Nghiên cứu sản xuất thang chuẩn ADN chất lượng cao đề tài NCKH QG 07 12

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG đ i ’ h ọ c k h o a h ọ c TỮ n h i ê n • • • • BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT THANG CHUẢN ADN CHẮT LƯỢNG CAO C h ủ tr ì đ ề tà i: TS V õ T hị T h n g L an C n b ộ th a m g ia : T S L ê H ù n g CN Phạm A nh T hùy D ương ĐAI H O : q TR Ư \ S Ã! ■ T )T / : :?;a ■ -' u o 9(1 Hà Nội - 0 Lời cảm ơn Chủ nhiệm đề tài toàn thể cán tham gia thực đề tài QG 07-12 trân trọng cảm ơn Đại học Quốc gia Hà Nội tài trợ kinh phi Đề tài thực Phịng thí nghiệm Sinh Y-Khoa Sinh học Phịng Cơng nghệ ứ ng dụng-Phòng thỉ nghiệm trọng điểm Protein-Enzym, Đại học Khoa học Tự nhiên Báo cáo tóm tắt a Tên đề tài: Nghiên cứu sàn xuất thang chuẩn ADN chất lượng cao M ã số: QG 07-12 b Chủ trì đề tài: TS Võ Thị Thương Lan c Các cán tham gia: TS Lê Hùng CN Phạm Anh Thùy Dương d Mục tiêu nội dung nghiên cứu: Mục tiêu : Xây dựng qui trình thiết kế thang chuẩn ADN có chất lượng cao bầng kỹ thuật ADN tái tổ hợp nhàm mở triển vọng sản xuất thang chuẩn cung cấp cho nghiên cứu sinh học phân tử xét nghiệm chẩn đoán đại Nội dung- - Xây dựng qui trình thiết kế thang chuẩn ADN 500 bp gồm băng từ 500 bp đến 4500 bp - Các băng cùa thang chuẩn ADN 500 bp cỏ kích thước tương đương băng cùa thang chuẩn ADN thương mại số hãng nước (Fermentas, New England Biolabs) sản xuất, dựng phổ biển nước e Các kết đ ạt được: Xác định thành công điều kiện tối ưu để nhân đoạn ADN cỏ kích thước kb, 1.5 kb kb kỹ thuật PCR Tạo vector tái tổ hợp chứa đoạn 115 bp, 270 bp, kb, 1.5 kb thiết kể vector kb, biển nạp thành công vào tế bào E.coỉi DH5a Thiết kế thành công thang chuẩn ADN PCR với băng kích thước từ 199 bp đến 2000 bp Thiết kế thành công thang chuẩn ADN tái tổ hợp với băng kích thước từ 500 bp đến 4634 bp Đào tạo cử nhân tài học viên Cao học Công bo I báo báo cáo tạp hội nghị chuyên ngành f Tình hình kỉnh p h í : Tổng kinh phí đề tài là: Thanh tốn dịch vụ cơng cộng: Hội nghị: * 100.000.000 VNĐ 11.000.000 VNĐ 7.500.000 VNĐ Chi phí thuê mướn: 36.000.000 VNĐ Chi phí nghiệp vụ chun mơn: 45.500.000 VNĐ Summary a) The title o f subject: Numerical code: b) The grant holder: c) The Participants: Study on development of new quality DNA Ladder QG 07-12 Dr Vo Thi Thuong Lan Dr Le Hung B.Sc Pham Anh Thuy Duong d) Objectives and contents * Objectives' Development of new strategies to produce high quality DNA ladders which can be attributed to biotechnology and molecular biology laboratories with lower cost and quality assurance than commercial DNA ladders presently available * Contents: > Development of new sừategies to produce DNA ladder 500 bp including 7-8 bands from 500 bp to 4500 bp > The new DNA ladder consists DNA bands with sizes similar to those of DNA ladders provided from different vendors including Fermentas, New England Biolabs e) The obtained results: > Optimazing the PCR conditions for amplification of DNA fragments of kb, 1.5 kb and kb > Successfully cloning the DNA fragments of 115 bp, 270 bp, 845 bp, kb, 1.5 kb, and successfully creating a recombinant DNA vector of kb > Successfully producing DNA PCR Ladders including DNA fragments wich sizes from 199 bp to 2000 bp > Successfully producing DNA Ladder by using recombinant DNA technology, which consists DNA fragments from 500 bp to 4634 bp XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA (ký ehi rõ ho tên) (ký ghi rõ họ tên) PHÓ CHỦ NHIỆM KHOA PGS.TS M w S tu m CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI CỦA TRƯỜNG MỤC LỤC MỞ ĐÀU CHƯƠNG TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VÈ THANG CHUẨN ADN 1.1.1.