CP của một số chủng virus tại miền Bắc và Nam Trung Bộ Gen CP được sử dụng để thiết kế các cấu trúc chuyển gen vào cây đu đủ nhằm tạo cây chuyển gen kháng virus đốm vòng Một số dòng cây đu đủ chuyển gen đã biểu hiện tính kháng virus sau khi thử nhiễm bệnh nhân tạo (Lâm Đại Nhân, 2000; Lê Trần Bình, 2008)

Thời gian gần đây đã có một số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do GS Lê Trần Bình và TS Chu Hoàng Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus Một trong những kết quả của đề tài cấp Viện KH &CN Việt Nam được tiến hành

trong 2 năm 2007-2008: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus” là đã tạo được các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus trên

Hình 1.2: Dòng thuốc lá T-CMV-49 biểu hiện kháng bệnh hoàn toàn và cây đối chứng WT2-1 sau 3 lần lây nhiễm

Tiếp đó , đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả kháng bệnh virus phổ rộng bằng chuyển gen đa đoạn” (KC.04.03/06-10) đã thiết kế thành công 2 đoạn gen nhân tạo mang đa đoạn gen CP , Nib và HC -pro của PRSV gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ và 2 đoạn gen đa đoạn RdRp -CP-p20-p23 của virus tàn lụi (Citrus tristeza virus, CTV) và thiết kế thành công những cấu trúc RNAi mang các gen đa đoạn này Thử nghiệm tính kháng với các dòng đu đủ và cam chuyển gen mang cấu trúc RNAi trên cho thấy sự có mặt của vir us gây bệnh trên các dòng cây chuyển gen nhưng không thấy cây có biểu hiện bệnh (Chu Hoàng Hà, 2010)

Hình 1.3: Dòng đu đủ biểu hiện kháng bệnh hoàn toàn(hình A) và cây đối chứng (hình B) sau 2 tháng lây nhiễm

Đây là cơ sở quan trọng chứng tỏ khả năng làm chủ công nghệ RNAi của các nhà khoa học Việt Nam và mở ra khả năng ứng dụng công nghệ RNAi đối với các đối

tượng cây trồng khác

2.2 Cây thuốc lá- mô hình nghiên cƣ́u tạo cây trồng chuyển gen khá ng virus 2.2.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá

Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana sp; thuộc họ (Family) : Solanaceae (họ cà), chi (Genus): Nicotiana, loài (Species): Nicotiana tabacum L

Các nhà khoa học đã phân chia Nicotiana thành 3 chi phụ, 14 phân chi và 65

loài Trong số 65 loài là cây bản địa Bắc và Nam Mỹ , 15 loài bản địa Australia trong đó loài N tabacum thuộc phân chi Genuinae là được gieo trồng thương mại trên khắp thế giới Ở Việt Nam, cây thuốc lá đem lại hiệu quả kinh tế cao cho nông dân và thu nhập quốc gia Theo thống kê của Tổng công ty thuốc lá Việt Nam (Vinataba) trong 3 năm (2006-2008) tổng doanh thu đạt 47.656 tỷ đồng, nộp ngân sách nhà nước được 9.653 tỷ đồng, kim ngạch xuất khẩu đạt 192,136 triệu USD, việc làm của người lao động được đảm bảo, đời sống từng bước được nâng cao với thu nhập bình quân đầu người tăng 15,59%/ năm Thuốc lá có giá trị kinh tế cao, ngoài việc tiêu dùng trong nước nó còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị Ngoài ra,

cây thuốc lá còn được coi là mô hình để tiến hành nhiều nghiên cứu sinh học cơ bản về chức năng , vai trò cũng như cơ chế hoạt động của các gen cũng như được sử dụng làm mô hình thử nghiệm và phát triển những nghiên cứu ứng dụng như biểu hiện các protein tái tổ hợp có giá trị

