KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NẤM Botryodiplodia theobromae Pat VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA MỘT SỐ THUỐC TRỪ NẤM TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM

Hiện nay, diện tích cao su tại nước ta đã đươc mở rộng và được trồng độc canh trên nhiều vùng khác nhau nên bệnh hại càng trở nên nghiêm trọng, làm tăng chi phí phòng trừ bệnh gây thiệt

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

C ỦA NẤM Botryodiplodia theobromae Pat

VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA MỘT SỐ THUỐC TRỪ NẤM

TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM

Sinh viên th ực hiện: HỒ THỊ MINH TUYẾT Ngành: NÔNG HỌC

Niên khóa: 2008 - 2012

Tháng 07/2012

i

C ỦA NẤM Botryodiplodia theobromae Pat

VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA MỘT SỐ THUỐC TRỪ NẤM

TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM

Tác giả

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành Nông học

Giáo viên hướng dẫn:

ThS NGUYỄN ĐÔN HIỆU

Tháng 07 năm 2012

L ỜI CẢM ƠN

Lòng biết ơn sâu sắc của con đối với ba mẹ và gia đình đã chăm sóc, dưỡng

dục con nên người

Tôi xin chân thành cảm ơn:

báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam và Bộ môn Bảo vệ Thực

vật đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

TS Nguyễn Anh Nghĩa đã chỉ dẫn và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Th.S Nguyễn Đôn Hiệu đã trực tiếp hướng dẫn và truyền cho tôi nhiều kiến

thức quý báu giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Th.S Vũ Thị Quỳnh Chi, KS Nguyễn Ngọc Mai, KS Nguyễn Thị Thanh Trang và tất cả các cô chú, anh chị trong Bộ môn Bảo vệ Thực vật đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tại Bộ môn

Th.S Trần Văn Lợt, giáo viên hướng dẫn đề tài, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận

vui buồn với tôi trong suốt quá trình học và thực tập

Sinh viên thực hiện

Hồ Thị Minh Tuyết

iii

Hồ Thị Minh Tuyết, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

theobromae Pat và đánh giá hiệu lực của một số loại thuốc trừ nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm”

Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật (BVTV), Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam (VNC CS Việt Nam) nhằm nghiên cứu về đặc điểm hình thái

và xác định hiệu lực trừ nấm của 5 loại thuốc Amistar 250 SC, Sumi Eight 12.5 WP,

trường Đề tài được tiến hành với các nội dung:

Nghiên cứu đặc điểm hình thái của 20 mẫu phân lập (MPL) nấm B theobromae

được nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng Potato Dextrore Agar (PDA)

Đánh giá hiệu lực diệt nấm B theobromae của các loại thuốc theo phương

pháp đầu độc môi trường

Điều tra bệnh tại Nông trường Thuận Tân, Công ty TNHH MTV Cao su Bình Thuận, thực hiện điều tra trên 10 lô với 2 dvt là PB 235 và VM 515

Kết quả đạt được:

Kết quả có sự đa dạng về hình thái của 20 MPL sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng PDA:

BoGL25, BoKT24); nhanh (BoLK01, BoLK02, BoDN16, BoDN16, BoDN11, BoDN13, BoDN14, BoDN22, BoDN10, BoGL23); chậm

nấm phân bố đều và phân bố không đều tạo thành vòng đa góc và màu sắc của khuẩn lạc cũng được chia làm 6 nhóm chính: Xanh rêu đậm (BoLK02,

BoDN21, BoTN26, BoBP27, BoGL25); xanh rêu nhạt (BoDN05, BoDN06,

BoDN15, BoGL23); đen (BoTN04, BoDN10); xám đen (BoDN19, BoDN20); xám trắng (BoKT24)

MPL BoTN04 (chiều dài: 30,99 µm; chiều rộng: 17,35 µm) là lớn nhất, MPL BoLK01(chiều dài: 27,17µm; chiều rộng: 13,61 µm) có kích thước bào tử nhỏ nhất và kết quả này phù hợp với những nghiên cứu của Punithalingam (1976)

Các thuốc thí nghiệm Sumi Eight 12.5 WP (ED50: 0,4167 ppm a.i.), Folicur

250 EW (ED50: 0,4606 ppm a.i.), Vicarben 50 HP (ED50: 0,5058 ppm a.i.) và Score

250 EC (ED50: 0,6072 ppm a.i.) đều có hiệu lực diệt nấm B theobromae cao ở diều

kiện phòng thí nghiệm Trong khi đó, thuốc Amistar 250 SC không có hiệu lực diệt nấm này trong cùng điều kiện

Kết quả điều tra tình hình bệnh Botryodiplodia trên một số vườn cây cao su dòng vô tính VM 515 và PB 235 của Nông trường Thuận Tân cho thấy đều bị nhiễm bệnh với mức độ nhẹ đến nặng phụ thuộc vào điều kiện của vườn Trong đó,

v

TRANG TỰA i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ x

Chương 1 GIỚI THIỆU CHUNG 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích đề tài 2

1.3 Yêu cầu đề tài 2

1.4 Giới hạn đề tài 3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Sơ lược về cây cao su 4

2.1.1 Lịch sử phát hiện cây cao su 4

2.1.2 Tình hình sâu bệnh hại 5

2.2 Sơ lược về nấm Botryodiplodia theobromae Pat 5

2.2.1 Phân loại 5

2.2.2 Lịch sử phát hiện 6

2.2.3 Tình hình phân bố, phổ ký chủ và khả năng gây bệnh 6

2.2.4 Đặc điểm nấm B theobromae 8

2.2.4.1 Hình thái 8

2.2.4.2 Sinh lý 9

2.2.5 Khả năng gây bệnh, sự lây lan và khả năng tồn tại 10

2.3 Sơ lược về bệnh trên cây cao su do nấm B theobromae gây ra 10

2.3.1 Lịch sử phát triển và tác hại của bệnh 10

2.3.2 Triệu chứng nhận biết 11

2.3.3 Biện pháp phòng trừ 14

2.4 Thuốc phòng trừ bệnh 14

2.4.1 Một số hoạt chất trừ nấm 14

2.4.1.1 Carbendazim 14

2.4.1.2 Azoxytrobin 15

2.4.1.3 Diniconazole 15

2.4.1.4 Tebuconazole 16

2.4.1.5 Difenoconazole 17

2.4.2 Một số thuốc bảo vệ thực vật sử dụng trong đề tài 17

2.4.2.1 Vicarben 50 HP (carbendazim) 17

2.4.2.2 Amistar 250 SC (azoxystrobin) 17

2.4.2.3 Sumi eight 12.5 WP (diniconazole) 18

2.4.2.4 Score 250 EC (difenoconazole) 18

2.4.2.5 Folicur 250 EW (tebuconazole) 19

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

3.2 Đối tượng nghiên cứu 20

3.3 Nội dung nghiên cứu 20

3.4 Dụng cụ và vật liệu 20

3.5 Phương pháp nghiên cứu 21

3.5.1 Phương pháp lấy mẫu và phân lập mẫu 21

3.5.2 Khảo sát đặc tính sinh học của một số MPL nấm B theobromae 21

3.5.3 Đánh giá hiệu lực của một số hoạt chất phòng trừ nấm B theobromae gây bệnh trên cây cao su theo phương pháp đầu độc môi trường 22