Định nghĩa phân loại thang chuẩn ADN 1.1.2.Các phương pháp sản xuất thang chuẩn ADN 1.2 THỊ TRƯỞNG THANG CHUẨN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.2.1.Thang chuẩn ADN thương mại giới 1.2.2.Tinh hình sử dụng thang chuẩn Việt Nam 1.3 MỘT SÓ KỸ THUẬT SINH HỘC PHÂN T Ử .8 1.3.1.Kỹ thuật PCR- ! 1.3.2.Kỹ thuật tách dòng phân tử (molecular cloning) .9 1.3.3.Phương pháp giải trình tự 12 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆUVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 13 2.1 NGUYÊN LIỆU 13 2.1.1.Nguyên liệu phản ứng PCR, 13 2.1.2.Các vector tách dòng vả chủng vi khuẩn .13 2.1.3.Hoá chất 13 2.1.4.Thiết b ị .13 2.2 S ĐỎ NGHIÊN c ứ u 14 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 14 2.3.1.Tách chiết ADN genome cùa Arabidopsis thaỉìana 14 2.3.2.Kỹ thuật PCR .7 15 2.3.3.Phưong pháp tách dòng sử dụng kit Fermentas 15 2.3.4.Phương pháp biến n ạp 15 3.5.Phương pháp tách chiết plasmid từ vi khuẩn 16 2.3.6.Kỹ thuật xử lý plasmid enzyme giới hạn 16 2.3.7.Kỹ thuật nối A D N 17 2.3.8.Kỹ thuật tinh ADN : .17 2.3.9.Phương pháp điện d i .17 2.3.10.Phương pháp xác định nồng độ ADN 17 CHƯƠNG KÈT QUA 18 3.1 GIEO TRỎNG HẠT A THALIANA VÀ TÁCH ADN GENOME 18 3.2 KHUÉCH ĐẠI CAC TRÌNH T ự kb, 1.5 kb, kb BẦNG PHẢN ỨNG PCR 19 3.3 TÁCH DÒNG VECTOR TÁI TÒ HỢP .21 3.3.1.Tách dòng vector tái tổ hợp chứa đoạn ADN lkb 21 3.3.2.Tách dòng vector tái tổ hợp chứa đoạn ADN 1.5 kb.,„ 22 3.3.3.Tách dòng vector tái tổ hợp chứa đoạn ADN kb 23 3.4 THIÉT KE BẢNG kb 23 3.5 THIÉT KÉ CÁC BĂNG KÍCH THƯỚC N H Ỏ 24 3.5.1.Vector tái tổ họp mang đoạn chèn 850 bp 24 3.5.2.Vector tái tổ hợp mang đoạn chèn nhỏ 500bp 25 3.6 PHỘI TRỘN CAC SAN PHẨM TẠO THANG CHUẨN ADN 27 3.6.1.Phối trộn tạo thang chuẩn từ sản phẩm PCR 27 3.6.2.Xây dựng thang chuẩn tái tổ hợp 28 KÉT L U Ậ N 33 KIÉN NG H Ị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 * M Ở ĐẦU Công nghệ sinh học định nghĩa sản xuất hàng hố dịch vụ quy mơ cơng nghiệp nhờ sử dụng sinh vật, hệ thống sinh học q trình sinh học N gày nay, cơng nghệ sinh học đạt tiến vượt bậc nhờ hỗ trợ công nghệ ADN tái tổ hợp Sự kết hợp tạo lĩnh vực nghiên cứu cỏ tính cạnh íranh cao đầy triển vọng, gọi công nghệ sinh học phân tử Hàng loạt công ty phục vụ sinh học đã, tạo ngày nhiều sản phẩm công nghệ sinh học phân tử Trong năm gần đây, công nghệ sinh học phân tử Việt N am quan tâm ưu tiên phát triển Đây yếu tố quan trọng giúp cho sở nghiên cứu sinh học phân tử nước cỏ điều kiện phát triển, tiếp cận với kỹ thuật đại nhằm nâng cao chất lượng nghiên cứu, ứng dụng thực tế phục vụ sống Nhiều phịng thí nghiệm cơng nghệ sinh học phân tử đời, trang bị đầy đủ, đồng nhân lực sở vật chất Bên cạnh trang thiết bị, máy móc đại, nghiên cứu sinh học phân tử yêu cầu nguồn hố chất, sinh phẩm có chất lượng Tuy nhiên, hoá chấỉ sinh phẩm đa phần nhập từ nước ngồi với giá thành cao chất lượng khơng ổn định điều kiện bảo quản chưa đảm bảo, thời gian vận chuyển lâu Khó khăn đặt yêu cầu cho đơn vị nghiên cứu sinh học phân tử nước sản xuất sinh phẩm có chất lượng đảm bảo giá thành phù hợp Thang chuẩn AD N m ột số sinh phẩm sử dụng phổ biến phịng thí nghiệm sinh học phân tử Đây công cụ thiếu nhằm xác định kích thước nồng độ phân tử ADN Ở Việt Nam nay, tất thang chuẩn sử dụng nhập ngoại Với mong m uốn đáp ứng nhu cầu sử dụng thang chuẩn ADN cho đơn vị nghiên cứu nước với chất lượng cao giá thành rẻ, chủng thực đề tài “N ghiên cử u th iế t kế th an g ch u ẩn ADN ch ất lượng cao” M ục tiêu đề tài tạo thang chuẩn A DN 500 bp gồm 7-8 băng kỹ thuật sinh học phân tử Đề tài thực Phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học Phịng Cơng nghệ ứng dụng - Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ protein - enzyme, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội CHƯƠNG 1.1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU GIỚI THIỆU VỀ THANG CHUẤN ADN 1.1.1.