Nghiên cứu vòng đời của vi tảo lục Haematococcus pluvialis trong điều kiện phòng thí nghiệm

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về tảo và vi tảo 1.1.1. Khái niệm về tảo và vi tảo 1.1.2. Vài nét về đặc điểm sinh học của tảo

MỞ ĐẦU1 Đặt vấn đề

Vi tảo (Microalgae) là những loại tảo có kích thước hiển vi Chúng cóvai trò rất quan trọng trong tự nhiên và trong đời sống của con người Trongcác thuỷ vực tảo cung cấp oxy và là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn củathủy vực, cung cấp hầu hết thức ăn sơ cấp cho cá cũng như các động vật thuỷhải sản khác Nhiều loại tảo biển còn được khai thác để sản xuất thạch (agar),alginate, sản phẩm giàu iod, làm phân bón Nhiều tảo đơn bào được nuôitrồng công nghiệp để tạo ra những nguồn thức ăn cho ngành nuôi trồng thủysản hay thực phẩm chức năng bổ dưỡng giàu protein, vitamin và khoáng dùngcho người Tảo còn là nguyên liệu trong các ngành Y, Dược, mỹ phẩm, đượcsử dụng trong xử lí ô nhiễm môi trường, làm phân bón, góp phần giảm nhẹ sựbiến đổi khí hậu toàn cầu (sử dụng tảo để giảm thiểu hiệu ứng nhà kính), gớpphần trong việc giải quyết vấn đề an ninh năng lượng (sản xuất nhiên liệu sinhhọc từ tảo) Tuy nhiên, ứng dụng phổ biến nhất hiện nay của vi tảo là làmthức ăn trong nuôi trồng thuỷ sản và tách chiết những chất có hoạt tính sinhhọc có thể thương mại hóa được.

Trong những sản phẩm từ tảo thì astaxanthin có giá trị thương mại lớndo các ứng dụng đa dạng và giá thành cao (khoảng 2500 – 3000 USD/kg)[27] Đây là một loại chất thuộc nhóm carotenoit, có thể tìm thấy trong nhiềuloại hải sản như cá hồi, cá vền, tôm cua, trứng cá, một số loài chim [15].Động vật có vú không thể tự tổng hợp được astaxanthin và phải được cungcấp từ khẩu phần ăn.

Loài vi tảo lục Haematococcus pluvialis có khả năng tích luỹ

astaxanthin cao nhất Tuy nhiên, hiện nay công nghệ nuôi tảo

Haematococcus pluvialis để cung cấp nguồn giống thuần cho các nghiên cứu

chuyên sâu về khoa học cơ bản trên đối tượng này cũng như ứng dụng sinh

khối tảo trong thực tế vẫn đang là thách thức đối với các nhà khoa học củaViệt Nam Chính vì thế, để có thể chủ động nguồn giống phù hợp với điều

kiện khí hậu của Việt Nam, chúng ta cần phải tiến hành: “Nghiên cứu vòng

đời của vi tảo lục Haematococcus pluvialis trong điều kiện phòng thí

Công việc được thực hiện tại phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệSinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

PHẦN 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Giới thiệu chung về tảo và vi tảo

1.1.1 Khái niệm về tảo và vi tảo

Tảo (Algae) là những thực vật bậc thấp (thực vật có bào tử, cơ thểkhông phân chia thành thân, rễ, lá) Trong tế bào (TB) tảo có chứa diệp lục vàchúng sống chủ yếu ở nước.

Vi tảo (Microalgae) là tất cả các loại tảo có kích thức hiển vi tức làmuốn quan sát được chúng thì phải sử dụng kính hiển vi Trong số khoảng50.000 loài tảo trên thế giới thì vi tảo chiếm khoảng 2/3 Vai trò quan trọngcủa vi tảo thể hiện qua quá trình quang hợp hấp thụ CO2, cung cấp O2 chocác sinh vật khác trên trái đất, khép kín vòng tuần hoàn vật chất và làmtăng tốc độ quay vòng của các chu trình đó [5].

Tảo có mặt ở khắp nơi trên trái đất, từ đỉnh núi cao cho đến dưới đáybiển sâu, thậm chí ở cả độ sâu khoảng 200m dưới biển nếu như nước biển ởđó rất sạch [9] Những loài tảo sống trong các thuỷ vực được gọi là tảo phùdu (phytoplankton) còn những tảo sống bám đáy thủy vực, bám trên các vậtsống hay các thành tàu thuyền được gọi là tảo đáy (Phytobentos) Dạng tảocộng sinh với nấm thành Địa y cũng là dạng phân bố rất rộng rãi và nhiềuloài đã được khai thác dùng làm dược phẩm, nước hoa, phẩm nhuộm và cácmục đích kinh tế khác (hiện đã biết tới 20.000 loài Địa y thuộc 400 chikhác nhau) [41].

1.1.2 Vài nét về đặc điểm sinh học của tảo

Cơ thể tảo được gọi là tản (thallus) vì thiếu thân, rễ và lá nhưng chúnglại có chlorophyll a - sắc tố quang hợp điển hình Hầu hết các loại tảo đềusống trong môi trường nước, từ nước ngọt đến nước mặn và nước lợ Tảo cócấu trúc từ dạng đơn bào đến đa bào và tập đoàn Nhìn chung tế bào tảo có

một số đặc điểm cấu trúc tương tự như thực vật bậc cao: có vách TB cấu tạotừ cellulose, có lục lạp và chlorophyll [3].

