Phân tích Acid Oleanolic và thành phần Saponin trong rễ cây sâm vũ diệp (Panax Bipinnatifidus Seem.) thu hái ở Tây Bắc

Header Page of 116 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HUỆ PHÂN TÍCH ACID OLEANOLIC VÀ THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) THU HÁI Ở TÂY BẮC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2017 Footer Page of 116 Header Page of 116 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HUỆ PHÂN TÍCH ACID OLEANOLIC VÀ THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) THU HÁI Ở TÂY BẮC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa : QH.2012.Y Người hướng dẫn : TS NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội – 2017 Footer Page of 116 Header Page of 116 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực đề tài với nhiều nỗ lực cố gắng, thời điểm hoàn thành luận văn lúc xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt giúp đỡ suốt thời gian qua Trước hết, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GVHD, TS Nguyễn Hữu Tùng, người dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn, giúp đỡ trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, thầy cô Khoa Y Dược đặc biệt Bộ môn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc tạo điều kiện cho hoàn thành khóa luận Tôi xin cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2012.Y đặc biệt bạn Bích, Ngần, Hào đồng hành suốt thời gian qua Cuối cùng, vô biết ơn gia đình nuôi dạy, khích lệ sát cánh, giúp có thêm động lực cố gắng để có kết ngày hôm Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Huệ Footer Page of 116 Header Page of 116 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril DAD Detector mảng điốt (Diode array detector) Dd Dung dịch EtOH Ethanol FLD Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performace liquid chromatography) MeOH Methanol MOA KTP Hàm lượng acid oleanolic không thủy phân MOA STP Hàm lượng acid oleanolic sau thủy phân Msaponin tổng số Hàm lượng saponin tổng số OA Acid oleanolic RSD Độ lệch chuẩn tương đối SVD Sâm vũ diệp TB Trung bình THF Dimethylformamid TT Thứ tự UV Ultra violete VIS Visible Footer Page of 116 Header Page of 116 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Nội dung Trang 3.1 Tính thích hợp hệ thống 23 3.2 Kết khảo sát khoảng tuyến tính acid oleanolic 25 3.3 Kết độ lặp lại phương pháp 26 3.4 Kết độ phương pháp 27 3.5 Kết hàm lượng acid oleanolic dược liệu cao sâm vũ diệp 28 3.6 Kết hàm lượng saponin tổng số dược liệu cao sâm vũ diệp 29 Footer Page of 116 Header Page of 116 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 1.2 Cấu trúc hóa học hợp chất tách từ rễ sâm vũ diệp 1.3 Công thức tổng quát saponin với phần sapogenin acid oleanolic sâm vũ diệp 1.4 Cấu trúc hóa học acid oleanolic 1.5 Sắc ký đồ chất thông số đặc trưng 11 2.1 Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Sa Pa, Lào Cai 2.2 Cơ sở phương pháp thủy phân saponin khung oleanan từ sâm vũ diệp 16 19 3.1 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 22 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng (đánh giá độ đặc hiệu) 24 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic (đánh giá độ đặc hiệu) 24 3.4 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích pic nồng độ acid oleanolic 25 Footer Page of 116 Header Page of 116 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG – TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Phân bố sinh thái 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Tính vị, công 1.1.5 Công dụng 1.1.6 Tác dụng dược lý 1.2 TỔNG QUAN VỀ SAPONIN 1.3 TỔNG QUAN VỀ ACID OLEANOLIC 1.3.1 Công thức hóa học 1.3.2 Tính chất lý hóa 1.3.3 Tác dụng sinh học acid oleanolic 1.3.4 Một số nghiên cứu định lượng acid oleanolic HPLC 1.4 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 10 1.4.1 Nguyên tắc HPLC 10 1.4.2 Một số thông số đặc trưng 11 1.4.3 Thẩm định phương pháp phân tích HPLC 13 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16 2.1.1 Nguyên liệu 16 2.1.2 Dung môi, hóa chất 16 2.1.3 Máy móc, dụng cụ 16 Footer Page of 116 Header Page of 116 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Phương pháp chiết xuất sâm vũ diệp 17 2.2.2 Phương pháp phân tích HPLC 17 2.2.3 Phương pháp định lượng saponin tổng số 19 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 20 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 KẾT QUẢ 21 3.1.1 Quy trình chiết xuất sâm vũ diệp 21 3.1.2 Xây dựng quy trình định lượng 21 3.1.3 Định lượng acid oleanolic dược liệu cao sâm vũ diệp 27 3.1.4 Định lượng saponin tổng số cao sâm vũ diệp 28 3.2 THẢO LUẬN 30 3.