Định nghĩa phân loại thang chuẩn ADN Thang chuẩn ADN định nghĩa hỗn hợp chứa phân tử ADN có kích thước khác sử dụng điện di nhằm đánh giá kích thước nồng độ đoạn ADN chưa biết [4, 24] Người ta thường chia thang chuẩn ADN làm hai loại [4, 9, 33] Loại thiết kế gồm số băng ADN ( - băng) có kích thước chênh lệch theo bước nhảy định gọi ADN ladder Các bước nhảy thay đổi khác nhau, thường phổ biến 10 bp, 50 bp, 100 bp, 200 bp, 500 bp kb (Hình 1) » Iwn*ề m o 8000 6000 « « « 5000 4000 ao « 3000 « 3000 m mo « SCO « Hình I Thang chuẩn ADN ladder [35] Loại sản xuất theo kỹ thuật xử lý phân tử ADN lớn (ADN genome thực khuẩn thể lamda, X hay plasmid pBR322) với enzyme cắt giới hạn vị trí định Loại thang chuẩn gồm đoạn ADN kích thước khác với bước nhảy khơng xác định, gọi ADN marker (Hình 2) Ngồi cách phân loại trên, người ta cịn phân biệt thang chuẩn theo nhiều tiêu chí khác Dựa theo phương pháp thiết kế có loại thang chuẩn thang chuẩn PCR, thang chuẩn tái tổ hợp, thang chuẩn tổng hợp hố học Dựa theo kích thước băng có loại thang chuẩn kb, 500 bp, 100 *■ bp chí bp Ví dụ thang chuẩn kb gồm chủ yếu băng có bước nhảy kb; thang chuẩn 100 bp gồm băng từ kích thước từ 100 bp đến kb với bước nhảy 100 b p A B Hình Thang chuẩn ADN marker A: ADN thực khuẩn thể X cất với £coRI B: ADN thực khuẩn thể X cắt với £coRI Hindĩíl [28, 31] Ngồi loại thang chuẩn thông thường, số kiểu thang chuẩn thiết kế đặc biệt thang chuẩn phát huỳnh quang nhằm phục vụ cho kỹ thuật lai acid nucleic 1.1.2 C ác p h n g p h p sản x u ất th an g ch u ẩn ADN Do thang chuẩn sản phẩm thương mại quan trọng nên kỹ thuật liên quan đến thiết kế sản xuất thang chuẩn ADN cơng bố ấn phẩm khoa học Hầu hết tài liệu thang chuẩn nhà sản xuất cung cấp sâu vào m ô tả sản phẩm cách sử dụng N hìn chung, có phương pháp áp dụng để sản xuất thang chuẩn ADN 1.1.2.1 Phương pháp tổng hợp hoá học [27,10] Tổng hợp hoá học sợi đơn ADN có trình tự xác định thực thiết bị tự động Quá trình tổng hợp ADN lập trình để đưa nucleotide, hoá chất theo thứ tự định, cần thiết cho việc gắn nucleotide vào chuồi tổng hợp Tất phản ứng thực theo trình tự cột phản ứng đơn Thời gian phản ứng bước rửa kiểm tra chương trình tự động Do thực tự động nên việc sản xuất oligonucleotide sợi đơn không phức tạp Sau tổng hợp, đoạn oligo có kích thước tính tốn phổi trộn theo tỷ lệ định để tạo thang chuẩn Các oligo thường có kích thước từ 10 đến tối đa 200 nucleotide Phương pháp có ưu điểm nhanh, xác; máy móc dễ thao tác cho sản phẩm tinh sạch, đạt chất lượng tốt Tuy nhiên, thang chuẩn sản xuất theo phương pháp có giá thành cao; ADN tổng hợp dạng sợi đom nên muốn tạo dạng sợi kép phải trải qua bước tạo cặp bổ sung Do vậy, phương pháp thường sử dụng để tạo thang chuẩn có băng kích thước nhỏ, thang chuẩn bp hay 10 bp (Hình 3) Hình Thang chuẩn 5bp lObp hãng Mbiotech [25] 1.1.2.2 P hương pháp x ỉỷ vật liệu A D N với enzyme giới hạn /29, 33] Xử lý phân tử ADN lớn enzyme giới hạn để tạo đoạn ADN có kích thước khác phương pháp thiết kể thang chuẩn ADN đơn giản, hãng sản xuất quan tâm phát triển Phương pháp dựa nguyên tắc sử dụng phân tử ADN biết đồ enzyme giới hạn thực khuẩn thể X, X , plasmid pB R 322, để xử lý với m ột vài enzyme giới hạn (Hináỉỉỉ, £ cớ R I, ) Sản phẩm thu đoạn ADN có kích thước khác phụ thuộc vị trí cắt enzyme (Hình 2) Ưu điểm phương pháp thực dễ dàng, tận dụng nguồn ADN có sằn tự nhiên nên sản phẩm có giá thành rẻ Tuy nhiên, phân bố ngẫu nhiên trình tự cắt cùa enzym e giới hạn nên không chủ động việc tạo băng có kích thước mong muốn bước nhảy băng 1.1.2.3 Phương pháp phối trộn sản phẩm PCR [4] Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) phản ứng chuỗi trùng hợp cho phép tổng hợp nhanh chóng đoạn ADN cỏ kích thước khác Sau đó, đoạn AD N tinh phối trộn theo tỷ lệ định tạo thang chuẩn ADN Tuy nhiên thang chuẩn sản xuất theo phương pháp đắt hố chất có giá thành cao Bên cạnh đó, băng sản phẩm PCR thường không sắc nét nên chất lượng thang chuẩn mức tương đối (Hình 4) GENE CHOICE a P E L IC A N L IF E S C I f N C E S C O K P A 'iY Band Stae (bp) ngfBand 5.000 25 2.000 2S 1,500 25 1.000 75 700 25 500 25 300 25 100 25 Hình Thang chuẩn PCR hãng Gene Choice [30] 1.1.2.4 Phương pháp tạo AD N tải tổ hợp [1 ,1 ] Nguyên tắc phương pháp tạo phân tử ADN tái tổ hợp từ hai hay nhiều đoạn ADN có nguồn gốc kích thước khác Các phân tử ADN tái tổ hợp thường gồm phân tử ADN plasm id (vector) chèn m ột đoạn ADN lạ Kích thước đoạn ADN lạ tính tốn trước nên xử lý vector tái tổ hợp với enzyme giới hạn cho băng có kích thước mong muốn Bên cạnh phân tử ADN tái tổ hợp có khả tái tế bào nhận nên dễ dàng thu lượng lớn ADN Vì vậy, có dịng tế bào chứa vector ADN tái tổ hợp việc tạo băng thang chuẩn trở nên đơn giản, nhanh chóng; qua giá thành sản phẩm giảm xuống Với phương pháp này, chủ động tạo thang chuẩn với kích thước bước nhảy mong muốn Các băng thu rõ ràng sắc nét Phương pháp tạo ADN tái tổ hợp khơng địi hỏi trang thiết bị hoá chất đại, đắt tiền Đây phương pháp hãng sản xuất sử dụng chủ yếu Conclusion Two types of DNA ladder designed and developed by us can be produced at low er cost with quality assurance than commercial DNA ladders presently available Production o f these ladders is simple and can be achieved in large seals in Vietnam w hich is an indispensable reagents for research applications, in molecular biology and biological medicine A cknow ledgem ents R eferen ces [1] HD Hyman, Method o f making DNA lad US Patent No 5939293, 1999 [2] M.A Saghai Maroof, K M Solima, Jorgenson, R.w Allard, Ribosoma] I spacer-length polymorphisms in bi mendelian inheritance, chromosomal loci and population dynamics, Proc Nad, Acad USA 84 (1984) 2097-2100 [3] Fermentas, GeneJET™ PCR Cloning procedure, 2006 [4] J Sambrook, D.w Russell, Molecular clo Third Edition, Volume 1, Cold Spring Hi Laboratory, Cold Spring Harbor, New 2001 We thank to the VNU-Hanoi for funding the project QG-07-12, to all staff members of the Biomedical and Applied Technology Laboratories, Hanoi University of Science [5] TAIR Homepage, www.arabidopsis.org [6] R Lathe, J.L Vilotte, A.J Clark, Plasmic bacteriophage vectors for excision of Í inserts, Gene 57 (1987)193-201 Nghiên cứu thiết kế thang chuẩn ADN chất lượng cao Lê Hùng, Phạm Thị Thanh Loan, Phạm Anh Thuỳ Dương, Võ Thị Thương La Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nari Thang chuẩn ADN sản phẩm sử dụng rộng rãi hầu hết phịng thí nghiệm ( nghệ sinh học Việt Nam Các sản phẩm thường nhập từ nước với giả thành chât lượng cỏ thê bị ảnh h ng trình vận chuyên lâu dài Đ ê p h ụ c vụ ch o n h u cầu sử ( thang chuẩn ADN phịng thí nghiệm, chúng tơi thực đề tài thiết kế thang chuẩn A Dựa trình tự genom e Arabidopsis thaliuna th iết