Một số cấu trúc dạng tản của tảo mà chúng ta thường gặp là cấu trúcmônát, cấu trúc palmella, cấu trúc hạt, cấu trúc sợi, cấu trúc dạng bản và cấutrúc ống (siphon) Nhìn chung tảo có 3 phương thức sinh sản là sinh sản sinhdưỡng, sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính [3].

Phương thức dinh dưỡng của tảo được phân thành hai loại chính:quang tự dưỡng (photoautotrophy) và dị dưỡng (heterotrophy) Dạng trunggian của hai hình thức trên là tạp dưỡng (mixotrophy) [1] Những tảo sốngtrên bề mặt thì cần ánh sáng để quang hợp Quá trình quang hợp sử dụngCO2 và ánh sáng mặt trời để tạo ra các vật chất hữu cơ Ở dạng tạp dưỡng,quang hợp vẫn là quá trình cơ bản để tạo chất hữu cơ nhưng trong một sốtrường hợp, tảo sử dụng được cả các chất hữu cơ có sẵn

Môi trường dinh dưỡng cho nuôi trồng tảo phải dựa theo nhu cầudinh dưỡng của từng loài Mặc dù vậy, việc xác định chính xác nồng độcủa từng yếu tố dinh dưỡng cho một loài nào đó là rất khó khăn vì nồng độdinh dưỡng tối ưu phụ thuộc rất nhiều vào mật độ quần thể, ánh sáng, nhiệtđộ và pH môi trường.

1.1.3 Sinh trưởng của tảo:

Sự tăng trưởng của tảo nuôi trồng trong điều kiện vô trùng được đặc

trưng bởi 5 pha [30] được thể hiện ở hình 1

Hình 1: Năm pha sinh trưởng của vi tảo

- Pha chậm hoặc cảm ứng (1): Tảo sinh trưởng chậm, mật độ TB tăng ít

do phải thích nghi dần với môi trường sống mới.

- Pha sinh trưởng theo hàm số mũ (2): Ở pha này mật độ TB tăng nhanh- Pha giảm tốc độ sinh trưởng (3): Sự phân chia TB sẽ chậm lại khi cácchất dinh dưỡng, ánh sáng, độ pH, CO2 hoặc các yếu tố lý hóa khác bắt đầuhạn chế sự sinh trưởng.

- Pha ổn định (4): Mật độ TB tương đối ổn định, không thay đổi do cácyếu tố hạn chế và tốc độ sinh trưởng ở trạng thái cân bằng.

- Pha tàn lụi (5): Chất lượng môi trường trở nên xấu đi, các chất dinhdưỡng suy kiệt tới mức không thể duy trì được sự sinh trưởng Mật độ TBgiảm mạnh.

1.1.4 Phân loại:

Căn cứ vào màu sắc, sự có mặt của các chất dự trữ, thành phần vỏ, cấutạo nhân TB người ta có thể chia tảo thành những ngành khác nhau Vi tảochủ yếu thuộc về các chi trong các ngành sau:

1- Ngành Chlorophyta (Tảo lục):

Các chi Closterium, Coelastrum, Dyctyosphaerium, Scenedesmus,Pediastrum, Staurastrum, Dunaliella, Chlamydomonas, Haematococcus,Tetraselmis, Chlorella

2- Ngành Heterokontophyta (Tảo lông roi lệch):

Các chi Melosira, Asterionella, Cymatopleurra, Somphonema,Fragilaria, Stephanodiscus, Navicula, Malomonas, Dinobryon, Peridinium,Isochrysis, Chaetoceros, Phaeodactylum, Skeletonema, Nitzschia

3- Ngành Euglenophyta (Tảo mắt):

Các chi Phacus, Trachelomonas, Ceratium 4- Ngành Rhodophyta (Tảo đỏ):

Các chi Porphyridium, Rhodella

1.1.5 Giá trị dinh dưỡng của vi tảo:

Ưu điểm của vi tảo là kích thước nhỏ phù hợp, dễ tiêu hoá, ít gây ônhiễm môi trường, nhiều loài không có độc tố, có thể chuyển hoá trongchuỗi thức ăn, tỷ lệ phát triển nhanh, có khả năng nuôi sinh khối lớn, cungcấp đầy đủ các dưỡng chất cần thiết cho động vật nuôi Do đó đây là thức ănsống đặc biệt quan trọng cho tất cả các giai đoạn phát triển của động vật thân

mềm hai vỏ (Bivalvia) như: hầu, điệp, sò…; ấu trùng của hầu hết các loài

tôm, cá, ốc và cho các động vật phù du Nhìn chung hàm lượng protein củavi tảo dùng trong nuôi trồng thuỷ sản thay đổi từ 6 – 52%, carbohydrate: 5 -23%, lipit: 7 - 23% [8].

Đến nay, tất cả các nghiên cứu đều xác định rằng các loài tảo khácnhau thì chúng có giá trị dinh dưỡng khác nhau Một loài tảo có thể thiếu ítnhất một thành phần dinh dưỡng cần thiết Vì vậy, việc sử dụng hỗn hợp cácloài tảo làm thức ăn cho động vật, thuỷ sản sẽ cung cấp chất dinh dưỡng tốthơn nhưng phải biết kết hợp các loài tảo cho hợp lý cả về tỷ lệ và thành phần,phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng của từng đối tượng nuôi cụ thể thì mới đemlại hiệu quả cao

1.2 Những ứng dụng chủ yếu của vi tảo: đó là hai mảng sau:

1.2.1 Sử dụng vi tảo làm nguồn thực phẩm cho con người và động vật:

Vi tảo là nguồn thực phẩm chức năng quan trọng cho con người và độngvật nuôi Bất kì một loại protein đơn bào nào cũng phải trải qua thử nghiệm cẩnthận ở động vật thực nghiệm trước khi trở thành thức ăn cho người hoặc động

vật Ví dụ sinh khối tảo Spirulina đã được Chamorro (1980) tiến hành thử

nghiệm độc tố ngắn hạn và trường diễn, nghiên cứu ảnh hưởng tới sự sinh sản,khả năng tiết sữa, đột biến và gây quái thai Nhiều nghiên cứu độc tính cấp và

độc tính bán trường diễn đối với các loài tảo khác (Scenedesmus,Micractinium, Chlorella ) cũng không tìm thấy bất cứ một bằng chứng nào về

khả năng hạn chế việc sử dụng sinh khối tảo trong dinh dưỡng [3].

