Chiết xuất, phân lập Stipuleanosid R2 từ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu

,V NU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI dP rm BÙI THỊ THANH VÂN ac y KHOA Y DƯỢC of M ed ic ine an CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP STIPULEANOSID R2 TỪ SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) LÀM NGUYÊN LIỆU XÂY DỰNG CHẤT CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU Co py rig ht @ Sc ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2019 KHOA Y DƯỢC dP rm ac y Người thực hiện: Bùi Thị Thanh Vân ,V NU ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ed ic ine an CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP STIPULEANOSID R2 TỪ SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidus Seem.) LÀM NGUYÊN LIỆU XÂY DỰNG CHẤT CHUẨN CHO DƯỢC LIỆU M KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Co py rig ht @ Sc ho ol of (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa : QH.2014.Y Người hướng dẫn: TS NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội - 2019 ,V NU LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình nghiên cứu hồn thiện khóa luận này, bên cạnh tơi ln có giúp đỡ vơ quý giá đến từ thầy cô giáo Khoa Y Dược – Đại ac y học Quốc gia Hà Nội với bạn bè gia đình thân yêu tơi Thời điểm hồn thành khóa luận lúc dành lời tri ân chân thành đến rm người dạy, dìu dắt giúp đỡ suốt thời gian qua Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn – TS Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - thầy dành dP nhiều thời gian hướng dẫn, dạy dỗ giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tôi xin cảm chị Đặng Thị Ngần – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội nhiệt tình dạy, đóng góp ý kiến để khóa luận tơi hồn thiện of M ed ic ine an Tôi xin gửi lời cảm ơn tới chị Nguyễn Thị Thu Thủy anh Nguyễn Hoàng Việt – Đại học Dược Hà Nội; PGS.TS Dương Thị Ly Hương – Khoa Y Dược Đại học Quốc gia Hà Nội chủ nhiệm đề tài Tây Bắc giúp tơi có kết để tiếp bước thực nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, thầy cô Khoa Y Dược, đặc biệt mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc tạo điều kiện cho tơi thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể Dược học khóa QH.2014.Y, đặc biệt bạn Hà, Hoa, Nhung, Thảo đồng hành suốt thời gian nghiên cứu Cuối cùng, xin dành lời tri ân sâu sắc tới gia đình thân u tơi, Co py rig ht @ Sc ho ol nuôi nấng tạo động lực để tơi có kết ngày hơm Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2019 Sinh viên Bùi Thị Thanh Vân MỤC LỤC ,V NU LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ ac y ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN rm 1.1 CHẤT CHUẨN, CHẤT ĐỐI CHIẾU 1.1.1 Khái niệm dP 1.1.2 Ứng dụng 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Sự cần thiết việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu an 1.1.5 Phương pháp thiết lập chất chuẩn ine 1.2 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố ed ic 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng dược lý 1.1.4 Công dụng M 1.2 TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 of 1.2.1 Cơng thức hóa học đặc điểm 1.2.2 Tác dụng sinh học 10 ol 1.2.3 Các nghiên cứu stipuleanosid R2 10 Sc ho CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 11 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 11 @ 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 11 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 12 ht 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12 py rig 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.3.1 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập tinh chế, xác định cấu trúc hóa học stipuleanosid