kế hai cặp m ồi để khuếch đạ trinh tự lO kích thước 1.0Kb, 1.5Kb 2.0Kb Các đoạn sau chèn vào vectơ pJEl b itn nạp \ a o chùng vi khuẩn E coli D H 5ư Các ỉnh tự đư ợ c cắt khỏi v ectơ b àn g cách sử ị enzyme giơi hạn Bên cạnh chúng toi thiêt kế số băng ừong thang chuẩn dựa pla co *ẵn t ác hăng phổi trộn với tạo thang chuẩn ADN Tư khoà thang chuẩn ADN vectơ A D N tái tổ hợp VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY, HANOI JO U R N AL OF SCIENCE NATURAL SCIENCES AND TECHNOLOGY Vol 24, No 2S, 2008 CONTENTS Nguyen Anh Due, Tran Van Thuy, Bui Lien Phuong, The biodiversity of plants on aquatic ecosystem of Day and Nhue riverside in Ha Nam province 237 Le Thu Ha, Le Thi Bich Ngoc, Water quality and biodiversity of phytoplankton, zooplankton and macroinvertebrates of the main river Ngu Huyen Khe passes through Duong o trade village, Phong Khe commune, Bac Ninh province 242 N guyen X u a n H u a n , N g u y e n T h an h N am , T rin h T hi H oa, The orientation o f planning for aquaculture development in Bach Dang estuary, Yen Hung district, Quang Ninh province 247 Luu L a n H u o n g , N g u y en T h i T h an h N ga, N go Q u an g D u, B ui T hi H oa, Do Kim Anh, Modelling the distribution and effects of lead (Pb) in the West Lake ecosystem (Hanoi) 253 N gu yen Q u a n g H u y , N g u y en X u an Q u yn h , N go X u an N am , N gu yen T h B inh, H o a n g Q u o c K h a n h , N g u y en T h an h Son, D ata on the zo o p lan k to n fauna of the Day and Nhue rivers (the length in Ha Nam province) 258 Le Vu Khoi, Hoang Trung Thanh, Diversity of Bats (Chiroptera) in the protected areas in Northwestern Vietnam 263 D oan H u o n g M a i, N g u y e n X u an H u an , N gu yen T h u y D u on g, B ui T h i H oa, Establishing the status map of ecosystems in Thai Thuy district, Thai Binh province N gu yen H uu N han, Bui Thi Phong L an , N g u y en T h i V iet H a, Som e characteristics of population changes in five coastal communes of Tien Lang district, Hai Phong province from 2000 to present N gu yen V an Q uang, D ang Thi N h am , N g u y en Tung C u on g, 268 273 Species composition and distribution of termite (Isoptera) in Xuan Son National Park, Phu Tho province 278 N g u y en X u a n Q u y n h , N go X u an N am , N gu yen X uan H u an, K ieu H uu A nh , T ran V a n T h u y N g u y en A n h D ue, M T hi D am L in h , H oan g Q u oc K h an h, N g u y en T h a i B in h , N g u y e n T h an h Son, N gu yen Q u a n g H u y N gu yen T h u y Lien Pham D u e Ngoc, The biodiversity status of the Day and Nhue Rivers (The length in Ha Nam province) Nguyen Thi Kim Thanh, Nguyen Nghia Thin, Mallotus cordatifolius a p e lta var k w a n g s ie n s is , new records o f euphorbiaceae for Vietnam M a llo tu s -793 N g u y en T r u n g T h a n h , N g u y en N g h ia T h in , D inh T ran T an, M edicinal plant diversity at Cham Chu Nature Reserve, TuyenQuang province and Vu N g o c T h a n h , N g u y e n X u a n D a n g , N gu yen ?98 M a n h H a, L uu T u on g B ach, Nguyen Thi Hien, Survey and assessment of the Cao Vit Gibbon population (in Phong Nam - Ngoc Khe proposed nature reserve, Trung Khanh district, Cao Bang province) 3 [4 T ran V a n T h u y , N g u y e n A n h D u e , P h am T h u y L in h , Structure of primary dense evergreen tropical monsoon sub-montane broad - leaved forest at Tam Dao N ational Park 15 Nguyen Van Vinh, Bae Yeon Jae, The genus Ephacerella (Ephemeroptera: Ephemerellidae) in Vietnam \ Ỉ6 Dao Van Anh, Pham Anh Thuy Duong, Vo Thi Thuong Lan, Improving the m e