Vào những năm gần đây việc sử dụng vi tảo nói làm nguồn dinh dưỡngcho con người đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, nhà sản xuất vàngười tiêu dùng Sinh khối tảo có giá trị dinh dưỡng cao và không có độc tố.Nhưng hiện nay việc sử dụng tảo làm nguồn thực phẩm còn gặp nhiều hạnchế vì giá thành sản xuất cao, thử nghiệm dinh dưỡng chưa đủ thuyết phục,thiếu cơ chế kiểm tra chất lượng thường xuyên và thói quen sử dụng các loạithức ăn truyền thống của người tiêu dùng Trong tương lai, vi tảo hứa hẹn lànguồn thực phẩm sử dụng phổ biến cho mọi gia đình.

Chlorella, Miractinium, Scenedesmus, Oocystis và Siprulina là các loại

vi tảo thường được sử dụng để bổ sung sinh khối vi tảo vào khẩu phần thức ăncủa các loại gia cầm Ngoài ra vi tảo cũng được sử dụng có hiệu quả trong nghề

nuôi tằm và nuôi cá cảnh Việc đưa sinh khối tảo như Chlorella (protein chiếm40 – 60% TLK), Scenedesmus (protein chiếm trên 30%), Siprulina (protein

chiếm 65 – 70% TLK) [4] vào khẩu phần thức ăn của gà với tỷ lệ 7,5-10% làgiải pháp có lợi về kinh tế Các nhà khoa học đã thử nghiệm việc đưa sinh khối

tảo Siprulina vào thức ăn của cá mè trắng, trắm cỏ, rô phi với tỷ lệ 5% làm tăng

tỉ lệ sống và tốc độ tăng trưởng của cá Những thí nghiệm gần đây cho thấyviệc bổ sung tảo tươi vào khẩu phần thức ăn của gà mái đẻ giúp tăng tỷ lệ đẻ và

hàm lượng VTM A có trong trứng [3] Do đó, việc ứng dụng vi tảo vào ngànhchăn nuôi đang được coi là một hướng đi đầy tiềm năng và có triển vọng nhất.

1.2.2 Khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ tảo:

Nhiều VTM hoà tan trong nước (B1, B12, B6, Biotin, C) được tìm thấytrong dịch nuôi tảo lam, tảo silic và tảo lục Những loại VTM này được phát hiệndưới dạng các chất trao đổi trung gian như α-, β-, γ-tocopherol (VTM E) ở tảo

lam và α-tocopherol và VTM K ở Pophyridium cruentum Hàm lượng VTM

trong sinh khối tảo phụ thuộc vào kiểu gen, chu trình sinh trưởng, điều kiện nuôitrồng và các thao tác di truyền Hiện nay ở nhiều nước như Đài Loan, Nhật Bản,

các chủng tảo Chlorella, Pophyridium đã được nuôi để sản xuất VTM.

Trong vi tảo cũng chứa nhiều chất béo tương tự như ở dầu thực vật Hàmlượng lipit trong tảo dao động từ 20-40% TLK Trong một số điều kiện nhấtđịnh, tảo có thể chứa tới 85% lipit theo TLK Ngoài chlorophyll, vi tảo còn chứamột số sắc tố bổ trợ như phycobiliprotein và carotenoit Các loại carotenoitthông thường chỉ chiếm 0,1% TLK của vi tảo nhưng ở một số loài, chúng có thểđạt từ 5-14% TLK Các sắc tố này có thể đánh dấu kháng thể đơn dòng ứngdụng trong nghiên cứu miễn dịch Mặt khác, phycobiliprotein và β-caroten đượcbiết đến như những yếu tố nâng cao sức đề kháng của cơ thể và là chất hỗ trợphòng chống bệnh ung thư

Vi tảo còn chứa một lượng lớn carbonhydrat dưới dạng sản phẩm dự trữ(tinh bột, glycogen) hoặc các chất điều hoà thẩm thấu (glyceron, trehalose,glucose…) Ngoài ra có thể liệt kê một số chất chống oxy hoá có mặt trongsinh khối tảo như carotenoit (sắc tố), tocopherol, VTM C (VTM),superoxydismutase, catalase và glutation peroxydase (enzyme) Các vi tảo -

nguồn các chất chống oxy hoá có triển vọng đang được khai thác là: Dunaliellasalina: để sản xuất β-caroten, Heamatococcus pluvialis: để sản xuấtastaxanthin, Porphyridium cruentum: để sản xuất Superoxydismutase (SOD).