3.5.4 Điều tra bệnh ngoài đồng 24

3.6 Xử lý số liệu 25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả phân lập nấm B theobromae: 26

4.2 Phương pháp tách đơn bào tử B theobromae: 26

4.3 Kết quả thí nghiệm hiệu lực của một số hóa chất phòng trừ nấm B theobromae theo phương pháp đầu độc môi trường 38

4.4 Kết quả điều tra: 44

vii

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Đề nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 53

DANH SÁCH CÁC CH Ữ VIẾT TẮT

a.i.: Hoạt chất (Active ingredient)

BVTV: Bảo vệ Thực vật

B theobromae: Botryodiplodia theobromae Pat

Công ty TNHH MTV Cao su Bình Thuận: Công ty Trách Nhiệm Hữu Hạn Một Thành Viên Cao su Bình Thuận

HTNN: hoàn toàn ngẫu nhiên

IRSG (irsg international rubber study group): Tổ chức Nghiên cứu Cao su Thế giới KTCB: Kiến thiết cơ bản

NCBI: National Center for Biotechnology Information

nsc: Ngày sau cấy

PDA: Potato Dextrose Agar

ppm: part per million

PSA: Potato Sucrose Agar

TLB: Tỷ lệ bệnh

USD: United States Dollar

% ức chế: Phần trăm ức chế

Bảng 4.1: Đường kính và tốc độ phát triển khuẩn lạc của 20 MPL nấm B

theobromae trên môi trường dinh dưỡng PDA 30

Bảng 4.2: Màu sắc, hình dạng và phân bố khuẩn lạc nấm B theobromae trên môi

trường dinh dưỡng PDA sau 7 ngày cấy 31

Bảng 4.3: Kích thước bào tử nấm B theobromae 37 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của các loại thuốc đến sự phát triển khuẩn lạc nấm B

theobromae 38

Bảng 4.5: Phương trình tương quan 43 Bảng 4.6: chỉ số ED50(ppm a.i) của 5 loại thuốc dùng trong thí nghiệm 43

Bảng 4.7: Mức độ nhiễm bệnh do nấm B theobromae trên các dvt cao su tại Nông

trường Thuận Tân, Công ty TNHH MTV Cao su Bình Thuận 45

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 2.1: Hình thái nấm B theobromae (Punithalingam, 1976) 9

Hình 2.2: Triệu chứng bệnh trên vườn stump 13

Hình 2.3: Triệu chứng bệnh trên vỏ xanh 13

Hình 2.4: Triệu chứng bệnh trên cây có vỏ hóa nâu 13

Hình 3.1: Kiểu hình chéo góc 24

Hình 3.2: Kiểu hình bậc thang 24

Hình 4.1: Triệu chứng bệnh do nấm B theobromae trên cây cao su 26

Hình 4.2: Khuẩn lạc và bào tử nấm B theobromae phân lập trên môi trường PDA 29 Hình 4.3: Kích thước bào tử nấm B theobromae 36

Hình 4.4: Khuẩn lạc nấm B theobromae sau 6 ngày cấy 41

Hình 4.5: Triệu chứng bệnh do nấm B theobromae gây ra 46

Hình 4.6: Một số hình ảnh khác 46

Đồ thị 4.5: Tương quan giữa nồng độ a.i của các loại thuốc và mức độ ức chế nấm B theobromae sau 6 ngày 42

1

Ch ương 1

1.1 Đặt vấn đề

Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell Arg.) có nguồn gốc từ lưu vực sông

Amazon, Nam Mỹ được du nhập vào châu Á từ năm 1876 và trồng gần 11 triệu ha ở nhiều nước, chủ yếu ở các vùng nhiệt đới Sau hơn 100 năm tồn tại và phát triển, từ những lợi ích thiết thực năm 2008 cây cao su đã được công nhận là cây trồng đa mục đích Cao su đã thực sự trở thành một loại cây công nghiệp có vị trí quan trọng trong đời sống kinh tế và xã hội ở nước ta, đóng góp một nguồn ngoại tệ rất lớn thông qua xuất khẩu nguyên liệu, tạo công việc và nâng cao đời sống của hàng triệu người dân lao động, đồng thời góp phần tích cực vào cải tạo môi trường sinh thái

Hiện nay, diện tích cao su tại nước ta đã đươc mở rộng và được trồng độc canh trên nhiều vùng khác nhau nên bệnh hại càng trở nên nghiêm trọng, làm tăng chi phí phòng trừ bệnh gây thiệt hại đến kinh tế và đời sống xã hội của con người, cho nên công tác BVTV ngày càng đóng vai trò cần thiết

ở nước ta vào năm 1921, gây bệnh chết lại ở giai đoạn kiến thiết cơ bản (KTCB)

kết quả nghiên cứu người ta cho rằng bệnh chỉ xuất hiện rải rác và gây h ại không đáng kể Năm 1998, dịch bệnh bùng phát trên vườn cây cao su tại Công ty Cao su Dầu Tiếng, gây hại trên vườn cây KTCB và vườn cây khai thác (KT) Hiện nay,

bệnh đã gây hại trên tất cả các giai đoạn của cây cao su từ vườn ương, vườn nhân, vườn KTCB đến vườn KT làm chậm sinh trưởng, chết cây, giảm chất lượng và sản lượng mủ

su, biện pháp hóa học đem lại hiệu quả cao nhất Hiện nay trên thị trường xuất hiện rất nhiều hoạt chất và thuốc phòng trị bệnh khác nhau có hiệu lực và giá thành khác

nhau Chính vì vậy, đề tài “Khảo sát đặc điểm sinh học của nấm Botryodiplodia

theobromae Pat và đánh giá hiệu lực của một số loại thuốc trừ nấm trong điều

ki ện phòng thí nghiệm” được thực hiện để tìm ra các loại thuốc vừa có hiệu quả

kinh tế vừa có hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh cao và đồng thời tránh việc sử dụng một loại hoạt chất trong thời gian dài gây ra hiện tượng hình thành nòi kháng thuốc

1.2 Mục đích đề tài

Nắm được đặc điểm sinh học của một số mẫu phân lập (MPL) nấm B

theobromae lấy từ một số nguồn khác nhau

Xác định hiệu lực của một số thuốc có hoạt chất như: difenoconazole,

azoxystrobin, diniconazole, tebuconazole và thuốc có hoạt chất carbendazim đối với nấm B theobromae gây bệnh trên cây cao su bằng phương pháp đầu độc môi

trường

Đánh giá được mức độ gây hại của bệnh nứt vỏ xì mủ do nấm B theobromae

trên Nông trường Thuận Tân thuộc Công ty Trách Nhiệm Hữu Hạn Một Thành Viên Cao su Bình Thuận (Công ty TNHH MTV Cao su Bình Thuận)