R2 13 Co 2.3.2 Xây dựng liệu nhận dạng chất 14 ,V NU 2.3.3 Phương pháp định tính, định lượng stipuleanosid R2 SVD HPLC 14 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 16 3.1 Chiết xuất, phân lập tinh chế Stipuleanosid R2 Sâm vũ diệp 16 ac y 3.1.1 Chiết xuất 16 3.1.2 Phân lập 17 rm 3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết stipuleanosid R2 phân lập SKLM 18 3.2 Xây dựng liệu nhận dạng stipuleanosid R2 19 dP 3.2.1 Đặc điểm cảm quan 19 3.2.2 Điểm chảy 19 3.2.3 Kết đo phổ 19 an 3.3 Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế HPLC 22 3.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 22 ine 3.3.2 Nhận dạng pic sắc ký đồ stipuleanosid R2 phân lập 23 ed ic 3.3.3 Định lượng stipuleanosid R2 phân lập 24 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 29 4.1 Về chiết xuất, phân lập tinh chế 29 M 4.2 Bước đầu xây dựng liệu nhận dạng 30 of 4.3 Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập HPLC30 4.3.1 Xây dựng phương pháp 30 ol 4.3.2 Phân tích định tính định lượng stipuleanosid R2 phân lập 30 Sc ho KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Co py rig ht @ PHỤ LỤC CCĐC Chất chuẩn đối chiếu EtOH Ethanol GC Sắc ký khí HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao MeOH Methanol MS Khối phổ NRM Phổ cổng hưởng từ proton LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng RDS Độ lệch chuẩn tương đối SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng SVD Sâm vũ diệp UV Tử ngoại dP an ine ed ic M of ol Sc ho @ ht ac y n-Butanol rm BuOH py rig Co ,V NU DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ,V NU DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU So sánh loại chất chuẩn Bảng 3.1 Hàm lượng cắn phân đoạn chiết xuất từ Sâm vũ diệp 17 Bảng 3.2 Kết đo điểm chảy stipuleanosid R2 20 Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H 13C-NMR, DEPT stipuleanosid R2 21 Bảng 3.4 Chương trình dung mơi 25 Bảng 3.5 Sự phù hợp hệ thống xác định độ tinh khiết Bảng 3.6 Kết định lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn dP an ine ed ic M of ol Sc ho @ ht py rig Co rm ac y Bảng 26 28 Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Hình 1.2 Các hợp chất tách từ rễ sâm vũ diệp ac y Hình 1.3 Cấu trúc hóa học stipuleanosid R2 ,V NU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Cai Hình 3.1 Quy trình chiết xuất stipuleanosid R2 rm Hình 2.1 Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Sa Pa, Lào 11 dP Hình 3.2 Sơ đồ phân lập stipuleanosid R2 từ phân đoạn n-butanol 18 19 Hình 3.3 Sắc ký đồ stipuleanosid R2 phân lập sau phun TT H2SO4 20 10% /EtOH an Hình 3.4 Cấu trúc hóa học stipuleanosid R2 24 ine Hình 3.5 SKĐ HPLC stipuleanosid R2 phân lập (A), cao BuOH (B) 26 chất chuẩn đối chiếu (C) Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic Hình 3.6 Sắc ký đồ xác định độ tinh khiết stipuleanosid R2 27 ĐẶT VẤN ĐỀ ,V NU Đất nước Việt Nam ta tự hào thiên nhiên ưu đãi, tạo hóa ban cho nguồn dược liệu “giàu có” so với nước khu vực giới Thống kê Viện Dược liệu cho thấy, nước ghi nhận 5.117 loài thực ac y vật nấm, 408 lồi động vật 75 loại khống có cơng dụng làm thuốc, có nhiều lồi dược liệu quý hiếm, đặc hữu như: sâm vũ diệp, sâm ngọc linh, ba dP rm kích, ngân đằng, thơng đỏ… Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm – Araliaceae) dược liệu quý, phân bố Trung Quốc dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc nước ta Về mặt y học, sâm vũ diệp sử dụng làm thuốc bổ thành phần số thuốc truyền thống dân tộc vùng núi Tây Bắc có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ Theo tài liệu Sc ho ol of M ed ic ine an công bố sâm vũ diệp cho thấy saponin thành phần hoạt chất mang lại tác dụng dược lý giá trị sử dụng