Vi tảo còn là nguồn cung cấp các chất có hoạt tính kháng sinh (như

kháng vi khuẩn, nấm) Ví dụ như: axit acrylic thu từ vi tảo Phaecystis, axit linoleic trong dịch chiết methanol từ tảo Spirulina platensis, Chrococcum Testraselamiss suecia là một chất ức chế hình thành virus Vibrio sp., Một

-lượng lớn các chất tách từ vi tảo biển có vai trò diệt tảo độc hoặc thuốc trừ

sâu như cyanobacterin tách từ Scytonema hofmanni đã được công bố [7].

1.3 Thực trạng nghiên cứu - nuôi trồng vi tảo hiện nay:

1.3.1 Trên thế giới:

Tảo được trồng đại trà ở các nước trên thế giới từ những năm 1972, cácnước sản xuất vi tảo chủ yếu tập trung ở Châu Á và vành đai Thái BìnhDương Những khu vực và vùng lãnh thổ có sản lượng vi tảo lớn là TrungQuốc, Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc, Thái Lan, Isarel, Hoa Kỳ, Mexico…Nhiều nhất là ở Mexico và Mỹ, nơi sản xuất tảo lớn nhất là ở Hawaii (khoảng25 ha) và mới đây là Trung Quốc (16 ha) Trên thế giới còn có các trang trạinuôi trồng tảo với quy mô lớn, chất lượng cao như: Trang trại Twin Tauong(Myanmar) - Trang trại Sosa Texcoco (Mehico) - Công ty tảo Siam (TháiLan) - Trang trại Chenhai (Trung Quốc) - Nông trại Hawai (HoaKỳ)…

Tảo Spirulina được sử dụng như thực phẩm dinh dưỡng ở hơn 70 quốc

gia trên thế giới Người ta chỉ ra rằng ở hơn 30 trung tâm dinh dưỡng và bệnh

viện ở các nước đang phát triển đã sử dụng chế phẩm từ tảo Spirulina làm

thức ăn với hàm lượng 10g/ngày, kết quả cho thấy các bệnh nhân hồi phụctrạng thái suy dinh dưỡng chỉ sau 1- 3 tuần lễ Hiện có hơn 1000 bài báo khoahọc được xuất bản đề cập đến hiệu quả sinh học của loài tảo này [40].

1.3.2 Ở Việt Nam:

Việt Nam có lợi thế là nước nhiệt đới, khí hậu nóng ẩm rất thuận lợicho sự phát triển của vi sinh vật, nhất là tảo ngày càng phát triển Từ năm1972 các nhà khoa học bắt đầu đặt vấn đề nghiên cứu tảo do cố GS.TSKH.Nguyễn Hữu Thước làm chủ trì Năm 1976, việc thử nghiêm nuôi trồng tảo đã

được tiến hành trong 4 - 5 tháng ở Nghĩa Đô, Hà Nội và thu được kết quả khákhả quan Năm 1985, Sở Y Tế thành phố Hồ Chí Minh đã tiếp nhận giống tảođầu tiên do ông bà R.D.Fox tặng Sau đó, tảo giống được giao cho trạmnghiên cứu dược liệu giữ giống và nuôi trồng [39] Hiện có 2 nơi nuôi trồngtảo ở nước ta, đó là: Công ty cổ phần nước khoáng Vĩnh Hảo (Bình Thuận) -đơn vị tiên phong trong việc nuôi trồng và sản xuất tảo lớn nhất nước ta.Ngoài ra còn một cơ sở ở Bình Chánh, thành phố Hồ Chí Minh

Nhìn chung, lịch sử nghiên cứu và nuôi trồng tảo ở nước ta đã có từ lâuvà thu được nhiều kết quả ban đầu đáng khích lệ Nhưng cho đến nay việc nuôitrồng đa số vẫn mang tính nhỏ lẻ, lạc hậu, không đáp ứng được nhu cầu sửdụng tảo ngày càng tăng cao Vì vậy, trước những giá trị về mọi mặt mà tảomang lại, cần phải tiến hành cải thiện, thúc đẩy ngành công nghiệp nuôi trồngtảo nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu ra thị trường nước ngoài.

1.4 Tổng quan về Haematococcus pluvialis

Haematococcus pluvialis là một loài vi tảo lục, nước ngọt, đơn bào,

sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi, có thể di chuyển được [14] Đây là mộtloài tảo có tiềm năng rất lớn vì khả năng tổng hợp astaxanthin của nó Lượngastaxanthin tối đa mà loài tảo này có thể đạt được lên tới 5-6% TLK [11; 12].Astaxanthin là một sắc tố được sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản, giúp tăngchất lượng và màu sắc thịt cá hồi và làm cá cảnh có màu sắc rực rỡ Tuynhiên để có thể nuôi trồng thành công và đạt được hàm lượng astaxanthin caothì chúng ta phải biết về các giai đoạn sinh trưởng cũng như các yếu tố ảnh

hưởng tới sự phát triển của loài tảo H.pluvialis trong từng giai đoạn ấy.

1.4.1 Vị trí phân loại của Haematococcus pluvialis

Vị trí của Haematococcus pluvialis trong hệ thống phân loại như sau [33]:Giới: Eukaryota

Ngành: Chlorophyta

Lớp: Chlorophyceae

Bộ: Volvocales Họ: Chlamydomonadales

Chi: Haematococcus

Loài: Haematococcus pluvialis.

1.4.2 Đặc điểm hình thái và sự thay đổi các thành phần nội bào trong vòngđời của vi tảo lục H.pluvialis:

Tảo đơn bào nước ngọt Heamatococcus pluvialis (H pluvialis) thuộc

nhóm tảo lục hai roi và có khả năng chuyển động ở giai đoạn sinh dưỡng [32].

Sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi Hình thái TB của H.pluvialis có sự biến

đổi khác nhau trong chu trình sống của chúng TB có 2 dạng, tương ứng vớiđặc điểm sinh trưởng: TB sinh dưỡng và nang bào tử (cyst) Trong đó:

Hình 2 a Tế bào H.pluvialis ở dạng sinh dưỡng,

b Tế bào H.pluvialis ở dạng nang bàng tử (cyst)[36]

- TB sinh dưỡng: màu xanh, dạng cầu hoặc elip với đường kính khoảng10-20 µm, có thể chuyển động nhờ 2 roi Trong điều kiện thuận lợi, phần lớnTB ở dạng sinh dưỡng, có hàm lượng chlorophyll a, b và tiền carotenoit, đặcbiệt là β-carotene và lutein cao [47] Sinh trưởng quang tự dưỡng khi có ánhsáng [11] và dị dưỡng trong tối [32].

- Nang bào tử: Khi gặp điều kiện bất lợi (cạn kiệt dinh dưỡng, cườngđộ ánh sáng cao, nhiệt độ cao, stress muối….) TB sẽ cảm ứng hình thànhnang bào tử và hình thái thay đổi sang dạng cyst TB dạng này hình cầu, mấtroi, không còn khả năng di động Thành TB dầy lên Đường kính của TB tăng

lên đột ngột tới 40-50 µm [27] Ngoài ra, những TB nang này có hàm lượngcarotenoit thứ cấp như echinenone, canthaxanthin và astaxanthin cao trongkhi đó hàm lượng chlorophyll và tiền carotenoit lại giảm [13] Tốc độ sinh

trưởng của H pluvialis ở giai đoạn này giảm, TB tích luỹ một lượng lớn

astaxanthin Ban đầu, astaxanthin chủ yếu được hình thành tập trung quanhnhân và quá trình được tiếp diễn tới khi toàn bộ TB chuyển sang màu đỏ [26].

Các TB dạng cyst có hàm lượng astaxanthin đạt khoảng 5% TLK [31] Thời

gian chuyển pha mất khoảng vài tuần dưới điều kiện quang tự dưỡng [14].Cùng lúc với sự thay đổi hình thái và kích thước TB là sự thay đổi hàm lượngsắc tố và protein nội bào, trong đó diễn ra sự tích lũy asxanthin cao Theo mộtsố công bố cho thấy hàm lượng chlorophyll không thay đổi trong suốt quátrình tích lũy astaxanthin, [17] nhưng trong nghiên cứu của Spery, 1970 [34]lại cho rằng hàm lượng này có xu hướng giảm đi.

Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới về vòng đời của vi tảo

H.pluvialis đã chỉ ra rằng sinh trưởng của loài tảo này trải qua 4 giai đoạn với

hình thái, kích thước TB, hàm lượng sắc tố và protein nội bào khác nhau.

Theo Kobayashi và cs., [24] vòng đời của H pluvialis trải qua các giai đoạn

như sau (hình 3):

Hình 3 Sự thay đổi hình thái trong vòng đời của H.pluvialis

(I) Giai đoạn TB sinh dưỡng: TB hình elip, chuyển động bằng hai roi,phân chia TB để gia tăng số lượng Hàm lượng carotenoit trong TB thấp

(II) Giai đoạn tạo bào nang: Các TB sinh dưỡng chuyển sang dạng màunâu, hình khối cầu, mất roi Trong suốt giai đoạn nang bào, mức độ sinh tổnghợp carotenoid và protein tăng lên [25].

(III) Giai đoạn TB nang hoàn chỉnh: TB nang đã hoàn chỉnh, bất động,tích lũy hàm lượng carotenoit cao nhất

(IV) Giai đoạn nảy mầm: Xảy ra sự tổng hợp chlorophyll và protein,xuất hiện sự phân giải carotenoit.

Trong vòng đời của tảo, TB sinh dưỡng chứa hàm lượng cao chlorophyllvà protein nhưng hàm lượng carotenoit rất thấp Khi quá trình bao nang kèmtheo việc giảm sút hàm lượng cholophyll và protein TB trưởng thành và tăngquá trình sinh tổng hợp carotenoit, giảm protein Sự nảy mầm cùng với tổnghợp chlorophyll, protein và giảm carotenoit Sự bao nang, trưởng thành và chínthường được quan sát dưới kính hiển vi Sự tích lũy carotenoit/chlorophyllđược thể hiện qua các thông số để phân biệt giữa các TB sinh dưỡng (lục), cácTB còn non (nâu), và TB chín (đỏ) Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a vào khoảng0.5; 1.0 và 7.0 trong TB sinh dưỡng, non và chín [25].

1.4.2 Tổng quan về astaxanthin:

Carotenoit là dẫn xuất của các hợp chất isopropenoit Chúng tạo nêncác màu sắc khác nhau trong tự nhiên và có các chức năng sinh học thiết yếuđối với động vật Astaxanthin (- 3,3’-dihydroxy-β,β’-carotene-4,4’-dione) làmột oxycarotenoit, có công thức phân tử C40H52O4, khối lượng phân tử M =595, điểm nóng chảy xấp xỉ 224˚C, một chất thuộc nhóm carotenoit.Astaxanthin được tìm thấy trong nhiều loại hải sản như cá hồi, cá vền

(seabream), tôm, cua, trứng cá, đôi khi nó cũng được phát hiện ở một số loàichim [18] Ngoài tự nhiên, astaxanthin tồn tại ở dạng liên kết với protein tạophức chất màu xanh đen Khi gia nhiệt hay bị oxy hoá, liên kết bị cắt đứt, giảiphóng astaxanthin tự do có màu đỏ cam Động vật có vú không có khả năng

tổng hợp astaxanthin mà phải được cung cấp từ khẩu phần ăn Ở H pluvialis,

astaxanthin được tổng hợp ở giai đoạn tạo bào nang và là loại sắc tố rất đặctrưng, có giá trị kinh tế cao.