th o d fo r d e te c tin g cyp21 gene m u t a t io n s in th e p a tie n ts w it h c o n g e n ita l hyperplasia syndrome 320 17 Nguyen Thi Lan Anh, Barth Wright, Chemical and Mechanical properties of foods in g e ste d b y th e T o n k in sn u b -n o sed m onkey (R hinopithecus avunculus) in Khau Ca, Ha Giang province 325 18 Nguyen Quang Chung, Nguyen Thi Thuy, Trinh Hong Thai, Incidence of factor VIII inhibitor development in hemophilia A patients treated with products containing FVIII 331 19 Trinh Dinh Dat, Tran Thi Thuy Anh, Nguyen Thi Thu, Nguyen Van Sang, H oang T h i H o a, Using R A P D -P C R to evaluate genetic polymorphism o f P lu te lla xylostella L., spodoptera litura Fabr and Pieris rapae L in three vegetable areas J I T ^ uiOuiiu i i a i i u i 20 ' T r a n C a o D u o n g , S o m e m ech an ism s o f h y p o g ly cem ia effect from earthw orm ex tract P h eretw n i aspergillum an d its am ino acid co m p o sitio n 342 Bui Thi Viet Ha, Do Thu Huong, Pham Thanh Hien, Study on ^ vth chitinase activity of two Bacillus strains isolated from soil samples ot lien mangrove area (Thai Binh province) and Hal -4 22 Le Hung, Pham Thi Thanh Loan, Pham Anh Thuy Duong, Vo Thi Thuong Lan, Study on development of new quality DNA ladders 35* 21 ■3 Nguyen Quang Huy, Akihito Tsuchiya, Isolation and prcmlinar} cha a' jri/dti>>n o f c o ld -a d a p te d B a cillu s strain s from cow m anure wa.>tt !4 Vo T h i T h u o n g L a n , D in h Ba T u a n , T a B ich T h uan F'rotc, extract to ultraviolet (ƯV) irradiation aU ivn 25 M D am L in h , N gu yen T h i G ia n g , Bui P h u o n g T h u a n , K ieu H uu Anh, Isolation and id en tificatio n o f co n tam in ated Salm onella in foods 26 Dinh Doan L ong, N gh iem Thi P h u on g Le, N gu yen T hi H on g V an , H oang Thi H oa, Single nucleotide polymorphism in |i-opioid and histamine H2 receptor genes within Vietnamese population 27 Phan T uan N gh ia, K h u at T h i N ga, N guyen T h i H o n g L o a n , N g u y en T hi Van A nh, K hong T h i M inh H u e, T rin h Q uynh M ai, V u P h u o n g L y, D o Q uynh Chi, Trieu Mai Chi, Multiplex (RT-)PCR assay for detection of co-infection of HBV, HCV and HIV in blood samples 28 B ui P h u o n g T h u a n , P h a m T h i H u o n g , S alm o n ella an d S h ig ella ty p in g b y lectins 29 Ta Bich T h u an , N gu yen T h u y T ran g, T rinh X u an H a u , V o T hi T h u o n g Lan, E valuation o f an ti-in flam m ation and an ti-o x id atio n o f the e x a c t from Ganoderma lucidum (L eyss ex fr) kart 30 P a e k K ee Y o e u p , Nguyen T r u n g T h a n h , R ole o f m ed iu m c o m p o sitio n s supply on c e l l g r o w t h a n d s a p o n in p r o d u c t io n d u r in g c e l l s u s p e n s i o n ginseng ( Panax ginseng C A M eyer) c u l t u r e o f m o u n ta in ĐỂ CƯƠNG ĐỂ TÀI KHOA HỌC CƠNG NGHỆ ĐẶC BIỆT * • • CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI M ã SỐ đề tài: QG 07.12 Chủ trì đề tài: TS Võ Thị Thương Lan Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội ĐỂ CƯƠNG ĐỂ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐẶC BIỆT CẤP ĐẠI HỌC QUồC GIA HÀ N ộ i Tên đề tài: Nghiên cứu sản xuất thang chuẩn ADN chất lượng cao Tiếng Anh: Stưdy on production of quality DNA Ladders Thời gian thực hiện: 24 tháng Bắt đầu từ tháng năm 2007 đến tháng năm 2009 Đề tài thuộc lĩnh vực ưu tiên: Công nghệ Sinh học Đ ề tà i có tr ù n g với m ộ t đề tài đ ã hoăc tiến hành k h ôn g ? Nghiên cứu sản xuất thang chuẩn ADN kích thước 100 bp 200 bp đề cập đến đề tài KC-04-26 Vì vậy, đề cương