dược liệu quý y học, đặc biệt nói đến stipuleanosid R2 – saponin quan trọng có sâm vũ diệp Để nâng cao chất lượng nghiên cứu stipuleanosid R2 nói riêng hợp chất nói chung, việc kiểm tra, kiểm sốt chất lượng dược liệu vơ quan trọng Song thực tế nước ta cịn gặp khó khăn việc phân tích, kiểm nghiệm thiếu chất chuẩn cần thiết Phần lớn chất chuẩn sử dụng phải nhập từ nước với giá cao thời gian đặt hàng kéo dài Nhằm khắc phục nhược điểm này, với mục tiêu phát triển tiềm vị dược liệu quý sâm vũ diệp, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Chiết xuất, phân lập stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu” Mục tiêu đề tài: py rig ht @ Chiết xuất, phân lập tinh chế stipuleanosid R2 có độ tinh khiết 95% từ dược liệu sâm vũ diệp Bước đầu xây dựng liệu nhận dạng stipuleanosid R2: nhiệt độ nóng chảy, liệu phổ Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập Kết đề tài góp phần xây dựng sở liệu thành phần hóa học, Co xây dựng tiêu chuẩn dược liệu sâm vũ diệp làm sở cho nghiên cứu hoạt tính sinh học stipuleanosid R2, tảng cho việc phát triển sâm vũ diệp điều trị CHƯƠNG - TỔNG QUAN ,V NU 1.1 CHẤT CHUẨN, CHẤT ĐỐI CHIẾU 1.1.1 Khái niệm Chất chuẩn (standard subtances) hay chất chuẩn đối chiếu (reference ac y standards) chất cần thiết để đánh giá nguyên liệu, bán thành phẩm, thành phẩm… theo quy trình xác định nhằm đảm bảo kết phân tích đạt độ xác, đáng tin cậy [28] rm Chất chuẩn đối chiếu phần quan trọng đo lường thiết lập tính khả thi so sánh (comparability) truy nguyên (traceability)[6] dP Theo dược điển Việt Nam V: Chất đối chiếu chất đồng xác định để dùng phép thử quy định hóa học, vật lý sinh học Trong phép thử tính chất chất đối chiếu so sánh với of standards) [19] M ed ic ine an tính chất chất thử Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng [3] Theo định nghĩa FDA: “Chất chuẩn đối chiếu (reference standards) lô hay mẻ hợp chất làm thuốc điều chế đặc biệt cách tổng hợp độc lập cách tinh chế bổ sung nguyên liệu điều chế chứng minh loạt thử nghiệm phân tích sâu rộng để xác định nguyên liệu xác thực có độ tinh khiết tối đa, đạt cách hợp lý Nó thường dùng cho việc phân giải cấu trúc chất làm chuẩn cho chất chuẩn làm việc (working Co py rig ht @ Sc ho ol 1.1.2 Ứng dụng Chất đối chiếu dùng phép thử sau: - Định tính phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại - Định lượng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến, quang phổ huỳnh quang - Các phép thử định tính định lượng phương pháp sắc ký - Định lượng phương pháp vi sinh vật - Các phép chuẩn độ đo thể tích, phân tích khối lượng - Các phép thử sinh học - Một số phép thử khác có hướng dẫn chuyên luận riêng [3] Ngồi chất đối chiếu cịn dùng để: - Thẩm định phương pháp - Chuẩn hóa chất đối chiếu khác phương pháp định lượng hợp chất saponin HPLC [26], tiến hành ,V NU khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích sau: - Máy sắc ký lỏng hiệu cao Agilent 1260 Infinity - Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt 3,5μm) Detector DAD phát bước sóng 203nm Tốc độ dịng: 0,8mL/phút - Thể thích bơm mẫu: 20µl Nhiệt độ: 25oC Dung mơi pha mẫu: Methanol - Pha động: Acetonitril (kênh A) : 0,5% acid acetic/H2O (kênh B) với chương trình gradient bảng 3.4 dP rm ac y - Bảng 3.4 Chương trình dung mơi Acetonitril (%) 0-5 20 ine an Thời gian (phút) Acid acetic 0,5% (%) 80 20→40 80→60 15-20 40 60 40→100 60→0 100 100→20 0→80 20 80 ed ic 25-15 20-30 M 30-35 40-45 of 35-40 ol 3.3.2 Nhận dạng pic sắc ký đồ stipuleanosid R2 phân lập py rig ht @ Sc ho Pha mẫu stipuleanosid R2 phân lập được: dùng cân phân tích cân xác khoảng 1,0 mg chất pha thành dung dịch tương ứng với nồng độ 1000 µg/mL methanol, sau siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm Pha mẫu thử: dùng cân phân tích cân xác khoảng 100,0 mg cao nbutanol thân rễ SVD hòa tan methanol với nồng độ 100,0 mg/mL, siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết lọc qua màng lọc 0,45 µm Pha mẫu chất chuẩn liên kết stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân xác khoảng 1,0 mg stipuleanosid R2 hòa tan methanol với nồng độ 400,0 µg/mL, siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm Co Tiến hành sắc ký HPLC hợp chất phân lập cao butanol so sánh với SKĐ thu mẫu chất chuẩn 23 ,V NU ac y rm dP an ine ed ic Hình 3.5 SKĐ HPLC stipuleanosid R2 phân lập (A), cao BuOH (B)và of M chất chuẩn đối chiếu (C) Nhận xét: Kết phân tích HPLC minh họa cho thấy stipuleanosid R2 hợp chất thiên nhiên có SVD với thơng số thời gian lưu dung dịch cao butanol Sc ho ol chuẩn bị thời điểm chạy sắc ký với điều kiện chiết xuất chuẩn thường quy 15,565 15.564 phút, giá trị tương đương với thời gian lưu chất chuẩn 15.565 phút 3.3.3 Định lượng stipuleanosid R2 phân lập py rig ht @ u cầu: Hàm lượng khơng thấp 95,0% tính theo nguyên trạng Tiến hành: Pha mẫu hợp chất stipuleanosid R2 phân lập được: dùng cân phân tích cân xác mẫu, mẫu khoảng 10 mg chất phân lập vào bình định mức 20 mL, hịa tan Co pha lỗng vừa đủ MeOH, sau siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm Pha mẫu dung dịch đối chiếu stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân xác khoảng 10 mg chuẩn stipuleanosid R2 vào bình định mức 20 mL, hịa tan pha 24 loãng vừa đủ MeOH, siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết lọc qua màng ,V NU lọc 0,45 µm Tiến hành chạy HPLC với điều kiện sắc ký nêu mục 3.3.1 Thu kết sắc ký trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết định lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Hàm lượng (%) ac y Diện tích pic (mAU*s) Khối lượng (mg) Pic Tổng pic 9,45 1353,027 1411,314 95,87 10,17 1428,131 1483,772 96,25 9,34 1249,639 1299,271 96,18 9,61 1397,682 1444,782 96,74 10,28 1442,078 1499,042 96,20 10,74 1482,191 1542,503 96,09 an rm dP Mẫu thử ine Hàm lượng trung bình (%) ed ic RSD (%) 96,22  0,11 0,26 Co py rig ht @ Sc ho ol of M Nhận xét: Các mẫu thử có hàm lượng lớn 95,0% (tính theo nguyên trạng), theo lý thuyết đạt yêu cầu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu, nhiên chưa thể kết luận cách chắn, cần phải tiến hành thêm phương pháp đặc hiệu xác 25 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ,V NU 4.1 Về chiết xuất, phân lập tinh chế 4.1.1 Chiết xuất Với quy trình chiết xuất dược liệu SVD phương pháp chiết siêu âm sử o ac y dụng dung môi ethanol 70 , cất quay thu cắn tồn phần, phương pháp chiết siêu âm có ưu điểm làm tăng tốc độ chiết, giảm nhiệt độ áp suất chiết Từ cao chiết rm toàn phần phân đoạn phương pháp chiết lỏng - lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần: ether, ethyl acetat n-butanol thu cắn phân dP đoạn với khối lượng ether (1,26 %), EtOAc (0,59 %), BuOH (4,71%) so với nguyên liệu khô ban đầu Hợp chất stipuleanosid R2 chất saponin phân cực, việc chiết lỏng – lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần nhằm ine an mục đích loại bỏ thành phần không phân cực phân cực tan dung môi ether ethyl acetat, chuẩn bị cho bước phân lập tiến hành nhanh xác ed ic 4.1.2 Phân lập tinh chế Phân đoạn n-butanol thu với hàm lượng cao sử dụng để tiến hành phân lập stipuleanosid R2 sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 – MeOH theo gradient nồng độ Kết hợp với SKLM để đánh giá Co py rig ht @ Sc ho ol of M phân đoạn thu được, cho thấy phân đoạn B4 cho sắc ký đồ mỏng có vết màu hồng tím rõ nét phù hợp so với đặc tính hợp chất cần phân lập Sau chúng tơi tiến hành sắc ký cột pha đảo để tinh chế stipuleanosid