Astaxanthin có vai trò là một chất chống oxi hóa với hoạt tính cao hơncác carotenoit khác nhiều lần nên được gọi là một “siêu VTM E” Màu sắccủa các loại giáp xác bắt nguồn từ loại carotenoit chúng thu nhận trong thứcăn, chính là astaxanthin Nó còn có vai trò thúc đẩy sự thành thục, tăng tỷ lệthụ tinh, tỷ lệ sống sót của trứng và cải thiện sự phát triển của phôi [18].

1.4.3 Các yếu tố môi trường khác nhau:

* Ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng của H Pluvialis: gồm các yếu tố sau:Ánh sáng: Cường độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởng của H pluvialisdao động từ 2-24 klux [15; 16; 23] Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của H.pluvialis dao động từ 15-27˚C [26; 33] pH tối ưu cho sự phát triển của H.pluvialis nằm trong khoảng từ 6,5-8 [27] Cuối cùng là nguồn dinh dưỡng: Bao

gồm đa lượng và vi lượng Dinh dưỡng đa lượng phải được cung cấp với lượng

lớn (carbon, nitơ, phospho, canxi ) Tốc độ sinh trưởng của H pluvialis cao

khi nồng độ nitơ và phospho cao Các nguyên tố vi lượng chỉ cần cung cấp vớihàm lượng thấp, dao động từ mức μg/l đến mg/l Một số dinh dưỡng vi lượngg/l đến mg/l Một số dinh dưỡng vi lượngcần thiết cho sinh trưởng của tảo đã được biết gồm sắt, boron, mangan, đồng vàcác VTM [23].

* Ảnh hưởng tới sự tích luỹ astaxanthin ở H pluvialis

Khả năng tích luỹ astaxanthin ở H pluvialis cũng bị phụ thuộc rất

nhiều vào những thông số môi trường sau [22]: Ánh sáng là yếu tố quan trọng

kích thích quá trình sinh tổng hợp carotenoit, đặc biệt là astaxanthin ở H.pluvialis Cường độ ánh sáng tối ưu cho tổng hợp - tích luỹ astaxanthin ở H.pluvialis dao động từ 75-100 klux Tuy nhiên khả năng sinh tổng hợp

carotenoit còn phụ thuộc vào chất lượng ánh sáng (dưới ánh sáng xanh hiệuquả hơn ánh sáng đỏ) Nhiệt độ: việc tổng hợp và tích luỹ astaxanthin tăng lêndần dần khi tảo được nuôi trồng ở điều kiện nhiệt độ cao Nhiệt độ tối ưu chosự tổng hợp astaxanthin là trên 30˚C [36; 15] Cuối cùng là các yếu tố dinh

dưỡng: Nguồn carbon và nitơ: Đối với H pluvialis, giới hạn nguồn nitơ là yếu

tố chìa khoá cho tổng hợp và tích luỹ astaxanthin [24]; Phospho: Trong điều

kiện thiếu hụt phosphate, H pluvialis có thể tích luỹ một lượng lớn

astaxanthin [19; 10]; Stress độ mặn: dưới điều kiện stress độ mặn, tích luỹastaxanthin trong bào nang xảy ra cả trong tối và ngoài sáng

1.5 Nguồn cung cấp astaxanthin:

1.5.1 Nguồn astaxanthin tổng hợp hoá học

Hiện nay, astaxanthin tổng hợp là nguồn cung cấp chủ yếu cho nuôitrồng thuỷ sản Hơn 95% astaxanthin tổng hợp trên thị trường được sử dụnglàm thức ăn, tạo ra các màu sắc khác nhau Dù vậy, nguồn astaxanthin này cógiá thành rất cao, không tinh khiết và tiềm ẩn nhiều sản phẩm phụ có nguy cơgây hại.

1.5.1 Các nguồn astaxanthin trong tự nhiên

Nguồn astaxanthin được tìm thấy trong nhiều đối tượng như từ phế liệugiáp xác thuỷ sản: (astaxanthin tập trung chủ yếu ở phần vỏ ngoài, chiếm 58-

87% carotenoit tổng số) [11], từ nấm men Phaffia rhodozyma [6], một số loạivi khuẩn như Mycobacterium lacticola, Brevibacterium sp và một số chủngnấm mốc thuộc chi Peniophora cũng có khả năng tích luỹ astaxanthin (khoảng

30 μg/l đến mg/l Một số dinh dưỡng vi lượngg/g TB) [14] Tuy nhiên hàm lượng astaxanthin tích lũy được lại ít, quátrình sinh trưởng – phát triển diễn ra chậm nên không thích hợp để sản xuất

trên quy mô công nghiệp Ngoài ra còn một nguồn cung cấp astaxanthin kháccó triển vọng hơn những đối tượng trên, đó là vi tảo: Astaxanthin có thể được

sản xuất từ nhiều loại vi tảo khác nhau như Ankitrodesmus branuii, Chlorellazofingiensis, Dunaliella salina, Chlamydomonas (<50 μg/l đến mg/l Một số dinh dưỡng vi lượngg/g TB) nhưng hàm

lượng astaxanthin ở những đối tượng này lại khá thấp và không thích hợp để

sản xuất thương mại Trong khi đó loại tảo lục Heamatococcus pluvialis đã thu

hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà nghiên cứu và sản xuất ứngdụng vì chúng có khả năng tích luỹ 1 lượng lớn astaxanthin (7.000-55.000 μg/l đến mg/l Một số dinh dưỡng vi lượngg/gTB, tương ứng 0,7-5,5% SKK) [37].

