nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất và làm giàu hoạt chất cao đan sâm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƢƠNG DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ LÀM GIÀU HOẠT CHẤT CAO ĐAN SÂM LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC HÀ NỘI, 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƢƠNG DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ LÀM GIÀU HOẠT CHẤT CAO ĐAN SÂM LUẬN VĂN THẠC SỸ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: Công nghệ dƣợc phẩm & bào chế thuốc MÃ SỐ: 8720202 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Bùi Thị Thúy Luyện HÀ NỘI, 2020 Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn này, ngƣời xin trân trọng gửi lời cảm ơn thầy tôi, TS Bùi Thị Thúy Luyện, ngƣời tơi ln kính trọng biết ơn dìu dắt hỗ trợ nhiều trình thực đề tài Tiếp theo xin cảm ơn ThS Trần Trọng Biên thầy cô giảng viên, kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dƣợc quan tâm, bảo tạo điều kiện cho thực luận văn Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Ngọc Chiến thầy cô Viện Công nghệ Dƣợc phẩm Quốc gia, ThS Phạm Tuấn Anh (bộ môn Dƣợc liệu) hỗ trợ sắc ký HPLC số máy móc Nếu khơng có hỗ trợ này, chắn tơi khó hồn thành cơng việc nghiên cứu Tơi xin cảm ơn DS Đồn Huy Hồng, sinh viên Nguyễn Thị Tâm (K70) hỗ trợ công việc phần thực nghiệm Cuối xin cảm ơn gia đình, bạn bè đồng hành ủng hộ suốt thời gian qua Do thời gian, lực kinh nghiệm hạn chế, luận văn chắn khó tránh khỏi thiếu sót Tơi nhƣ nhóm nghiên cứu mong nhận đƣợc bảo thầy ý kiến đóng góp bạn bè Hà Nội, tháng 04 năm 2020 Học viên Nguyễn Thị Phƣơng Dung MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Đan sâm 1.1.1 Tên gọi phân bố 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Công dụng, cách dùng 1.1.5 Thành phần hóa học 1.2 Các sản phẩm từ Đan sâm 1.3 Một số phƣơng pháp chiết xuất cao từ Đan sâm 1.4 Một số phƣơng pháp tinh chế làm giàu hoạt chất cao rễ Đan sâm 11 1.5 Phƣơng pháp tinh chế làm giàu hoạt chất cao rễ Đan sâm sử dụng nhựa macroporous 13 1.5.1 Tổng quan nhựa macroporous 13 1.5.2 Các nghiên cứu tinh chế cao Đan sâm sử dụng nhựa macroporous 15 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tƣợng 18 2.1.1 Nguyên vật liệu 18 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp định tính định lượng tanshinon IIA acid salvianolic B Đan sâm 19 2.3.2 Phương pháp chiết xuất xử lý dịch chiết 24 2.3.3 Phương pháp xử lý hạt nhựa 25 2.3.4 Phương pháp nghiên cứu trình hấp phụ tanshinon IIA acid salvianolic B từ dịch chiết lên hạt nhựa macroporous 25 2.3.5 Phương pháp nghiên cứu trình giải hấp phụ tanshinon IIA acid salvianolic B từ hạt nhựa macroporous D101 27 2.3.6 Xây dựng đánh giá quy trình chiết xuất, làm giàu hoạt chất cao rễ Đan sâm sử dụng nhựa macroporous 29 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 Phƣơng pháp định tính định lƣợng tanshinon IIA acid salvianolic B Đan sâm 31 3.2 Khảo sát thông số ảnh hƣởng đến trình chiết xuất tinh chế cao thô Đan sâm nhựa macroporous 37 3.2.1 Khảo sát q trình chiết xuất cao thơ từ dược liệu