R2 dược liệu SVD thu 180 mg bột màu trắng Kiểm tra độ tinh khiết chất tinh chế phương pháp SKLM cho thấy cắn tinh chế vết màu hồng sau chuyển sang màu tím, đặc trưng dẫn xuất triterpen Kết góp phần đánh giá stipuleanosid R2 tinh chế có độ tinh khiết cao, ứng dụng phương pháp việc phân lập hợp chất stipuleanosid R2 SVD dược liệu khác chứa thành phần Như trình bày phần tổng quan, stipuleanosid R2 có nhiều tác dụng dược lý có ý nghĩa lâm sàng, sử dụng để điều trị nhiều bệnh có tác dụng gây độc số dòng tế bào ung thư Hiện tác dụng stipuleanosid R2 chưa dùng nhiều lâm sàng tương lai stipuleanosid R2 nghiên cứu sử dụng rộng rãi người phâp lập tinh chế stipuleanosid R2 cần thiết phục vụ cho việc nghiên cứu tác dụng sinh học 29 quy trình chiết xuất, phân lập tinh chế mà đưa ,V NU ứng dụng 4.2 Bước đầu xây dựng liệu nhận dạng Việc xác minh lại cấu trúc stipuleanosid R2 tinh chế dược ac y liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) phân tích khối phổ (ESI-MS) rm khẳng định công thức phân tử cấu trúc stipuleanosid R2 tinh chế phù hợp với lý thuyết Đồng thời kết nhiệt độ nóng chảy đo chất phân lập góp phần khẳng định sản phẩm tinh chế dP hợp chất stipuleanosid R2 4.3 Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập HPLC an 4.3.1 Xây dựng phương pháp ed ic ine Chúng thực xây dựng phương pháp HPLC với detector DAD để định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế Đề tài sử dụng phương pháp phân tích định lượng saponin HPLC phương pháp Dược điển nước công nhận đạt yêu cầu tính tiên tiến so với phương pháp quang phổ hay phương pháp khối lượng phần lớn chuyên luận dược liệu Đây phương pháp M có nhiều ưu điểm tiến hành đơn giản từ việc pha mẫu, chuẩn bị dung @ Sc ho ol of môi pha động đến tiến hành sắc ký Trong khoảng nồng độ khảo sát, diện tích pic nồng độ chất phân tích có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ Phương pháp cịn đảm bảo độ độ đặc hiệu cao Tham khảo số tài liệu kết hợp với điều kiện có sẵn, chúng tơi lựa chọn chương trình sắc ký mô tả mục 3.3.1 Với điều kiện sắc ký lựa chọn, chất nghiên cứu mẫu thử chuẩn bị từ dịch chiết n-butanol thân rễ SVD chất phân lập tách tương đối tốt, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý, phù hợp để định lượng thành phần thân rễ SVD Co py rig ht 4.3.2 Phân tích định tính định lượng stipuleanosid R2 tinh chế 4.3.2.1 Định tính Kết SKĐ chạy HPLC mẫu: stipuleanosid R2 phân lập được, cao BuOH chất chuẩn đối chiếu cho pic thời gian lưu khoảng phút thứ 15 Theo tài liệu nghiên cứu nay, khẳng định thời gian lưu hợp chất stipuleanosid R2 4.3.2.2 Định lượng 30 Bằng phương pháp HPLC với detector UV xây dựng để định tính, định ,V NU lượng stipuleanosid R2 xác định giới hạn tạp chất liên quan stipuleanosid R2 tinh chế được, xác định xác hàm lượng stipuleanosid R2 tinh chế 96,22  0,11 (%) > 95,0% (tính theo nguyên trạng), đạt yêu cầu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu rm ac y Stipuleanosid R2 tinh chế xây dựng thành chất đối chiếu sử dụng phân tích, xây dựng tiêu chuẩn Với mục đích xa thiết lập chất chuẩn phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dược liệu SVD, sau xác định độ tinh khiết SKLM HPLC saponin phân lập được, thời gian có hạn, chúng tơi dP dừng lại việc chiết xuất, phân lập tinh chế Việc thiết lập chất chuẩn stipuleanosid R2 cần đánh giá thêm vài tiêu khác theo tiêu chí Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an DĐVN Dược điển quốc tế 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ,V NU KẾT LUẬN Với kết thực nghiệm thu đề tài đạt mục tiêu đề là: rm chất tinh chế Định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập ac y Nghiên cứu chiết xuất, phân lập tinh chế Stipuleanosid R2 từ dược