1.3 Yêu cầu đề tài

Nhận biết được triệu chứng và chỉ số cấp bệnh do nấm B theobromae gây

hại trên cây cao su

Khảo sát một số đặc điểm hình thái của 20 MPL nấm lấy từ nhiều nguồn bệnh khác nhau trên môi trường dinh dưỡng PDA

Nắm vững một số thao tác trong phòng thí nghiệm như: cách phân lập nấm, nuôi cấy nấm, tách đơn bào tử nấm, pha môi trường dinh dưỡng, pha thuốc

Khảo nghiệm hiệu lực của một số thuốc có hoạt chất như: difenoconazole,

azoxystrobin, diniconazole, tebuconazole và thuốc có hoạt chất carbendazim đối với nấm B theobromae gây bệnh trên cây cao su bằng phương pháp đầu độc môi

trường

Điều tra mức độ gây hại của bệnh nứt vỏ xì mủ do nấm B theobromae trên

Nông trường Thuận Tân thuộc Công ty TNHH MTV Cao su Bình Thuận

3

1.4 Giới hạn đề tài

Đề tài được giới hạn thực hiện từ tháng 2 – 7/2012 và việc điều tra bệnh chỉ tiến hành trong tháng 6 tại Nông trường Thuận Tân thuộc Công ty TNHH MTV Cao su Bình Thuận

Chương 2

2.1 Sơ lược về cây cao su

2.1.1 Lịch sử phát hiện cây cao su

Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell Arg.) là cây công nghiệp lấy mủ thuộc

có vĩ độ từ 150 Nam đến 60 Bắc, và từ 460 đến 770 kinh tây Đây là vùng có đầy đủ các điều kiện khí hậu, điều kiện tự nhiên thích hợp nhất cho cây cao su với lượng mưa hàng năm trên 2000 mm, nhiệt độ cao quanh năm, có mùa khô hạn kéo dài 3 –

4 tháng, đất thuộc loại đất sét tương đối giàu dinh dưỡng, có độ pH từ 4,5 đến 5,5

và có tầng đất canh tác sâu, thoát nước trung bình (Nguyễn Thị Huệ, 2007)

Cây cao su được tìm thấy sau cuộc thám hiểm của Christopher Columbus đến Châu Mỹ năm 1492 Ngày nay, người ta cho rằng cao su là cây cho mủ tốt và đem lại hiệu quả kinh tế cao nhất trong họ thầu dầu Mãi cho đến cuối thế kỷ 19, Brazil vẫn là nước độc quyền cung cấp mủ cao su thiên nhiên trên thế giới từ những vườn cây hoang dại trong rừng Về sau khi nhu cầu của người sử dụng ngày càng tăng cùng với việc nhận thấy các điều kiện tự nhiên và khí hậu ở Châu Á, đặc biệt là các nước trong khu vực Đông Nam Á rất thích hợp cho sự phát triển của cây cao su nên vào năm 1876 cây cao su đã du nhập vào Châu Á và trồng gần 11 triệu ha ở nhiều nước

Tại Việt Nam, cây cao su du nhập từ năm 1897 bởi bác sĩ Yersin và đến đầu

thế kỷ 20 được trồng thành đồn điền tại Đông Nam Bộ, đến thập niên 50 một số diện tích cao su cũng định hình tại Tây Nguyên Tiếp theo mở rộng ra miền Trung và vươn đến phía Bắc Hiện nay, diện tích cao su tại nước ta đạt khoảng 834.200 ha được trồng trên nhiều vùng khác nhau, góp phần không nhỏ vào lợi ích nước nhà

Bệnh trên cây cao su tại Việt Nam chủ yếu là do nấm gây ra, chưa có một ghi

Nguyên Khang và cs (1979) đã trích dẫn tài liệu của Dyakova G.A (1969) cho biết cây cao su bị 27 loại bệnh, tùy vào vị trí bị hại mà chia ra thành các nhóm: 14 bệnh về lá, 8

bệnh thân cành và 5 bệnh về rễ Trong đó, các loại bệnh chính gây ảnh hưởng trực tiếp

đến sinh trưởng và sản lượng cây cao su trong nước bao gồm bệnh phấn trắng (Oidium

heveae), b ệnh héo đen đầu lá (Colletotrichum gloeosporioides), bệnh rụng lá mùa mưa

(Corticium salmonicolor), b ệnh loét sọc mặt cạo (Phytophthora palmivora), bệnh nứt

vỏ (Botryodiplodia theobromae), và bệnh rễ nâu (Phellinus noxius)

2.2 Sơ lược về nấm Botryodiplodia theobromae Pat

2.2.2 L ịch sử phát hiện

Nấm B theobromae phân bố rộng ở khu vực khí hậu nhiệt đới và được ghi nhận

là loại nấm ký sinh có khả năng gây bệnh trên nhiều cây ký chủ Nấm được mô tả đầu tiên bởi Patouillard vào năm 1892 (Griffiths, 1966) Đến năm 1895, đã có báo cáo đầu tiên ghi nhận nấm là tác nhân gây bệnh chết lại trên cây ca cao ở Cameroon (Mbenoun

và cs, 2008) Từ đó, nấm xuất hiện và phát triển nhanh chóng qua nhiều quốc gia, gây

hiện tượng chết lại trên xoài, chuối, cam, quýt và nhiều cây trồng khác ở Malaysia, Pakistan, Srilanka, Bangladesh và Indonesia Năm 2008, đã có báo cáo đầu tiên về sự

xuất hiện của nấm trên cây mít tại Đài Loan Nấm cũng được ghi nhận là nguyên nhân gây bệnh thối trái trên xoài, đu đủ và chuối tại quốc gia này (Michael, 2008)

Năm 1954, Zambettakis đã có công trình nghiên cứu về những tên gọi khác

nhau như: Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griff & Maubl., 1909; Diplodia

theobromae (Pat.) Nowell, 1923; Diplodia gossypina Cooke, 1879; Diplodia cacaoicola Henn, 1895; Macrophoma vestita Prill & Delacr., 1894; Lasiodiplodia tubericola Ellis & Everh., 1896; Diplodia tubericola (Ellis & Everh.) Taub., 1915; Botryodiplodia tubericola (Ellis & Everh.) Petrak, 1923; Botryodiplodia gossypii Ellis

& Barth., 1902; Botryodiplodia elasticae Petch, 1906; Chaetodiplodia grisea Petch, 1906; Lasiodiplodia nigra Appel & Laubert, 1906; Diplodia rapax Massee, 1910;

Diplodia natalensis Pole Evans, 1911; Lasiodiplodia triflorae Higgins, 1916; Diplodia ananassae Sacc., 1917; Botryodiplodia ananassae (Sacc.) Petrak, 1929

(Punithalingam, 1976)