2.2.2 Tình hình bệnh virus hại thuốc lá

Hiện nay, bệnh virus là một trong những nguyên nhân làm gi ảm năng suất và chất lượng cây thu ốc lá nguyên liệu Trong đó , virus khảm thuốc lá (TMV) và virus khảm dưa chuột (CMV) là hai virus gây bệnh phổ biến và nghiêm trọng nhất (Nguyễn Văn Chín và Nguyễn Ngọc Bích, Tổng công ty thuốc lá Việt Nam)

Bệnh khảm lá xuất hiện khá sớm ngay sau khi cây phục hồi ho àn toàn với tỷ lệ thấp (2,3-5,2%) và tăng dần hoặc tăng nhanh sau 20-50 ngày tùy theo vùng , từ 18,5-26,5% thậm chí lên tới 100% như ở xã Lâu Thượng, tỉnh Thái Nguyên; trong đó giống thuốc lá rất mẫn cảm với TMV và CMV chủ yế u là K 326 Thiệt hại do virus gây ra ở cây thuốc lá lên đến hàng chục tỷ đồng (Nguyễn Văn Chín và Nguyễn Ngọc Bích, 2008)

Đối với bệnh do virus nói chung và bệnh khảm lá do hai virus TMV và CMV gây ra nói riêng hiện vẫn chưa có loại thuốc hóa học nào khả dĩ có thể phòng trị được một cách hữu hiệu , do đó các biện pháp phòng bệnh tốt nhất là sử dụng các hạt giống sạch bệnh để trồng , không sử dụng các hạt giống từ các ruộng trước đó đã bị bệnh nói trên để làm giống cho vụ sau Thường xuyên kiểm tra đồng ruộng để phát hiện và phun thuốc diệt trừ các loại côn trùng chích hút như bọ cách tơ , bọ phấn, rệp muội…bằng các loại thuốc trừ sâu để tránh lây lan Khi phát hiện các triệu chứng bệnh trên đồng ruộng cần tập trung nhổ cây , đem ra khỏi ruộng tiêu hủy để tránh lây lan

2.2.3 Virus gây bệnh khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus, TMV)

TMV thuộc loại Tobamovirus là một trong những virus gây hại trên thực vật được mô tả sớm nhất bởi Mayer (1886), Iwanowski (1892), Allard (1914) và Stanley (1935) (Kung and Yang, 1998)

TMV là virus hình que có chiều dài 300 A0, đường kính từ 150-170 A0có cấu tạohình ống rỗng và protein sắp xếp cuộn xoắn xung quanh lõi trung tâm TMV là virus đơn dương (ssRNA) có hình cuộn xoắn Dạng que hoàn chỉnh của TMV có 2130 đơn vị hợp thành capsid (capsomeres), cứ 6 capsomer tạo thành một vòng xoắn (Stryer Lubert, 1988) Genome của TMV gồm 6400 nucleotide được chia thành 4 khung đọc mở (open reading frames- ORFs) RNA của TMV có cấu trúc mũ 7-methylguanosine ở cuối đầu 5‟ (Zamore et al., 2000), nối tiếp 68 nucleotide không mã hóa trợ giúp quá trình dịch mã (Gallie et al., 1987) Tiếp theo vùng này là hai vùng mã hóa cho các protein với kích thước tương ứng là 183kDa và 126 kDa (Goelet et al., 1982) Đây là protein có vai trò quan trọng trong quá trình sao chép của virus Vùng mã hóa thứ 3 mã hoá cho protein cần thiết cho sự di chuyển qua gian bào của virus (Meishi et al., 1987) có khối lượng phân tử khoảng 30 kDa Protein vỏ (CP) có khối lượng phân tử 17,5kDa nằm trong vùng mã hóa thứ 4

Hình 1.4 Cấu trúc TMV và tổ chức hệ gen (Chapman, 1998)

Vị trí của các ORF của hệ gen RNA được biểu thị bởi các hình chữ nhật Kích thước của protein (kDa) tương ứng với các ORF trên được chỉ ra trong ngoặc Vỏ protein với kích thước 17,5 kDa được mã hoá bởi ORF thứ 4 Các đặc điểm của hệ gen và các subgenomic được chú thích ở phía trên và bên dưới