Trước đây, giá thành sản xuất vi tảo rất cao (khoảng 5-20 USD/kg

SKK) nên khó có thể sử dụng nguồn H pluvialis để sản xuất astaxanthin cho

mục đích thương mại Gần đây, nhờ sự phát triển mạnh mẽ các kĩ thuật, công

nghệ trong nuôi trồng vi tảo nên giá thành sản xuất H pluvialis đã giảm đáng

kể và làm cho loại vi tảo này thực sự trở thành một trong những nguồnastaxanthin tự nhiên quan trọng, có tiềm năng thương mại lớn nhất hiện nay.

1.6 Vai trò của Haematococcus pluvialis trong sản xuất astaxanthin

Trong nuôi trồng thuỷ sản H pluvialis được đánh giá là nguồn cung cấp

astaxanthin phù hợp, có giá thành thấp để cung cấp làm nguồn thức ăn cho cáhồi vì nó tổng hợp và tích luỹ được một lượng lớn astaxanthin Theo các tài

liệu đã công bố, để sinh khối tảo nuôi trồng có hàm lượng astaxanthin cao, H.pluvialis cần phải được nuôi cấy theo 2 pha liên tục Giai đoạn đầu gọi là giaiđoạn tăng sinh khối TB (Green Stage): H pluvialis được nuôi ở điều kiện thích

hợp cho sự sinh trưởng và phát triển để tăng sinh khối tối đa Giai đoạn này bắtđầu từ khi nuôi tảo trong nhà từ khuẩn lạc rồi tiếp tục nuôi ngoài trời trong cácphotobioreactor sử dụng năng lượng ánh sáng mặt trời Giai đoạn thứ hai là giaiđoạn kích thích sinh tổng hợp astaxanthin (Red Stage): sự tổng hợp astaxanthinđược kích thích bằng cách thay đổi điều kiện môi trường theo hướng bất lợi

(stress), chủ yếu là chiếu sáng với cường độ cao và thay đổi môi trường sinh

trưởng Theo đó, các TB H Pluvialis bắt đầu hình thành dạng nang bào, tổng

hợp, tích luỹ dần dần astaxanthin dưới dạng ester hoá Sau giai đoạn hai, hàmlượng astaxanthin trong TB tảo có thể đạt 4-6% TLK Khả năng tích lũy

astaxanthin của TB tảo H pluvialis phụ thuộc rất lớn vào mức độ bất lợi của

điều kiện nuôi trồng như: ánh sáng, chất dinh dưỡng… [22].

Tuy nhiên, nuôi trồng tảo H pluvialis hiện nay đang gặp rất nhiều khó

khăn Nguyên nhân chính là do tảo này có tốc độ sinh trưởng chậm và chu kìsống phức tạp, biểu hiện TB ở từng giai đoạn khác nhau là khác nhau nhưngnhững giai đoạn nêu trên đều chưa được làm sáng tỏ Ở Việt Nam, vi tảo lục

H.pluvialis là đối tượng nghiên cứu hoàn toàn mới, chưa có công trình nào

nghiên cứu đầy đủ về đối tượng này Trước tình hình đó, việc tiến hànhnghiên cứu để có thêm những hiểu biết về các đặc điểm chính trong chu trình

sống cũng như một số đặc điểm sinh học của loài tảo H pluvialis là rất cấp

thiết Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứuvòng đời của vi tảo lục Haematococcus pluvialis trong điều kiện phòngthí nghiệm”

PHẦN 2

VẬT LIỆU NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Chủng giống

Chủng tảo Heamatococus pluvialis Flotow (H pluvialis) phân lập tại

Hoà Bình, năm 2009 được nuôi cấy và lưu giữ trên môi trường C tại phòng

Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học ở 250C, dưới cường độ chiếu sáng2 klux với chu kỳ sáng tối 12 : 12 giờ.

2.1.2 Môi trường sử dụng trong quá trình nghiên cứu:

Môi trường được sử dụng trong toàn bộ quá trình nghiên cứu là hai môitrường C và RM theo công bố của Rudic, 2005 Thành phần môi trường C và

RM được chỉ ra ở bảng 1:

Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của môi trường C và RM được dùngtrong nghiên cứu

Thành phần môitrường

Môi trường

(mg/l)Thành phần môitrường

Môi trường(mg/l)

MgSO4.7 H2O 40 10 CuSO4.5 H2O - 0,08CaCl2 2 H2O - 58,5 Co(NO3)2.6 H2O - 0,26EDTA-Na2 2,71 - FeCl3.6 H2O 5,888 17

2.1.4 Máy móc và thiết bị:

- Pipetteman các loại (Gilson, France); Pipette Pasteur (USA); Pipettetự động; Tủ lạnh sâu -80oC (Sanyo, Japan); Cân kỹ thuật Precisa XB 1200C(max 1200 g; e= 0,1 g; min 0,5 g; d= 0,01 g) (Switzerland); Cân phân tích AY120 (Shimadzu, Japan) Shimadzu AY 120 (max 120g; d= 0,1mg); Máy đoOD UV 1601 (Shizuma, Japan); Máy ly tâm Sorvall Legen RT 1900W(Kendro, Germany); Kính hiển vi quang học Olympus CX21 (Japan); Máykhử trùng ALP (Japan); tủ sấy trọng lượng khô Gallenkamp (USA); buồngđếm Burker-Turk (Germany) ; máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY Digital 70(Japan); Máy đo pH Melter Toledo (Germany); máy nén khí, các loại cột lọckhí, màng lọc khí Satarious (Mỹ); các bình tam giác loại 250 ml, đều đượcsử dụng cho nuôi tảo.