2.2.3 Tình hình phân b ố, phổ ký chủ và khả năng gây bệnh

Nấm B theobromae phân bố khắp nơi trên thế giới, nhưng chủ yếu giới hạn ở

khu vực vĩ tuyến 40o Bắc đến 40o

Nam

loại cây trồng khác nhau Theo Goss Roger và cs (1961), một số ký chủ của nấm là cây trồng quan trọng được nhiều tác giả ghi nhận và nghiên cứu như trên cam (Nowell, 1923; Pole-Evans, 1910), cao su (Cook, 1913; Petch, 1921), chè (Cook, 1913; Johnston, 1960), ca cao (Charles, 1906; Cook, 1913; Griffon và Maublanc, 1909; Petch, 1921; Urquhart, 1961), mía đường (Howard, 1901; Nowell, 1923), bông vải

7

(Johnston, 1960; Patouillard, 1922), cọ dầu (Johnston, 1960; Zambettakit, 1950), xoài (Charles, 1906; Zambettakit, 1950), cà phê (Massee, 1909; Riley, 1960), đu đủ (Petch, 1921; Zambettakit, 1950), điều (Riley, 1960), thuốc lá (Averna-Sacca, 1922) đậu phộng (Wilson, 1947) và chuối (Wardlaw,1935)

Một số ghi nhận về khả năng gây bệnh của nấm trên cây trồng ở một số nước như:

• Ở Ghana: Nấm gây hại gây bệnh đốm lá trên cà phê, thối thân chuối, thối trái cam quít, thối củ sắn, thối trái cacao, thán thư cọ dầu, thối rễ dứa, thối thân cây mía, thối củ khoai lang và ngoài ra còn gây hại trên một số cây trồng khác (Triwiratno và

cs, 2004)

• Ở Pakistan: Nấm được phát hiện trên hơn 50 loại cây trồng khác nhau, gây hiện tượng chết lại trên xoài, xì mủ trên thân và thối trái (Muhammad và cs, 2006)

bởi bệnh chết lại do nấm Lasiodiplodia theobromae (hay còn gọi là B theobromae)

Bệnh đã được ghi nhận trên tất cả vườn sản xuất, 100% các trang trại trồng ca cao ở Cameroon đều bị nấm bệnh tấn công Nấm còn có khả năng gây hại trên nhiều bộ phận

khác như cành non, vỏ cây và quả ca cao (Mbenoun và cs, 2008)

• Ở Ấn Độ: Kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học ở Ấn Độ đã tiến hành nghiên cứu về tình hình bệnh hại trên các loại cây ăn quả cho thấy, nấm B theobromae

có khả năng gây thiệt hại nặng về kinh tế trên cây chuối, làm giảm sút việc thu hoạch

Do đó, đã có nhiều báo cáo ghi nhận nấm B theobromae là nguyên nhân gây bệnh thối

trên chuối, nhưng cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu chi tiết nào được tiến hành và

bệnh hại vẫn tiếp tục gia tăng ở quốc gia này (Williamson và cs, 1965)

cây cao su nhưng gây hại không đáng kể Ở Philipine nấm tấn công trên vườn cây

trồng mới gây hiện tượng chết lại, trên vườn KTCB và KT gây xì mủ

1921, gây bệnh chết lại ở giai đoạn KTCB Barat (1931) cho biết, nấm gây hại trên cổ

rễ stump trong vườn ương Năm 1998, dịch bệnh bùng phát trên vườn cây cao su tại

theo kết quả điều tra nấm B theobromae của ở Nông trường Bình Lộc, Tổng Công ty

Cao su Đồng Nai cho thấy trên các dvt PB 235, PB 260, VM 515, RRIV 4 đều bị nhiễm bệnh trong đó VM 515 là dòng vô tính mẫn cảm nhất Hiện nay, bệnh đã gây

hại trên tất cả các giai đoạn của cây cao su từ vườn ương, vườn nhân, vườn KTCB đến vườn KT làm chậm sinh trưởng, chết cây, giảm chất lượng và sản lượng mủ

2.2.4 Đặc điểm nấm B theobromae

2.2.4.1 Hình thái

Khuẩn lạc nấm trên môi trường yến mạch (Oat Agar) có màu từ xám nâu đến màu xám lông chuột hoặc màu đen, trên bề mặt phủ một lớp sợi nấm mịn và dày như lông tơ, mặt đáy có màu đen đến đen sậm Túi bào tử phấn (Pycnidia) ở dạng đơn hoặc phức hợp, thường kết hợp thành khối, bên trong chứa thể nền, có miệng nhỏ và nhiều lông cứng, túi bào tử phấn có khi rộng đến 5 mm Cuống bào tử đính (Conidiophores) trong suốt, đơn bào, thỉnh thoảng có vách ngăn, hình trụ ít khi phân nhánh, phát sinh từ những lớp bên trong của các tế bào nằm ở khoang hình trụ Những tế bào sản sinh bào

tử (Conidiogenous cells) trong suốt, dạng đơn, hình trụ đến hình hơi giống quả lê ngược, phân cắt hoàn toàn, có phân đốt Bào tử đính lúc đầu ở dạng đơn bào, trong suốt, bề mặt có nhiều hạt nhỏ, dạng hơi giống hình trứng đến hình elip thuôn, vách tế bào dày, đế ngắn Khi trưởng thành bào tử đính có một vách ngăn ở giữa, màu vỏ quế đến nâu vàng, thường có nhiều sọc dài theo chiều dọc, chiều dài bào tử biến thiên từ

20 – 30 µm và chiều rộng biến thiên từ 10 – 15 µm Sợi nấm vô tính trong suốt, hình trụ đôi khi có vách ngăn, dài khoảng 50 µm Túi bào tử phấn trên lá, thân cây và quả ở dạng tìm ẩn, về sau xuất hiện đột ngột, ở dạng đơn hoặc tập hợp thành nhóm, rộng 2 –

4 mm, có miệng nhỏ, thường có nhiều lông mịn với vô số bào tử đính nằm trong một khối màu đen (Punithalingam, 1976)

9

Hình 2.1: Hình thái nấm B theobromae (Punithalingam, 1976)

A, B: Túi bào tử phấn, C: Những tế bào sản sinh bào tử, D: Bào tử đính

2.2.4.2 Sinh lý

Sự thay đổi nhiệt độ giữ vai trò quan trọng và có ảnh hưởng lớn đến khả năng

sinh trưởng cũng như hình thành bào tử của nấm B theobromae Theo Shahidul và cs

(2001), có mối quan hệ chặt chẽ giữa tốc độ phát triển của sợi nấm và nhiệt độ Ở nhiệt

và trong suốt Về sau, sợi nấm phát triển nhanh dần và bắt đầu chuyển sang màu nâu

sậm do có sự sản xuất sắc tố melanin Ở nhiệt độ 28o

phát triển khoảng 1 mm/giờ

Ánh sáng ảnh hưởng không nhiều đến quá trình sinh trưởng của nấm B

theobromae Tuy nhiên, trong điều kiện chiếu sáng liên tục, đường kính khuẩn lạc và

số lượng bào tử đạt cao nhất (90 mm và 112 bào tử/0,01 ml) Bào tử hình thành ít nhất trong điều kiện bóng tối liên tục (24 bào tử/0,01 ml) và kích thước khuẩn lạc trung bình là 78 mm (Shahidul và cs, 2001)