Gen CP của TMV theo sau vùng không dịch mã có chứa vài trình tự pseudoknot, trình tự này liên quan đến sự tăng cường dịch mã (Leather et al., 1993) Tại đầu 3‟ của hệ gen RNA mang cấu trúc giống RNA vận chuyển (tRNA) có thể được aminoacyl hóa CP là protein cần thiết cho quá trình hình thành virion và có thể điều khiển sự lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác của virus (Saito et al.,

1990; Kawakami et al., 2004) Vai trò của gen CP cũng cho phép sử dụng gen CP làm nguyên liệu cho tạo cây trồng chuyển gen kháng virus TMV bằng cơ chế bất hoạt RNA (RNA interference) (Yan et al., 2007)

TMV có thể gây bệnh ít nhất 199 loài trong 35 họ (Shew and Lucas, 1991) thực vật khác nhau nhưng nhiều nhất là trên cây thuốc lá Khi cây bị bệnh các lá non đều biến màu thành dạng khảm bao gồm các vùng xanh nhạt xanh đậm không đồng đều xen lẫn nhau , hình loang lổ như da ếch , hay còn gọi là dạng khảm TMV được lan truyền bằng đường cơ giới do tiếp xúc virus thâm nhập vào các tế bào qua các vết thương và qua khí khổng lá, thân hoặc rễ TMV rất bền như ở dạng kết tủa cồn, ở lá khô virus vẫn còn hoạt tính gây bệnh sau một năm Trong nhiều trường hợp TMV phối hợp với virus X khoai tây (PVX) cùng gây hại trên cà chua gây ra bệnh đốm sọc đôi (double virus streak hay là Mixed virus streak) Bệnh nặng làm đầu lá bị khô và ngọn cà chua bị chết (Gibbs, 1999)

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu thực vật:

Hạt thuốc lá Nicotiana tabacum L (giống K326) thế hệ T1 chuyển gen mang cấu

trúc TMV_RNAi do phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

2.1.2 Hóa chất, máy móc, thiết bị

- Hóa chất: Yeast extract, Agarose, K2PO4, KH2PO4, SiC, HCl, NaOH, MgCl2, Etanol 70%, nước Javen, nước khử ion, kháng sinh kanamycin, Taq DNA polymerase và các hóa chất thông dụng khác

- Máy móc, thiết bị: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm , cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học

2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Khử trùng hạt thuốc lá

2.2.1.1 Khử trùng hạt bằng dung dịch Javel

Ngâm hạt trong cồn 70% khoảng 20‟‟, lắc nhẹ sau đó loại bỏ cồn bằng pippet khử trùng Ngâm hạt trong dung dịch tẩy (Javel thương phẩm 10-30% có bổ sung Tween20 0,05-0,1%) khoảng 20‟ có lắc nhẹ Sau khi loại bỏ dung dịch tẩy bằng pippet, rửa hạt 4-5 lần bằng nước cất khử trùng

2.2.1.2 Khử trùng hạt bằng khí Clo

Hạt thuốc lá được cho vào từng ống eppendorf, mở nắp và cho vào bình Pyrex dung tích 250ml Mở hé ¼ nắp bình Pyrex có chứa hạt thuốc lá và đặt bên cạnh cốc thủy tinh chứa 100ml dung dịch Javel Dùng pipet thủy tinh hút lấy 3ml HCl đặc cho vào cốc thủy tinh đựng Javel để tạo khí Clo sau đó đậy kín bình khử trùng và dán parafin Sau 3-9h tháo parafin và mở hé ¼ nắp bình khử trùng trong khoảng 2 phút để bay hết khí, sau đó vặn chặt nắp bình Pyrex và lấy ra ngoài Mở nắp bình Pyrex trong box cấy 30 phút để bay hết khí và cấy hạt trên môi trường