- Các dụng cụ thông thường khác của phòng thí nghiệm phục vụ cho thínghiệm và nghiên cứu.

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu:

- Địa điểm: Phòng công nghệ Tảo, Viện Công nghệ Sinh học, ViệnKhoa học Công nghệ Việt Nam.

- Thời gian: 23/02/2011 đến 22/05/2011.

2.3 Phương pháp nghiên cứu:

2.3.1 Mô tả thí nghiệm vòng đời:

Chủng tảo Haematoccus pluvialis được nuôi trong môi trường C

khoảng 2-3 ngày, khi đó các TB chủ yếu ở trạng thái sinh dưỡng (khoảng 90% tổng số TB) Dịch này được ly tâm ở 6000 vòng/5 phút Loại bỏ phầndịch trên, thu cặn TB và bổ sung môi trường C và RM mới Lắc đều rồi chiadịch tảo vào 2 bình tam giác 250 ml chứa 150 ml dịch tảo/bình.

80-Thí nghiệm vòng đời được tiến hành ở 2 môi trường C và RM cấp độ

bình tam giác 250ml Thành phần môi trường C và RM được chỉ ra ở bảng 1.

Mỗi công thức môi trường tiến hành lặp lại 2 lần Mật độ TB ban đầu trong cáccông thức thí nghiệm là 6x104 TB/ml Các bình tam giác chứa dịch tảo đượcnuôi đến khi màu sắc dịch tảo chuyển từ màu xanh sang màu đỏ đậm Khi đó,lượng dịch này được ly tâm ở 6000vòng/5 phút và chuyển sang môi trường Cvà RM mới để nảy mầm trở lại Các bình tam giác thí nghiệm được nuôi quangtự dưỡng dưới điều kiện nhiệt độ 250C và chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang cócường độ chiếu sáng 2-3 klux với chu kỳ sáng tối 12:12 Trong 24 giờ đầu,mẫu được lấy 2 tiếng/lần Sau 24 giờ đầu tiên, lấy mẫu 2 ngày/lần, sau đó mẫusẽ được tiến hành xác định các thông số sinh trưởng của tảo

Vòng đời tự nhiên của tảo H.pluvialis trong hai môi trường C và RM

được xác định thông qua sự thay đổi hình thái TB, mật độ TB, hàm lượng sắctố (chlorophyll a, astaxanthin) và hàm lượng protein qua các giai đoạn sinhtrưởng khác nhau.

- Xác định hình thái TB: Quan sát TB tảo dưới kính hiển vi quang họcOLYMPUS CX21 (Nhật Bản) ở độ phóng đại 400 lần và chụp lại hình thái.Đo kích thước TB bằng phần mềm Map info.

- Mật độ TB: Mật độ TB tảo được đếm bằng buồng đếm hồng cầuBurker – Turk (Đức).

- Xác định sinh trưởng bằng phương pháp đo mật độ quang học (OD)tại bước sóng 680nm Phân tích hàm lượng sắc tố chlorophyll a và astaxanthintheo Strickland & Person.

- Phân tích hàm lượng protein được định lượng theo phương pháp Lowry.

2.3.2 Phương pháp xác định hình thái tế bào:

Hình thái TB được chụp bằng máy ảnh kỹ thuật số Canon IXY 7.0 củaNhật Bản ở điều kiện: dưới kính hiển vi quang học Olympus CX21 ở độphóng đại 400 lần và độ phóng đại của máy ảnh 3 lần.

Kích thước TB được đo bằng phần mềm MapInfo Professional 7.5: Sửdụng thước chuẩn để chụp ảnh chuẩn và tiến hành chụp ảnh TB cùng độphóng đại với ảnh chuẩn sau đó chuyển ảnh vào máy tính và sử dụng công cụđo khoảng cách trong phần mềm để xác định kích thước TB, công thức xácđịnh kích thước:

KT tb (ft): kích thước TB đo được trên ảnh bằng phần mềm.

KT tc (ft): kích thước đo được trên ảnh của đoạn thước chuẩn kíchthước thực tế là 25 µm.

2.3.3 Xác định tốc độ sinh trưởng của tảo bằng phương pháp đo mật độquang học (OD) tại bước sóng 680nm:

Mật độ TB tảo H.pluvialis trong môi trường có thể được xác định một

cách gián tiếp nhờ phương pháp đo mật độ quang học tại bước sóng 680nmtrên máy quang phổ (OD680) Theo phương pháp này, số lượng photon ánhsáng bị hấp thụ tỉ lệ thuận với lượng sinh khối TB trong mẫu đem đo (trừnhững mẫu có nồng độ tế bào quá đậm đặc), hay nói cách khác là trong nhữngđiều kiện sinh trưởng nhất định thì OD tỉ lệ thuận với mật độ TB Đối với

H.pluvialis mỗi lần đo, thu 3-5ml dịch tảo, đo OD ở bước sóng ánh sáng

680nm Trong quá trình đo, nếu giá trị OD > 1,0 thì cần pha loãng dịch tảosao cho OD luôn nhỏ hơn 1,0.

KT tb (ft) x 25 (µm)

KT tc (ft)