Số lượng bào tử và tốc độ phát triển của sợi nấm trên các môi trường khác nhau

có sự biến thiên lớn Theo Shahidul và cs (2001), bào tử nấm hình thành trên môi trường Czapek’ s nhiều hơn trên các môi trường PDA, PCM và Richard’ s, sợi nấm không phát triển trên môi trường Sabouraud’ s Trong đó, khuẩn lạc có nhiều sắc tố nhất đối với môi trường PDA (75% màu đen và 25% màu trắng), ngược lại ít hình

Muhammad và cs (2006), trong các môi trường PSA (potato sucrose agar), WA (water agar), CZA (Czapek’ s Dox agar), CMDA (corn mealdextrose agar), PCA (potato carrot agar), CMA (corn meal agar) và YEMA (Yeast Extract Manitol Agar) thì 3 môi

trường PSA, CMDA và YEMA là thuận lợi nhất cho sợi nấm B theobromae phát

triển Ở nhiệt độ 30 oC, khuẩn lạc nấm trên 3 môi trường này đã mọc đầy đĩa petri chỉ

nhất, PCA và CMA có số lượng túi bào tử phấn ít hoặc không có

2.2.5 Khả năng gây bệnh, sự lây lan và khả năng tồn tại

qua vỏ cây và có khả năng sống tiềm sinh nếu gặp điều kiện môi trường bất lợi Ngoài

(Phan Thành Dũng, 2004), gây các bệnh thối thân, vỏ, củ, rễ, gây hại trên lá gây bệnh thán thư, đốm lá, triệu chứng phổ biến thấy trên thân là xì mủ và vỏ nổi nhiều vết mụn

nhỏ (Trần Ánh Pha, 2009)

theobromae phát tán nhờ gió và nước Hạt giống của một số cây như: Ca cao, bông

vải, đậu phộng, sơn trà Nhật Bản, chuối, cao su cũng là nơi lưu giữ nguồn bệnh Ngoài

ra, bào tử đính còn có thể lưu tồn trong đất và được lan truyền nhờ côn trùng Bào tử đính có thể lưu tồn trên hạt giống khoảng 4 tháng và sợi nấm có khả năng tồn tại đến 1 năm

2.3 Sơ lược về bệnh trên cây cao su do nấm B theobromae gây ra

2.3.1 L ịch sử phát triển và tác hại của bệnh

Ở Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia: Nấm B theobromae còn được ghi nhận trên

cây cao su nhưng gây hại không đáng kể Ở Philipine nấm tấn công trên vườn cây

trồng mới gây hiện tượng chết lại, trên vườn KTCB và KT gây xì mủ

11

Ở Việt Nam: Nấm B theobromae được Vincens phát hiện trên cây cao su năm

1921, gây bệnh chết lại ở giai đoạn KTCB Barat (1931) cho biết, nấm gây hại trên cổ

rễ stump trong vườn ương Nhưng bệnh chỉ xuất hiện rải rác và gây hại không đáng kể Đến năm 1998, dịch bệnh bùng phát trên vườn cây cao su tại Công ty Cao su Dầu Tiếng, gây hại trên vườn cây KTCB và vườn cây KT

đáng kể trong các tháng mùa mưa (từ tháng 6 đến tháng 11) trên tất cả các giai đoạn của cây cao su:

• Vườn ương: Gây hại tại vị trí mắt ghép bắt đầu vào thời điểm mở băng, dẫn đến hiện tượng chết lại mắt ghép hay chết toàn bộ chồi

chết lại mắt ghép

thể gây chết cây

vùng Đông Nam Bộ, bị nặng ở một số Công ty Cao su như: Bình Long gây hại trên vườn ương và vườn cây trồng mới gây chết mắt ghép, chết chồi trên dvt PB 260 và RRIV4; Tây Ninh trên vườn cây KTCB dvt RRIV4; Phước Hòa gây hại trên stump

trên vườn cây KT dvt PB 235 và VM 515; Phú Riềng gây hại trên vườn cây KTCB dvt

2.3.2 Triệu chứng nhận biết

Vườn stump trần : Nấm bệnh tấn công gốc ghép xuất hiện những nốt mụn nhỏ màu nâu bệnh nặng hơn thì các vết này kết lại với nhau làm vỏ sần sùi, ít nhựa và khó bóc vỏ khi ghép gây ảnh hưởng đến tỷ lệ sống Bệnh xuất hiện tại vị trí mắt ghép , bắt đầu vào thời điểm mở băng, gây ra hiện tượng chết lại mắt ghép

Stump bầu và vườn tái canh – Trồng mới: Bệnh xuất hiện trên chồi có triệu chứng ban đầu với vết lõm có màu đậm hơn, sau đó lan rộng và chết khô toàn bộ, vỏ bị chết xuất hiện những đốm nhỏ màu đen chứa nhiều bào tử Phần gỗ bị chết có màu

trắng với những vân nhỏ màu nâu đen (là khuẩn ty xâm nhiễm vào gỗ ), vỏ chết khó tách khỏi gỗ

Vườn nhân: Xuất hiện những nốt mụn nhỏ trên vỏ xanh nâu, sau đó liên kết lại với nhau làm khó bóc vỏ khi ghép và ít nhựa gây ảnh hưởng đến tỷ lệ sống Đây là nguồn nấm có thể lây lan sang gốc ghép

Vườn cây KTCB (1 – 2 năm tuổi trên vỏ xanh nâu ): Trên chồi với vết nứt có dạng hình thoi nặng hơn vết bệnh sẽ phát triển theo hướng lên trên và xuống dưới , tại vết bệnh có hiện tượng mủ rỉ ra sau đó bị hóa đen do hiện tượng oxy hóa , phần vỏ và

gỗ bị khô và xốp Khi vết bệnh lan rộng , tán lá non sẽ khô và héo rũ nhưng không rụng, trên phần vỏ bị chết xuất hiện những đốm có màu nâu đen chứa nhiều bào tử

Vườn cây từ 3 năm tuổi trở lên (vỏ hoá nâu ) và vườn cây KT: Ban đầu xuất hiện những nốt mụn nhỏ 1 – 2 mm, sau đó lan ra toàn bộ thân cành Các nốt này liên kết lại tạo các vết nứt trên vỏ , đôi khi có mủ rỉ ra từ những vết nứt Lớp biểu bì bên ngoài dày do nhiều lớp tạo thành Cây bị nhiễm bệnh nặng gây nứt vỏ trên thân , cành

và phần vỏ sát gốc bị thối Cây chậm phát triển, vỏ nguyên sinh bị u lồi, bề mặt gồ ghề nên không thể mở cạo hoặc có thể gây chết cây Trên vườn KT bệnh làm giảm sản lượng, nếu kéo dài sẽ dẫn đến khô miệng cạo (Trần Ánh Pha, 2009)