liệu sâm vũ diệp Bước đầu xác minh cấu trúc hóa học, xây dựng liệu nhận dạng dP Như vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cho hợp chất saponin từ thân rễ SVD – stipuleanosid R2 góp phần ý nghĩa vào sở liệu hóa thực vật tiêu chuẩn hóa dược liệu SVD làm sở định hướng cho nghiên cứu hoạt tính sinh học đối tượng tiềm thuộc chi Panax Và thêm vào ine an kết cịn có ý nghĩa thực tiễn cơng tác kiểm nghiệm thuốc nói chung kiểm nghiệm dược liệu nói riêng ed ic KIẾN NGHỊ Hướng nghiên cứu tiếp theo, xin phép kiến nghị: Nghiên cứu thiết lập tiêu chuẩn chất chuẩn stipuleanosid R2 để có tài liệu bổ M sung chất chuẩn đối chiếu vào Dược điển Việt Nam xuất lần thứ Co py rig ht @ Sc ho ol of Tiến hành nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu khác có nguồn gốc dược liệu phục vụ nhu cầu kiểm tra chất lượng dược liệu sản phẩm từ dược liệu 32 ,V NU TÀI LIỆU THAM KHẢO A TIẾNG VIỆT: [1] Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007) Thực vật học tập 1, NXB Y học, Hà Nội [2] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong ac y cộng (2003), Cây thuốc Động vật làm thuốc Việt Nam tập 2, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr 711 - 714 dP rm [3] Bộ y tế (2017), Dược điển Việt Nam V tập 2, Nhà xuất y học, tr PL-113, phụ lục [4] Bộ Y tế, Vụ khoa học đào tạo (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất Y học, tr 79-82, 84-110 [5] Nguyễn Thượng Dong, TS Trần Công Luận, TS Nguyễn Thị Thu Hương an ol py rig ht [11] Sc ho [10] @ [9] of M [8] ine [7] ed ic [6] (2007), Sâm Việt Nam số thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 263-266 GS.TS.Nguyễn Minh Đức (2013), Tổng quan chất chuẩn, Đại học Y dược TP.Hồ Chí Minh Đỗ Văn Hào (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học sâm vũ diệp thu hái Tây Bắc, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Thị Huệ (2017), Phân tích acid oleanolic saponin tổng số rễ sâm vũ diệp thu hái Sa Pa, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội Dương Thị Phượng (2018), Định lượng Stipuleanosid R2 thân rễ Sâm vũ diệp, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Lê Thị Tâm (2017), Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu phân đoạn dịch chiết sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T sai et K M Feng) in vitro, Khoá luận tốt nghiệp đại học, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn (2006), “Kết nghiên cứu phân bố, sinh thái Sâm Vũ Diệp Tam thất hoang Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 11(5), tr 177-180 Nguyễn Văn Tập (2005), “Các loài thuộc chi Panax L Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 10(3), tr 71-76 Ngơ Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học tập 1, NXB Y học – Bộ Y tế, tr 191-213 [12] Co [13] [14] Ngơ Vân Thu (1990), Hóa học Saponin, Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược ,V NU thành phố Hồ Chí Minh, tr 109-114 [15] Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ mơn hóa phân tích (2006), Hóa phân tích II, tr.17, 99-146, 173-222 ac y [16] Viện nghiên cứu thực vật Vân Nam (1975), “Triterpene thuộc chi nhân sâm mối liên quan đến hệ thống phân loại, phân bố địa lý”, Thực vật phân loại học báo cáo, 13(2), 29-44 rm B TIẾNG ANH [17] Agrawal PK (1992), "NMR spectroscopy in the structural elucidation of dP oligossacharides and glycosides", Phytochemistry, 31, pp 1307-1330 [18] Satinder Ahuja, Elsevier Publiccations (2003), Hand Book of Isolation and Characterization of Impurities In Pharmaceuticals, p.119 of M ed ic ine an [19] Center for Drug Evaluation and Research Food and Drug Administration Department of Health and Human Services (1987), Guideline for submitting supporting documentation in drug applications