2.2.2 Phân tích sự phân ly của gen chuyển

Gieo hạt và đánh giá tỉ lệ kháng kanamycine

- Gieo hạt trên đĩa nhựa chứa môi trường MS

- Sau khi cây con mọc cao khoảng 1cm thì chuyển sang bình tam giác 250ml chứa môi trường MS + kanamycine 50mg/l Mỗi dòng chuyển 80 cây và đặt 10 cây/ bình tam giác

- Sau 3-4 tuần quan sát, đánh giá số lượng cây sống sót trên môi trường có kanamycine

2.2.3 Phân tích sự có mặt của gen chuyển bằng phương pháp PCR

- Bổ sung 50-100 l nước đề ion khử trùng để hòa tan cặn - DNA được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%

2 Buffer PCR (NH+4) 2

3 MgCl2 2

4 dNTPs 1,6 5 Primer – Fi 0,8 6 Primer – Ri 0,8 7 Taq polymerase 0,2 8 Template 2,5 Tổng 20

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ (OC) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 94 3 phút 1

2 Biến tính 94 1 phút

3 Gắn mồi 50 1 phút 25

4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút

5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1

6 Kết thúc phản ứng 4 ∞

2.2.4 Phương pháp lây nhiễm virus nhân tạo

Các cây chuyển gen sau khi trồng ngoài nhà lưới cao khoảng 10-30 cm được kiểm tra tính kháng virus nhân tạo của Herbers và các cộng sự (1996) có cải tiến Các bước tiến hành như sau:

- Mẫu lá bị bệnh được nghiền trong đệm phosphat 100 mM (~1g mẫu lá trong 20 ml buffer) với pH = 7

- Lá lây nhiễm được gây tổn thương nhẹ bằng SiC

- Cho dịch virus lên phần lá đã gây xước, sau vài phút rửa lá bằng nước - 10-20 ngày sau khi lây nhiễm, triệu chứng sẽ xuất hiện trên cây

- Có thể lây nhiễm thêm nếu sau khi lây nhiễm lần 1 không thấy bệnh biểu hiện trên cây WT

- Đánh giá kiểu hình của các cây lây nhiễm nhân tạo sau 10-20 ngày

2.2.5 Phương pháp ELISA

- Lấy 200 mg lá non (lá thứ 3 hoặc thứ 4 từ trên xuống) nghiền thành dịch đồng nhất với 2 ml đệm PBST (16 mM Na2HPO4, 3,9 mM Na H2PO4, 127 mM NaCl và 0,05 % Tween 20 (pH 7,2)) có chứa 0,1 % albumin bò (Sigma)

- Dịch nghiền được ly tâm ở 5000 v/p, 4 oC, 10 phút

- Thu dịch nổi (gọi là kháng nguyên) Từ đĩa 96 giếng, bổ sung 200 l kháng nguyên vào mỗi giếng và ủ 37 oC khoảng 1 h

- Sau khi, rửa 3 lần với đệm PBST, kháng thể (IgG) kháng CMV, TMV và PVY được hòa tan vào đệm PBST theo tỷ lệ thích hợp, sẽ được bổ sung vào những giếng có kháng nguyên và ủ 37 o

C trong 1 h

- Đĩa được rửa lại 3 lần trước khi thêm 200 l alkaline phosphatse-kết hợp đoạn F(ab‟)2 đã tinh sạch từ IgG thỏ hòa tan 1:2000 trong bệm PBST chứa 0,1 % albumin bò

- Đĩa được ủ một lần nữa ở 37 oC trong 1 h Sau khi rửa, đệm nền (10 % diethaolamine, 3 mM NaN3, pH 9,6) chứa 0,1 % disodium p-nitrophenyl phosphate, được bổ sung vào các giếng và ủ ở nhiệt độ phòng 30-40 phút - Giá trị OD được đo ở 405 nm bởi một microplate reader Phản ứng màu

được tạo ra bằng việc các mẫu kiểm tra được so sánh với giếng đối chứng âm đã biết

- Một cây kiểm tra được xác định là dương tính khi giá trị OD trung bình lớn hơn hai lần giá trị trung bình của đối chứng âm