13

Hình 2.2: Triệu chứng bệnh trên vườn stump

Hình 2.3: Triệu chứng bệnh trên vỏ xanh

Hình 2.4: Triệu chứng bệnh trên cây có vỏ hóa nâu

2.3.3 Bi ện pháp phòng trừ

Với diện tích trồng cây cao su theo hướng độc canh ngày càng mở rộng do nhu

cầu của con người và giá tri kinh tế cao su ngày càng tăng mạnh, vấn đề bệnh hại trên cây cao su đã, đang và sẽ là mối quan tâm lớn nhất, vì bệnh không những làm kéo dài thời gian KTCB mà còn ảnh hưởng đến sản lượng và chất lượng mủ đối với vườn cây

đang KT Các nghiên cứu về bệnh do nấm B theobromae trên cây cao su còn r ất hạn

chế, một số nghiên cứu trước đây do VNC CS Việt Nam thực hiện chỉ tập trung vào việc ứng dụng thuốc bảo vệ thực vật để phòng trừ bệnh trong thời gian thí nghiệm

ngắn

Năm 1999, VNC CS Việt Nam đã kết hợp với Công ty Cao su Dầu Tiếng tiến hành thử nghiệm một số loại thuốc trên vườn cây KTCB và KT ở Nông trường Đoàn Văn Tiến đã chọn ra được một số công thức khuyến cáo đưa vào quy trình kỹ thuật của

chất carbendazim có thể dùng để phòng trừ hiệu quả bệnh do nấm B theobromae gây

WP nồng độ 0,5% (Phan Thành Dũng, 2004) Đến năm 2007, VNC CS Việt Nam phối

HP nồng độ 0,5% + BDNH 2000 nồng độ 1%; (2) Anvil 5 SC nồng độ 0,5% + BDNH

Hiện nay một số công thức thuốc được cho là tối ưu và được sử dụng nhiều nhất trong việc phòng trị nấm B theobromae như: carbendazim (Vicarben 50HP,

(Arivit 250SC, Vixazol 275SC) nồng độ 0,5% Các loại thuốc trên cần phối hợp với

thân cây 2 - 3 lần với chu kỳ 2 tuần/lần

có thể kết hợp với nhiều loại thuốc trừ sâu bệnh khác (Phạm Văn Biên và cs, 2005)

Nhóm hóa học: Triazole

Tính chất: Thuốc kỹ thuật dạng bột rắn, màu xám Điểm nóng chảy 134 –

1560C Tan ít trong nước (4,01%), tan trong nhiều dung môi hữu cơ như xylen, acetone, methanol, chloroform Tương đối bền vững dưới tác dụng của ánh sáng và nhiệt độ

Nhóm độc II, LD50 qua miệng 474 - 639 mg/kg, LD50 qua da 5000 mg/kg Tương đối độc với cá, ít độc với ong Thời gian cách ly là 7 ngày

Thuốc trừ nấm có tác động nội hấp, phổ tác dụng rộng và hiệu lực cao với nhiều loại nấm

Khi sử dụng có thể pha chung với nhiều thuốc trừ sâu, trừ bệnh khác

Nhóm độc III, LD50 qua miệng > 2000 mg/kg, LD50 qua da > 5000 mg/kg Ít độc với cá, không độc với ong.Thời gian cách ly là 7 ngày

Là thuốc trừ nấm nội hấp, phổ tác dụng rộng, hiệu quả với nhiều loại nấm

đối độc với cá , ít độc với ong Thời gian cách ly là 7 ngày

Thuốc trừ nấm, có tác động nội hấp Phổ tác dụng rộng, phòng trừ nhiều nấm thuộc lớp nang khuẩn, đảm khuẩn và nấm bất toàn

Thuốc có dạng hỗn hợp với Propiconazole (Tilt super), khi sử dụng có thể pha

chung với nhiều thuốc trừ sâu, trừ bệnh khác

2.4.2 M ột số thuốc bảo vệ thực vật sử dụng trong đề tài

2.4.2.1 Vicarben 50 HP (carbendazim)

Sản phẩm của Công ty Cổ phần Thuốc sát trùng Việt Nam

Thành phần hoạt chất: carbendazim (500 g/l) Nhóm hóa học: carbamate

Khuyến cáo sử dụng: Vicarben 50 HP là thuốc trừ nấm có tác dụng lưu dẫn Thuốc có phổ tác dụng rộng, phòng trừ hữu hiệu nhiều bệnh hại cây trồng Thuốc được đăng ký trừ bệnh thán thư trên xoài, đốm vằn trên lúa Thuốc được sử dụng với liều lượng 0,4 – 0,6 l/ha và nồng độ 0,1 – 0,15% Thời gian cách ly của thuốc là 7 ngày

2.4.2.2 Amistar 250 SC (azoxystrobin)

Sản phẩm của công ty Syngenta và được phân phối bởi công ty thuốc Bảo Vệ Thực Vật An Giang

Thành phần hoạt chất: azoxystrobin (250 g/l) Nhóm hóa học: Strobilurin

bệnh trước khi xâm nhiễm Thuốc trừ bệnh thế hệ mới có nguồn gốc từ thiên nhiên phổ

rộng, đặc trị thán thư xoài, đốm vòng trên cà chua Tiêu diệt nấm bệnh trước khi xâm nhiễm vào cây trồng, ngăn chặn nấm bệnh tiết ra độc tố gây hại cho cây, bông, trái Giúp tăng cường năng suất và phẩm chất trái; giúp trái lên phấn sáng đẹp, không cần bao trái; kéo dài thời gian bảo quản sau thu hoạch Pha thuốc với liều lượng 0,3 – 0,4 l/ha với thời gian cách ly là 14 ngày

2.4.2.3 Sumi eight 12.5 WP (diniconazole)

Sản phẩm của Công ty Công nghiệp Hóa chất SUMITOMO (Nhật Bản)

Thành phần hoạt chất: diniconazole (125 g/l) Nhóm hóa học:

Khuyến cáo sử dụng: Là thuốc trừ nấm, tác động nội hấp mạnh Thuốc có phổ tác

dụng rộng, có hiệu lực cao, kéo dài để phòng và trị hữu hiệu với hơn 50 loại nấm bệnh

ngăn chặn sự hình thành chất ergosterol cần thiết cho sự phát triển vách tế bào nấm, làm cho tế bào nấm mất nước và chết Ngoài ra Sumi Eight 12.5WP còn có tác dụng dưỡng cây, cây khỏe, bộ lá xanh hơn, tăng khả năng chống chịu sâu bệnh Liều lượng sử dụng: pha 5 ml/bình 8 lít (125 ml/thùng phuy 200 lít nước)

2.4.2.4 Score 250 EC (difenoconazole)

Thành phần hoạt chất: difenoconazole (250 g/l) Nhóm hóa học: Triazole

Khuyến cáo sử dụng: Là thuốc trừ nấm có tác dụng nội hấp Phổ tác dụng rộng, phòng trừ nhiều nấm thuộc lớp nang khuẩn, đảm khuẩn và nấm bất toàn Thuốc có tác

dụng phòng trừ các bệnh đốm lá, gỉ sắt, thán thư, ghẻ, phấn trắng cho rau cải, hành tỏi,