for the manufacture of drugs substances, p.29 [20] Choi K T (2008), "Botanical characteristics, pharmacological effects and medicinal components of Korean Panax ginseng CA Meyer", ActaPharmacologica Sinica, 29(9), 1109 – 1118 [21] Shao-Xing Dai, Wen-Xing Li et al (2016), "In silico identification of anticancer compounds and plants from traditional Chinese medicine database", Scientific Reports, 25462 Co py rig ht @ Sc ho ol [22] Y Fan, D Y Guo, Q Song, and T Li (2013), "Effect of total saponin of aralia taibaiensis on proliferation of leukemia cells", Zhong Yao Cai, 36(4), pp 604607 [23] Mahato S, Kundu A (1994), "13C NMR spectra of pentacyclic triterpenoids-a complication and some salient features", Phytochemistry, 37, pp 1517-1575 [24] H T Nguyen, H Q Tran, T T Nguyen, V M Chau, K A Bui, Q L Pham, et al (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus", Chem Pharm Bull (Tokyo), 59(11), pp 1417-1420 [25] C Liang, Y Ding, H T Nguyen, J A Kim, H J Boo, H K Kang, et al (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities", Bioorg Med Chem Lett, 20(23), pp 7110-7115 [26] Liu F et al (2008), Method Development for Gypenosides Fingerprint by High from root-bark of Aralia elata", ac y (1994), "Oleanolic acid saponins Phytochemistry, 36(1), pp 147-152 ,V NU Performance Liquid Chromatography with Diode-Array Detection and the Addition of Internal Standard, pp 389-393 [27] Y Satoh, S Sakai, M Katsumata, M Nagasao, M Miyakoshi, Y Ida, et al rm [28] Schwarz M et al (2009), “Herbal Reference Standards”, Planta Med, 75, 689– 703 [29] H F Tang, Y H Yi, Z Z Wang, Y P Jiang, and Y Q Li (1997), "Oleanolic dP acid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis", Yao XueXue Bao, 32(9), pp 685-90 [30] Vu Thi Thom et al (2018), “Antithrombotic Activity and Saponin Coposition of of M ed ic ine an the Roots of Panax bipinnatifidus Seem Growing in Vietnam”, Pharmacognosy Research, 10(4), pp 333-338 [31] D Q Wang, J Fan, B S Feng, S R Li, X B Wang, C R Yang, et al (1989), "Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus(Seem.)Wu et Feng", Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 593-599 [32] Y Weng, L Yu, J Cui, Y R Zhu, C Guo, G Wei, et al (2014), "Antihyperglycemic, hypolipidemic and antioxidant activities of total saponins extracted from Aralia taibaiensis in experimental type diabetic rats", J Ethnopharmacol, 152(3), pp 553-560 [33] WHO (1997), A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) py rig ht @ Sc ho ol requirements - Part 2: Validation, Word Health Organization, Geneva [34] World Health Organization (2006), General guidelines for the establishment, maintenance and distribution of chemical reference substances, Genève, 3-24 [35] Yuchi Zhang et al (2016), “Saponins from Panax bipinnatifidus Seem: New strategy of extraction, isolation, and evaluation of tyrosinase inhibitory activity based on mathematical calculations”, Journal of Chromatography B, 1039:7987 Co C TRANG WEB [36] https://www.pharmacopoeia.com/ [37] http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/74029835#section=Top [38] http://www.hmdb.ca/metabolites/HMDB0040855 ,V NU PHỤ LỤC Phụ lục 01 Phiếu kết giám định mẫu Phụ lục 02 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP rm ac y Phụ lục 03 Sắc ký đồ cao BuOH sâm vũ diệp nồng độ 100 mg/mL ht py rig Co @ ol Sc ho of ine ed ic M ,V NU ac y rm dP an Phụ lục 01 Phiếu kết giám định mẫu ht py rig Co @ ol Sc ho of ine ed ic M ,V NU ac y rm dP an Phụ lục 02 Sắc ký đồ mẫu trắng (MeOH) Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP rm ac y ,V NU Phụ lục Sắc ký đồ cao BuOH sâm vũ diệp nồng độ 100 mg/mL ht py rig Co @ ol Sc ho of ine ed ic M ,V NU ac y rm dP an