đăng ký chúng tòi xây dựng thang chuẩn 500 bp không trùng với đề tài tiến hành Chủ trì đề tài (kèm theo Lý lịch khoa học theo biểu mẫu 02/KHCN/ĐHQGHN) - Họ tên: VÕ THỊ THƯƠNG LAN - Năm sinh: 14 -07 -1961 Nữ - Chuyên môn đào tạo: Sinh học phân tử - Học hàm, học vị: Tiến sĩ - Chức vụ: Trưởng phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Đại học KHTN, Đại học QGHN - Đơn vị công tác: Khoa Sinh học, Đại học KHTN, Đại học QGHN - Địa liên hệ: Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhien, 334, Nguyễn Trãi, Đống Đa, Hà Nội - Điện thoại: 2134496/ 0988551068 E-mail: thuonglan 1961 @vahoo.com; lanvtt(5)vnu.edu.vn Thời gian 20062008 Tên đề tài!cơng trình Thử nghiệm bất hoạt gen theo chế ARNi Tư cách tham gia Cấp quản lỷỉnơi cơng bí Chù trì Đề tài NCCB Chủ trì Đề tài đặc biột ĐHQG, QG 03-13 Chủ trì Đề tài NCCB Chủ trl Đề tài KHTN, p h ụ c v ụ c h u y ể n g e n t o g i ố n g c â y tr n g c ó tín h chống chịu vi sinh vật gãy bệnh 2004 0 Á p d ụ n g k ỹ th u ậ t di tru y ền phân tử phát hiên m ọ t sô đ ộ t b iẽn liê n q u an đ ến bênh di truyền người 0 - 0 2 0 Phát đột biến gen CYP21 liên quan đ ế n b ệ n h tăn g sản thư ợng thận bẩm sinh B ước đ ầu n g h iê n u tín h đa dang di truyền số loài rong câu Gracilarỉa 1999 Áp dụng phương pháp tách chiết ADN từ TN 2000-14 Chủ trì Để tài KHTN, m âu sin h p h ẩ m k h ác dùng cho kỹ thuât TN 99-18 PCR - 19981999 Phân tích tính đa dạng di truyền số lồi rong biển Việt Nam thị phân tử ADN thuộc đề tài nhà nước Chủ trì đề tài nhánh C hương trình Biển Đơng 2003 Nghiên cứu cơng nghệ sản xuất protein tái tổ hợp, protein bất hoạt ribosome có giá trị sử dụng dược nơng nghiệp Tham gia KC 04-14 0 Hải đảo Viện CNSH chù quản Một số cơng trình công bố liên quan đến phương hướng đề tài: Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Phượng, Võ Thị Thương Lan (2005) Một số đột biến gen C Y P Ỉ liê n q u a n k iểu gen kiểu h ìn h củ a b ệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh Hội nghị khoa học toàn quốc 2005: 8-12 Sakamoto A„ Lan Vo T.T., Hase Y., Shikazono N., Matsunaga T., Tanaka A (2003) Disruption of the AtREV3 gene causes hypersensitivity to Ultraviolet B light and Gamma Rays in Arabidopsis: Implication of the presence of a translesion synthesis mechanism in plants Plant Cell, 15: 2042-2057 (2003) Sừ dụng phưcmg phập đa hình ADN (PCR-RFLP) vùng intron 18 để xác định cá thể mang gen bệnh mậu khó đơng hemophilia A Hội nghị Cõng nghệ Sinh học toàn quốc Hà Nội 12/2003 Nhà X u ất Khoa học Ky thuật: 1025-1027 Võ Thị Thương Lan, Dương Vãn Hợp, Nguyễn Hoài Hà, Phạm Thị Trân Châu, K im (2 0 ) P h a t h iện VI sinh vật có độc tổ thực phẩm kỹ thuât PCR D truyền ứng đụng (tập san CNSH): 17-21 Vo Thi Thương Lan, Phạm Thị Trân Châu (2001) Phân lập gen mã cho protein ức chế tripsine (TI-IV) từ Cucurbitaceae Di truyền ứng dụng (tập san CNSH): 32-36 Vo thi Thương Lan (2000) Sử dụng Agrobacterium rhizogenes làm vector chuyển gen đ ậu bị Vigna unguiculata Tạp chí Khoa học, ĐHQG, 1: 33-37 Vọ Thị Thương Lan, A Krause (2000) Hoạt hoá gen mã cho chalcone synthase rhizobia Nod factor rễ đậu Tạp chí Sinh học :3 -9 Võ Thị Thương Lan, Broughton W.J (1998) Kìm hãm hoạt động gen mã cho protein PR4.2 vi khuẩn rhizobia Nod factor rễ cày đậu Tạp chí Di truyền ứng dụng, : 35-99 Tóm tát hoạt động đào tạo sau đại học chủ trì đề tài năm trở lại Thời gian Tên nghiên cứu sinh Tên học viên cao học Thái Thiên Nam 0 -2 0 2003-2007 Trần Kiêm Hảo Cơ quan phối họp cộng tác viên c h ín h đề tài (ghi rõ đơn vị cá nhân m ời nhận lời m ời tham gia đê tài M ỗi cá nhân