ớt, cà chua, khoai tây, dưa, đậu, cây ăn quả, cà phê, cây cảnh Pha thuốc sử dụng với liều lượng 0,3 – 0,6 l/ha và nồng độ là 0,1% phun ướt đều lên cây và thời gian cách ly

là 7 ngày

19

2.4.2.5 Folicur 250 EW (tebuconazole)

Sản phẩm của công ty Bayer Vietnam Ltd

Thành phần hoạt chất: tebuconazole (250 g/l) Nhóm hóa học: Triazole

có hiệu quả với nhiều loại nấm như Erysiphe, Puccinia, Rhizoctonia, Botrytis,

Mycosphaerella Thuốc có tác dụng phòng trừ các bệnh đốm lá, gỉ sắt đậu, phồng lá chè, gỉ sắt cà chua, bệnh mốc xám, phấn trắng nho, bệnh đốm lá chuối, bệnh thối trái cây ăn quả Sử dụng với liều lượng 0,4 – 0,8 l/ha, pha nước với nồng độ 0,1 – 0,2 % phun ướt đều cây và thời gian cách ly là 7 ngày

Chương 3

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện: Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2012 đến tháng 07/2012 Địa điểm thực hiện: Bộ môn BVTV, VNC CS Việt Nam và Nông trường Thuận

3.2 Đối tượng nghiên cứu

trưng

Vườn cây cao su bị bệnh do nấm B theobromae gây ra

3.3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát và so sánh đặc tính sinh học của 20 MPL kể trên

azoxystrobin, propineb, tebuconazole và thu ốc có hoạt chất carbendazim đối với nấm

B theobromae bằng phương pháp đầu độc môi trường

Điều tra tình hình bệnh Botryodiplodia trên một số vườn cây của Nông trường Thuận Tân, Công ty TNHH MTV Cao su Bình Thuận

3.4 Dụng cụ và vật liệu

Dụng cụ thí nghiệm: Nồi hấp, tủ cấy, cân điện tử, micropipette, pipet, pence, dao cấy, bình tam giác, đĩa petri (đường kính 9 cm), cốc thủy tinh, que cấy, ống đục đường kính 0,8 cm, đèn cồn, bút lông, giấy thấm vô trùng, kính hiển vi, lame, lamelle

Vật liệu thí nghiệm:

- Khoai tây: 200g/lít

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp lấy mẫu và phân lập mẫu

trưng Mẫu được ghi rõ tên vườn cây, địa điểm lấy mẫu, dvt, ngày lấy mẫu Mẫu bệnh được gói trong túi giấy, sau đó mang về phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt để phân

lập

bệnh có kích thước từ 3 – 5 cm Rửa mẫu một lần với nước cất, rồi rửa qua dung dịch HgCl2 0,1% hoặc cồn 70o trong vòng 30 giây, sau đó rửa lại 2 lần bằng nước cất Mẫu bệnh được cắt nhỏ hơn trong tủ cấy để trên giấy thấm vô trùng cho mẫu khô Khử

vào 5 vị trí trên đĩa môi trường PDA lưu ý bề mặt vết bệnh tiếp xúc với môi trường

Sau 3 ngày cấy mẫu phân lập kiểm tra nấm và cấy chuyền sang đĩa petri chứa môi trường PDA và dựa vào các đặc hình thái để định danh

3.5.2 Khảo sát đặc tính sinh học của một số MPL nấm B theobromae

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (HTNN): Môi trường

(Đồng Nai, Bình Phước, Tây Ninh, Gia Lai, Kon Tum), ghi rõ MPL nấm thuộc dvt nào, năm trồng, số nghiệm thức là 20 với 5 lần lập lại (LLL)

Môi trường PDA sau khi pha xong được đưa đi hấp tiệt trùng, sau đó đổ ra đĩa petri (10 ml/đĩa) để nguội rồi tiến hành cấy khoanh nấm với đường kính 0,8 cm vào trung tâm đĩa, ủ ở nhiệt độ 27 ± 20

C trong tủ ấm

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Đo ở các thời điểm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ngày sau khi cấy nấm

- Đường kính trung bình khuẩn lạc được tính bằng công thức:

2 d d1

Trong đó:

d: Là đường kính trung bình của khuẩn lạc

d1, d2: Là hai đường chéo vuông góc đo đường kính khuẩn lạc

bằng mắt thường vào thời điểm 7 ngày sau khi cấy nấm

• Đo kích thước bào tử nấm: Sau khi đo đường kính khuẩn lạc ở thời điểm 7 ngày sau khi cấy, khoảng 12 – 30 ngày sau cấy tiến hành quan sát và đo kích thước bào tử

tử: Nhỏ 1 giọt nước cất trên lame, dùng kim mũi mác lấy bào tử đặt trên giọt nước, đậy lamelle lên trên, ấn nhẹ để bào tử trải đều, sau đó đặt dưới kính hiển vi đã lắp sẵn thước, đo chiều dài và chiều rộng bào tử ở vật kính X40

3.5.3 Đánh giá hiệu lực của một số hoạt chất phòng trừ nấm B theobromae gây

bệnh trên cây cao su theo phương pháp đầu độc môi trường

chất khác nhau và đối chứng không sử dụng thuốc (bảng 3.1), mỗi thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức (tương ứng vơi nồng độ hoạt chất), 5 LLL, mỗi LLL là 1 đĩa petri

Bảng 3.1: Nồng độ hoạt chất các loại thuốc dùng trong thí nghiệm

23

% a.i trong thuốc thương phẩm

• Chuẩn bị môi trường:

chứa 45 ml Các bình tam giác chứa môi trường PDA được khử trùng trong nồi hấp ở

121oC trong 15 phút Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch thuốc đã pha sẵn ở các nồng độ khác nhau cho vào 5 bình tam giác tương ứng khác nhau (riêng bình tam giác của nghiệm thức đối chứng, cho vào bình 5 ml nước cất) Lắc đều cho thuốc hoà tan vào môi trường và mỗi bình rót đều vào 5 đĩa petri (mỗi đĩa tương ứng với 10 ml)

- Khi môi trường trong các đĩa petri nguội và đặc lại, tiến hành cấy các mẫu nấm

có đường kính 0,8 cm vào giữa đĩa petri

• Các chỉ tiêu theo dõi đường kính khuẩn lạc nấm:

- Cách đo đường kính khuẩn lạc: d = d1+2d2

Trong đó:

d: Là đường kính trung bình của khuẩn lạc

d1, d2: Là hai đường chéo vuông góc đo trên khuẩn lạc

- Đánh giá kết quả dựa vào phần trăm (%) ức chế đường kính khuẩn lạc theo công thức Vincent (1947):

I = (C –T) / C × 100

Trong đó:

I: Là % ức chế đường kính khuẩn lạc

C: Là đường kính khuẩn lạc ở nghiệm thức đối chứng

T: Là đường kính khuẩn lạc ở nghiệm thức xử lý thuốc

- Phần trăm ức chế sự phát triển khuẩn lạc nấm được chuyển đổi sang probit (y)

và nồng độ hoạt chất được chuyển sang lg (C*1000) (x) Từ đó thiết lập mô hình toán học dạng y = a + bx để xác định ED50 của các loại thuốc