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích acid oleanolic HPLC 30 3.2.2 Định lượng acid oleanolic saponin dược liệu cao sâm vũ diệp 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Footer Page of 116 Header Page of 116 ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm - Araliaceae), gọi Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất vị thuốc quý phân bố Trung Quốc dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta [1,11] Gần sâm vũ diệp hóa bước đầu trồng thử nghiệm số địa phương Hà Giang, Lào Cai Về mặt y học, dân gian hay sử dụng sâm vũ diệp làm thuốc bổ số thuốc truyền thống dân tộc vùng núi Tây Bắc [1,11] Thành phần rễ sâm vũ diệp saponin thuộc khung oleanan với 10 chất khác công bố [1,28] Các saponin có phần sapogenin acid oleanolic Acid oleanolic thành phần có hoạt tính, định tác dụng sinh học nhiều loài dược liệu chống viêm [22,26], ức chế tế bào ung thư [34] chống đông máu [37], chống oxi hóa [25,35] Tra cứu tài liệu thấy nước có nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học dược lý sâm vũ diệp để phát triển sử dụng dược liệu quý thuộc chi sâm Panax Đề tài cấp nhà nước thuộc chương trình Tây Bắc “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài thuốc sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M Feng) vùng Tây Bắc” đặt mục tiêu xác lập sở khoa học giải pháp công nghệ sinh học phân tử, hóa học dược học để phát triển sản phẩm từ hai loài Sâm vũ diệp Tam thất hoang Trên sở đó, tiến hành đề tài “Phân tích acid oleanolic thành phần saponin rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Tây Bắc” Kết đề tài sở cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng dược liệu sâm vũ diệp phục vụ việc quản lý chất lượng dược liệu thị trường, tối ưu hóa quy trình chiết nghiên cứu tác dụng dược lý sau Các mục tiêu đề tài gồm có: Xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic HPLC thẩm định phương pháp phân tích Xác định hàm lượng acid oleanolic hàm lượng saponin tổng số cao sâm vũ diệp rễ sâm vũ diệp thu hái Tây Bắc Footer Page of 116 Header Page 10 of 116 CHƯƠNG – TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 1.1.1 Đặc điểm thực vật Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ nhân sâm - Araliaceae), gọi Trúc tiết nhân sâm, Tam thất xẻ, Sâm hai lần xẻ, Hoàng liên thất có thân thảo ưa bóng đặc biệt ưa ẩm, sống nhiều năm [1,11], cao 0,25 – 0,7 cm, đường kính thân 0,3 – 0,6 cm [1] Rễ củ dài có nhiều đốt vết sẹo thân rụng hàng năm để lại Thân mảnh, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, thường lụi vào mùa khô [11] Lá kép chân vịt, gồm 2-3 mọc vòng Lá chét 5-7 (ít 3) thuôn, dài 2,5 – 14 cm, rộng 1,5- cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy không đều, mép có cưa, có lông [1,11] Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Cụm hoa tán đơn, mọc ngọn; cuống cụm hoa – 10 cm; cụm hoa có từ 20 – 90 hoa; cuống hoa mảnh dài – 1,5 cm Hoa màu trắng đục, mọc thành tán đơn thân, cánh hoa, bầu 2-3 ô [1] Quả hình cầu đến hình cầu dẹt; đường kính 0,6 – 1,2 cm; chín màu đỏ, có chấm đen đầu, chứa – hạt Hạt hình cầu gần cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [1,11] Footer Page 10 of 116 Header Page 47 of 116 Phụ lục 01 Footer Page 47 of 116 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic - Kiểm tra tính thích hợp hệ thống Header Page 48 of 116 Footer Page 48 of 116 Header Page 49 of 116 Footer Page 49 of 116 Header Page 50 of 116 Footer Page 50 of 116 Header Page 51 of 116 Footer Page 51 of 116 Header Page 52 of 116 Footer Page 52 of 116 Header Page 53 of 116 Phụ lục 02: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic – Xây dựng đường hồi quy tuyến tính Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 6,25 µg/ml Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 12,5 µg/ml Footer Page 53 of 116 Header Page 54 of 116 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 25 µg/ml Hình 10 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 50µg/ml Footer Page 54 of 116 Header Page 55 of 116 Hình 11 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 75 µg/ml Hình 12 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 100 µg/ml Footer Page 55 of 116 Header Page 56 of 116 Hình 13 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 125 µg/ml Hình 14 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 150 µg/ml Footer Page 56 of 116 Header Page 57 of 116 Hình 15 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn acid oleanolic 200µg/ml Footer Page 57 of 116 Header Page 58 of 116 Phụ lục 03: Sắc ký đồ dung dịch trắng (MeOH) Footer Page 58 of 116 Header Page 59 of 116 Phụ lục 04 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp Footer Page 59 of 116 Header Page 60 of 116 Footer Page 60 of 116 Header Page 61 of 116 Phụ lục 05 Sắc ký đồ cao sâm vũ diệp sau thủy phân Footer Page 61 of 116 ... hai loài Sâm vũ diệp Tam thất hoang Trên sở đó, tiến hành đề tài Phân tích acid oleanolic thành phần saponin rễ sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái Tây Bắc Kết đề tài sở cho việc... GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HUỆ PHÂN TÍCH ACID OLEANOLIC VÀ THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG RỄ CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDUS SEEM.) THU HÁI Ở TÂY BẮC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH... tộc vùng núi Tây Bắc [1,11] Thành phần rễ sâm vũ diệp saponin thu c khung oleanan với 10 chất khác công bố [1,28] Các saponin có phần sapogenin acid oleanolic Acid oleanolic thành phần có hoạt