tham gia dê tài phải có lý lịch khoa học theo biểu m ẩu 02/KHCN/ĐHQGHN, ý kiến xác nhận đồng ỷ tham gia thực đ ề tài) TT Cộng tác viên Cơ quan phối hợp Họ tên Khoa Sinh học, ĐHKHTN Trung tâm Cơng nghệ Sinh học, ĐHQGHN Chun ngành ThS Tạ Bích Thuận Vi sinh TS Nguyễn Lai Thành Tế bào ThS Mai Đàm Linh Vi sinh CN Phạm Anh Thuỳ Dương Sinh hoá TS Nguyễn Quỳnh Uyển Vi sinh phân tử Tổng qụan cac cơng trình nghiên cứu ngồi nước liên quan đến vấn đề nghiên cứu cua dê tài {trích dãn tài liệu nước) Cac thang chuân ADN sư dụng giới sản phẩm thương mại đo công ty ng san x ụ ât va c u n g cãp (6-7) V ì vậy, nghiên cứu qui trình sản xuất đãng y an q u y ên , k h ô n g c ô n g bố rộng rãi trẽn tạp ch í khoa học T uy nhiên, nhu cầu sừ d ụ n g n A •L u chuân ADN rãt lớn hầu hết nghiên cứu ứng dụng cùa sinh học phân tử ^ia tha"g chuẩn ADN 500 bp (Fermentas) vào khoảng 500 USD ° ’ Vl^ C' c^ \ m u a t h a n g c h u â n từ n c n g o i k h ô n g tạ o c h ộ i t iế p c ậ n v i c c k ỹ th u ậ t sin I uọc phan tư San xuât thang chuân ADN 100 200 bp đề cập đến đề tài KC 04-26 (1) Tuy nhiên, thang chuẩn thiết ke dựa vào phối hợp kỵ thuật tách dịng với phối trộn trực tiếp sản phẩm PCR có các'kích thước khác VI vậy, đọ đong đêu cac băng hạn chế định Một hướng khắc phục nhược điêm la tách dòng sản phâm PCR Kỹ thuật áp dung phổ biến nước ta (2-5) - Lý chọn đề tài: Đề tài có tính thời cao, đặt nhũng bước đẩu tiên cho q trình ứng dụng cơng nghệ sản xuất thang chuẩn ADN chất lượng cao Đề tài thực nhằm đáp ứng nhu cầu thang chuẩn ADN cơng tác xét nghiệm chẩn đốn kiểm định kỹ thuật đại y tế, dịch tễ, chăn nuôi, nông lâm nghiệp, thủy sản, xuất nhập Địa bàn tiến hành nghiên cứu (xã, huyện, tỉnh, vùng) Mục tiêu đề tài: Xây dựng qui trình thiết kế thang chuẩn ADN có chất lượng cao kỹ thuật ADN tái tổ hợp nhằm mở triển vọng sản xuất thang chuẩn cung cấp cho nghiên cứu sinh học phân tử xét nghiệm chẩn đốn hiộn đại 10 Tóm tắt nội dung nghiên cứu đề tài: - Xây dựng qui trình thiết kế thang chuẩn ADN 500 bp (7-8 băng) gồm băng từ 500 bp đến 5000 bp - Thiết kế băng thang chuẩn ADN 500 bp có kích thước tương đương băng thang chuẩn ADN thương mại số hãng nước (Promega, Fermentas ) sản xuất, dùng phổ biến nước _ 11 C c c h u y ê n đ ề n g h iê n c ứ u d ự k iế n c ủ a đ ề tà i (tên nội dung chuyên đê) - Thu thập liệu cần thiết: Thu thập vector, dịng ADN sẵn có số phịng thí nghiệm nước nhằm có thơng tin xác đu vê trinh tự nucleotide va kích thước Dựa vào để tìm vị trí cho cập mồi đặc hiệu với băng chuẩn ADN có kích thước khác - Thiết kế căp mồi: Thiết kế cặp mồi có chứa vị trí nhận biêt cua enzym giơi hạn Sư dung chúng phản ứng PCR đê nhân bsn C8 Cđoạn ADN co kích thươc khac - Tách dòng: Đưa đoạn ADN vào vector tạo phân tử ADN tái tổ hợp - Biến nạp tạo đơn dòng -Tách chiết, tinh sạch, cắt vói enzym giới hạn, thu băng ADN - Phối trơn băng tìm tỷ lộ thích hợp đảm bảo độ băng Cấu trúc dự kiến báo cáo kết đề tài (chi tiết hoá chương mục) _ Thu nhận dòng mang phân tử ADN tái tổ hợp có kích thước khác _ Thu nhận dịng biến nạp chứa phân tử ADN tái tổ hợp _ Tách c h iế t, tinh ADN (phenol, ethanol ) phối trộn (tá c h d ò n p c ^ u Ỵê ” n n h : v i s i n h ( n u ô i c ấ y c c đ ò n g t ế b o b iế n n a p ) , d i t r u y ề n euzym) ệ ADN ( ■ tò ADN tai tổ hợp, PCR cắt nối với 14 Phương pháp luận phưcmg pháp khoa học sử dụng đề tài: sừ í nf r? r.ộng rãl'ronS kỹ thuạt sinh học phân từ nhằm xác QuarHrone ± ? T * ì ý ị Xd? f à ? ỉA D N B sản phẩm t h Z g mai bố ton cM k S a h o c ^ ê n a ĩ 'S ^ ỉikinh hnghÌệT x/ y dựng thang chuẩn íl dư