Bảng 3.2: Đánh giá hiệu lực của thuốc dựa vào chỉ số ED50 do Finney (1968):

3.5.4 Điều tra bệnh ngoài đồng

Địa điểm thực hiện: Nông trường Thuận Tân thuộc Công ty TNHH MTV Cao

su Bình Thuận

Phương pháp điều tra: Tùy vào diện tích, số cây của từng vườn mà điều tra với

mỗi điểm quan trắc 50 cây, 3 – 5 điểm/vườn, theo 2 kiểu :

Hình 3.1: Ki ểu hình chéo góc Hình 3.2: Kiểu hình bậc thang

Vết bệnh rải rác trên thân, kích thước vết bệnh < 5 mm, các vết

bệnh chưa liên kết lại với nhau, tổng kích thước vết bệnh gộp lại chiếm ≤ 12,5% tính từ vị trí phân cành trở xuống

Cấp 2

(bệnh nhẹ)

Vết bệnh rải rác trên thân, kích thước vết bệnh < 5 mm, các vết

bệnh bắt đầu liên kết lại với nhau, tổng kích thước vết bệnh gộp lại chiếm từ > 12,5% đến ≤ 25% tính từ vị trí phân cành trở xuống Cấp 3

Cấp 5

(bệnh rất nặng)

Nhiều vết bệnh liên kết trên thân làm vỏ bị nứt tạo thành từng mảng

có thể tách lớp vỏ ra khỏi thân dễ dàng , có khi mủ rỉ ra trên đường nứt, vỏ bị thối nhũn hoặc các vết bệnh xuất hiện trên thân > 75% tính từ vị trí phân cành trở xuống

• TLB và CSB được tính theo các công thức sau:

x 100 Tổng số cây điều tra

x 100

Tổng số cây điều tra x Cấp bệnh cao nhất

3.6 Xử lý số liệu

phần mềm SAS (Statistical Analysis System)

Chương 4

4.1 Kết quả phân lập nấm B theobromae:

Phân lập nấm trên môi trường nhân tạo là một trong những kỹ thuật cơ bản trong công tác nghiên cứu BVTV, đặc biệt là đối với những loại nấm ký sinh Mục đích của phân lập nhằm thu được dòng thuần, định danh nấm gây bệnh và tạo nguồn

nấm cho những nghiên cứu tiếp theo Đối với nấm B theobromae thì vết bệnh trên

thân cây thường được sử dụng là nguồn chính để phân lập

Những mẫu bệnh có triệu chứng điển hình được thu thập về để tiến hành phân lập Mẫu bệnh sau khi được cắt nhỏ 1 - 1,5 mm và khử trùng thì đem cấy vào các đĩa petri có chứa môi trường PDA Khi sợi nấm bắt đầu hình thành cho đến 3 ngày sau khi cấy thì tiến hành cấy chuyền để loại bỏ bớt tạp nấm Một tuần sau khi cấy dựa vào các đặc điểm hình thái được mô tả bởi Punithalingam (1976) để xác định nấm Hình dạng bào tử nấm cũng là một trong những đặc điểm quan trọng để định danh nguồn nấm chính xác hơn

Hình 4.1: Triệu chứng bệnh do nấm B theobromae trên cây cao su

Kết quả đã thu thập và phân lập được 20 MPL lấy từ các dvt khác nhau (VM

515, PB 260, RRIV 3, RRIV 4, LH 90/952, CK 130) thuộc vùng khác nhau như: Đồng Nai, Gia Lai, Tây Ninh, Bình Phước, Kom Tum, Lai Khê

4.2 Phương pháp tách đơn bào tử B theobromae

27

triển từ một bào tử duy nhất (Kirsop and Doyle, 1991) Đối với việc nghiên cứu đặc điểm sinh học nói chung cũng như về mặt di truyền nói riêng việc tách đơn bào tử để thu được dòng nấm thuần là điều rất cần thiết Mục đích của việc tách đơn bào tử sẽ cho ta một MPL thuần, đồng nhất về mặc di truyền, tránh nhiễm tạp so với sự nuôi cấy

tự nhiên

nhiều phương pháp tách đơn bào tử khác nhau Phương pháp để phân lập đơn bào tử

nấm trong nuôi cấy nấm thuần (đã nghiên cứu bởi Ho & Ko, 1997) được thực hiện như sau: dùng pipet lấy 0,1 μl dung dịch bào tử, pha trong nước muối sinh lý (bào tử được pha loãng đến nồng độ 10 bào tử/1μl), nhỏ lên đĩa Petri có môi trường nuôi cấy phù

hợp với từng loài nấm

Đĩa Petri được đánh dấu bằng các đường tròn ở mặt sau có đường kính 0,5 cm, trung bình từ 50 – 100 đường tròn/1 đĩa, mỗi 0,1 μl dung dịch bào tử nhỏ vào một đường tròn Sau khi ủ 12 – 24 giờ thì số lượng bào tử trong mỗi đường tròn được đếm Từng bào tử trong mỗi đường tròn khi nảy mầm được cấy truyền sang môi trường mới

và sẽ thu được nấm thuần Từ đây có thể kết luận rằng đây là một trong những phương

thuần Hơn nữa phương pháp này đòi hỏi thời gian thực hiện cũng như thời gian ủ

ngắn hơn các phương pháp khác

với điều kiện phòng thí nghiệm Việc tách đơn bào tử được thực hiện theo qui trình sau:

tạo bào tử (để 10 - 15 ngày nhiệt độ phòng)

lame kính (đã vẽ) vào một đĩa Petri đường kính 9 cm sao cho mặt được đánh

mặt lame (10 - 12ml)

lấy bào tử (Lưu ý: Tập trung ở khu vực hiện rõ các túi bào tử và chỉ tiến hành

tách khi các đơn bào tử đã trưởng thành) Sau đó nhúng que cấy vòng vào eppendoft chứa 0,5 - 1ml nước cất vô trùng

10 giọt dung dịch bào tử bằng micropipette lên lamen, đưa lên kính hiển vi để

tử là được)

• Dùng pipette hút 1 ml dung dịch bào tử (đã điều chỉnh nồng độ) bơm vào những vòng tròn đã đánh dấu Ủ đĩa petri vừa cấy khoảng 10 – 24 giờ ở nhiệt độ phòng

để bào tử nảy mầm

hiển vi ở vật kính 10X Đánh dấu bên dưới lame những vòng tròn có chứa bào

được đánh dấu và chuyển sang nuôi cấy cấy riêng lẻ trên môi trường dinh dưỡng PDA

BoDN05, BoDN06, BoDN10, BoDN11, BoDN13, BoDN14, BoDN15, BoDN16, BoDN19, BoDN20, BoDN21, BoDN22, BoGL23, BoKT24, BoGL25, BoTN26, BoBP27

29

Hình 4.2: Khuẩn lạc và bào tử nấm B theobromae phân lập trên môi trường PDA

1: Khuẩn lạc, 2: Bào tử