Đan sâm 37 3.2.2 Khảo sát thơng số ảnh hưởng đến q trình tinh chế cao thô Đan sâm nhựa macroporous 40 3.3 Quy trình chiết xuất, làm giàu đồng thời hàm lƣợng acid salvianolic B, tanshinon IIA cao rễ Đan sâm đánh giá hiệu quy trình 46 3.3.1 Quy trình chiết xuất làm giàu đồng thời hàm lượng acid salvianolic B, tanshinon IIA cao rễ Đan sâm 46 3.3.2 Đánh giá hiệu quy trình 49 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 53 4.1 Về phƣơng pháp định lƣợng 53 4.2 Về trình chiết xuất cao Đan sâm 53 4.3 Về trình hấp phụ giải hấp phụ nhựa macroporous 54 4.3.1 Lựa chọn nhựa macroporous 54 4.3.2 Bàn luận kết nghiên cứu trình hấp phụ 55 4.3.3 Bàn luận kết nghiên cứu trình giải hấp phụ 55 4.4 Bàn luận quy trình làm giàu hoạt chất cao Đan sâm nhựa macroporous D101 đề xuất 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AOAC Association of Official Analytical Chemists ASB Acid salvianolic B EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HLPC Sắc ký lỏng hiệu cao HSCCC High speed countercurrent chromatography KTTP Kích thƣớc tiểu phân TanIIA Tanshinon IIA TKHH Tinh khiết hóa học TLC Sắc ký lớp mỏng UV-VIS Đo quang vùng tử ngoại - khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Một số loại nhựa macroporous đặc tính Kết thời gian lƣu diện tích pic dung dịch chuẩn hỗn hợp Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp định lƣợng 14 33 34 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ ASB 35 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ TanIIA 36 Bảng 3.5 Kết định lƣợng dƣợc liệu Đan sâm 37 Bảng 3.6 Kết định lƣợng khảo sát chọn dung môi chiết 38 Bảng 3.7 Kết khảo sát lựa chọn KTTP bột rễ Đan sâm 39 Bảng 3.8 Kết định lƣợng ASB để lựa chọn nhựa hấp phụ 41 Bảng 3.9 Kết khảo sát tốc độ hấp phụ 42 Hàm lƣợng hiệu suất thu hồi ASB TanIIA Bảng 3.10 49 sau trình làm giàu DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Cây rễ Đan sâm Hình 1.2 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học acid salvianolic B Cấu trúc hóa học tanshinon IIA Hình 1.4 Một phần mạng lƣới polymer liên kết chéo 15 Hình 3.1 Sắc ký đồ phƣơng pháp đính tính 31 Hình 3.2 Sắc ký đồ ASB TanIIA mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thử 32 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Mối tƣơng quan nồng độ diện tích pic ASB TanIIA Khảo sát dung môi chiết Đan sâm SKLM 38 Hình ảnh SKLM theo dõi trình chiết xuất Đan sâm 40 Hình ảnh mỏng so sánh loại nhựa macroporous Hình 3.7 34 Đƣờng cong hấp phụ 41 42 Khảo sát dung môi giải hấp phụ hoạt chất Hình 3.8 bình nón 43 Hình 3.9 Khảo sát nồng độ giải hấp phụ hoạt chất cột 43 Hình 3.10 Khảo sát thể tích giải hấp phụ ASB TanIIA 44 Hình 3.11 Khảo sát thể tích giải hấp phụ ASB 45 Hình 3.12 Khảo sát thể tích giải hấp phụ TanIIA 46 Hình 3.13 Sắc ký đồ định lƣợng loại cao Đan sâm 51 Hình 3.14 Nguyên tắc rửa giải theo gradient nồng độ 55 ĐẶT VẤN ĐỀ Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), thƣờng đƣợc gọi Danshen Trung Quốc Tanshen Nhật Bản, phân bố rộng rãi Trung Quốc Nhật Bản, đƣợc ghi nhận lần “Thần Nông Bản Thảo” (Shennong Bencao Jing) sách cổ y học lâu đời Trung Quốc Đan sâm đƣợc sử dụng để điều trị bệnh khác nhau, bao gồm bệnh tim mạch vành, bệnh mạch máu não, bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson ….[12] Trong bối cảnh bệnh lý tim mạch ngày phổ biến trở thành mối quan tâm toàn xã hội, với tác dụng dƣợc lý đáng ý, dƣợc liệu Đan sâm trở thành dƣợc liệu tiềm để phát triển sản phẩm điều trị bệnh Thành phần Đan sâm gồm thành phần hóa học chính: thành phần tan nƣớc thành phần tan dầu Từ năm 1970, nhiều nghiên cứu thành phần thân dầu mà đại diện tanshinon có hiệu chống viêm điều trị bệnh tim mạch vành Nhƣng phải đến năm 1980, số hợp chất tan nƣớc Đan sâm đƣợc phân lập, làm sáng tỏ thêm tác dụng Đan sâm cho điều trị bệnh tim mạch mạch máu não [41] Nếu điều chế đƣợc loại cao giàu hai thành phần mang lại lợi ích to lớn việc điều trị bệnh tim mạch dự phòng đột qụy Cho đến nay, nhu cầu sử dụng Đan sâm giới ƣớc tính 15000 tấn/ năm tạo gần 100 loại thuốc khác nhau, có thuốc tiêm nƣớc Đan sâm, viên xông van tim, viên xông giãn tim nhiều loại thực phẩm chức [3] Đan sâm thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với loại dƣợc liệu khác Ví dụ, Danshen Dripping Pill (tên tiếng Trung Fufang Danshen Diwan) viên hoàn nhỏ giọt kết hợp Đan sâm Tam thất đƣợc sử dụng rộng rãi hiệu điều trị cao Hiện nay, việc tinh chế, phân lập làm giàu hoạt chất từ Đan sâm chủ yếu đƣợc thực kỹ thuật chiết phân bố lỏng - lỏng, sắc ký lọc gel, sắc ký ngƣợc dòng hiệu cao, sắc ký phân bố ly tâm… Tuy nhiên, phƣơng pháp trải qua nhiều bƣớc, chi phí cao, tốn thời gian, sử dụng nhiều dung môi hữu độc hại khó nâng quy mơ Thời gian gần đây, nhựa hấp phụ macroporous đƣợc bắt đầu ứng dụng phân lập, tinh chế hợp chất thiên nhiên có khả hấp phụ/phản hấp phụ chọn lọc nhiều nhóm phân tử mục tiêu, hiệu suất cao, dễ tái sử dụng, độ lặp lại tốt hầu hết sử dụng dung môi "xanh" nhƣ nƣớc ethanol Nhận thấy nghiên cứu đa phần phân lập làm giàu riêng nhóm hoạt chất (thân nƣớc thân dầu), chƣa có nghiên cứu làm giàu đồng thời tất nhóm hoạt chất Đan sâm Vì thế, từ ƣu điểm hạt nhựa macroporous tính cấp thiết việc làm giàu hoạt chất từ Đan sâm để ứng dụng cơng nghiệp dƣợc phẩm, phục vụ nhu cầu phịng điều trị bệnh ngƣời dân, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất làm giàu hoạt chất cao Đan sâm” với mục tiêu sau: Khảo sát đƣợc ảnh hƣởng số thông số kỹ thuật đến trình chiết xuất làm giàu hoạt chất cao Đan sâm nhựa macroporous Xây dựng đƣợc quy trình chiết xuất làm giàu hoạt chất cao Đan sâm quy mô 50g dƣợc liệu/ mẻ ... làm giàu hoạt chất cao Đan sâm? ?? với mục tiêu sau: Khảo sát đƣợc ảnh hƣởng số thơng số kỹ thuật đến q trình chiết xuất làm giàu hoạt chất cao Đan sâm nhựa macroporous Xây dựng đƣợc quy trình chiết. .. từ Đan sâm 1.3 Một số phƣơng pháp chiết xuất cao từ Đan sâm 1.4 Một số phƣơng pháp tinh chế làm giàu hoạt chất cao rễ Đan sâm 11 1.5 Phƣơng pháp tinh chế làm giàu hoạt chất cao. .. việc làm giàu hoạt chất từ Đan sâm để ứng dụng công nghiệp dƣợc phẩm, phục vụ nhu cầu phòng điều trị bệnh ngƣời dân, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất làm