Kết quả nghiên cứu vòng đời tự nhiên của vi tảo lục H. pluvialis nuôi trong bình tam giác 250ml trên môi trường C được thể hiện ở hình 7, hình 8 và bảng 4, bảng 5.
Hình 7: Mật độ tế bào của H. pluvialis nuôi ở bình tam giác 250ml trong môi trường C
Bảng 4: Mật độ tế bào trung bình trong môi trường C (104 TB/ml)
Ngày MĐTB Ngày MĐTB Ngày MĐTB
0 6,24 16 24,87 32 37,54 2 7,03 18 27,17 34 38,56 4 9,1 20 29,96 36 36,3 6 11,05 22 31,75 38 34,88 8 13,52 24 34,16 40 29,77 10 15,27 26 35,77 42 24,99 12 19,18 28 36,21 46 21,57 14 22,91 30 36,28 50 20,05 MĐTB – mật độ trung bình
Hình 8: Sự thay đổi của hàm lượng sắc tố (chlorophyll a, astaxanthin) và protein của H. pluvialis nuôi ở bình tam giác 250ml trong môi trường C.
Bảng 5: Hàm lượng các chất trong TB H. pluvialis trong môi trường C Ngày Chlo a (µg/l ) Astaxanthin (µg/l ) (pg/TB)Protein Ngày Chlo a (µg/l ) Astaxanthin (µg/l ) (pg/TB)Protein
0 151,82 53,12 237,5 26 593,21 264,54 74,14 2 200,2 53,28 206,25 28 611,9 270,39 71,77 4 249,89 60,29 187,72 30 638,27 282,55 68,64 6 313,21 100 172,33 32 681,07 298,59 64,43 8 385,66 113,82 156,11 34 693,53 334,14 57,88 10 421,17 154,3 143,75 36 721,4 395,42 58,65 12 463,5 175,82 130,2 38 789,01 447,88 54,29 14 477,01 176,05 120,85 40 811,45 526,66 51,3 16 509,4 182,12 115,73 42 808,36 550,01 50,02 18 514,02 191,16 104,7 44 786,52 644,11 48,98 20 528,81 203,55 100,11 46 700,39 705,15 47,22 22 540,03 238,94 90,8 48 653,8 817,68 46,18 24 559,31 250,17 78,29 50 607,44 912,56 44
Vòng đời của TB tảo H. pluvialis trong môi trường C cũng xảy ra tương tự như trong môi trường RM. Tuy nhiên có một số điểm khác biệt như sau: vi tảo H. pluvialis sinh trưởng trong môi trường C đạt mật độ TB cao nhất là 38,56x104 TB/ml sau 32 ngày nuôi cấy (hình 7 và bảng 4), thấp hơn so với so với mật độ đạt được khi nuôi tảo trong môi trường RM ở cùng thời điểm khảo sát. Không chỉ vậy, TB tảo trong môi trường C có hàm lượng protein nội bào, hàm lượng sắc tố đều chỉ đạt giá trị thấp hơn so với khi nuôi trong môi trường RM. Hàm lượng protein nội bào giảm dần đến giá trị 44 pg/TB sau 50 ngày nuôi cấy. Cũng tại thời điểm này, hàm lượng astaxanthin đạt giá trị cao nhất là 912,56 µg/l. Hàm lượng chlorophyll a cao nhất đạt 811,45 µg/l ở 40 ngày nuôi (hình 8 và bảng 5).
Cùng với việc đánh giá về hàm lượng các thành phần nội bào để đánh giá cũng như xác định các giai đoạn sinh trưởng của TB, chúng tôi còn đánh giá thông qua tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a. Theo công trình công bố của Kobayashi và cs. 1992 [24] về vòng đời của tảo H. pluvialis, tỷ lệ hàm lượng
astaxanthin/ chlorophyll a là một thông số tốt nhất để xác định pha sinh trưởng của TB. Nếu tỷ lệ astaxathin/ chlorophyll a ≤ 0,5 thì TB được xem chủ yếu đang ở giai đoạn sinh dưỡng. Khi tỷ lệ astaxathin/ chlorophyll a dao động từ 0,5 - 1, TB chủ yếu được xem đang ở giai đoạn encyst. Trong khi đó, nếu tỷ lệ này trong khoảng 2 – 7 thì TB chủ yếu ở giai đoạn cyst [25]. Kết quả thu được của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với những kết quả công bố ở trên, được trình bày chi tiết ở bảng 6.
Kết quả thí nghiệm chúng tôi thu được hoàn toàn phù hợp với những kết quả theo công trình đã công bố của Kobayashi và cs. (1997) [25] về vòng đời của vi tảo H. pluvialis. Thông số tốt nhất để xác định được các pha sinh trưởng của TB chính là tỷ lệ giữa hàm lượng astaxanthin và hàm lượng chlorophyll a (astaxanthin/chlorophyll a). Nếu:
- Tỷ lệ astaxathin/chlorophyll a dưới 0,5 thì TB được xem chủ yếu đang ở giai đoạn sinh dưỡng.
- Tỷ lệ astaxathin/chlorophyll a dao động từ 0,5 - 1, TB chủ yếu được xem đang ở giai đoạn tạo bào nang non (encyst).
- Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a trong khoảng 2 – 7 thì TB chủ yếu ở giai đoạn bào nang hoàn chỉnh (cyst).
Bảng 6: Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a của vi tảo H. pluvialis ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau:
Giai đoạn Sinh dưỡng Encyst Cyst Nảy mầm
Trạng thái TB
TB tảo hình elip, màu xanh, có hai roi. Kích thước TB: 13 x 16 ÷ 19 x 25 ±
0,50 µm
TB tảo hình cầu, màu xanh,
không có roi. Kích thước từ 14 ÷ 30 ± 0,50 µm TB tảo hình cầu, màu đỏ đậm, không có roi. Kích thước: 35 ÷ 40 ± 0,20 µm TB hình elip, có hai roi, màu nâu đỏ đến xanh. Kích thước: 8 x 11 ÷ 10 x 15 ± 0,30 µm Tỷ lệ astaxanthin/ chlorophyll a 0,30 ± 0,05 0,90 ± 0,20 2,40 ± 0,10 0,60 ± 0,20
Trong 10 ngày nuôi đầu, các TB H. pluvialis chủ yếu ở dạng sinh dưỡng, có thể chuyển động được. Màu đặc trưng của TB ở giai đoạn này là màu xanh do phần nội bào giàu chlorophyll, hàm lượng astaxanthin thấp. Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a đạt 0,30 ± 0,05. Khi thời gian nuôi đạt tới 20 ngày, các TB tảo chuyển từ dạng sinh dưỡng sang dạng tạo bào nang (encyst). Mức độ sinh tổng hợp astaxanthin tăng lên trong khi hàm lượng chlorophyll a lại giảm dần. Lúc này, tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a trong TB đạt giá trị 0,90 ± 0,20. Kéo dài thời gian nuôi trồng lên đến 50 ngày, TB tảo bất động, chuyển dần từ dạng encyst sang giai đoạn bào nang hoàn chỉnh (cyst). Trong TB H.
pluvialis xảy ra sự tích lũy astaxanthin. Do đó, phần nội chất của TB chuyển
hoàn toàn sang màu đỏ đậm. Tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a đạt giá trị cao nhất 2,40 ± 0,10. Ở giai đoạn nảy mầm, hình dạng, cấu tạo TB tảo cũng xuất hiện sự thay đổi: từ hình cầu chuyển sang hình elip, từ không có roi chuyển thành có roi. Ngoài ra màu sắc của TB cũng biến đổi: từ màu đỏ đậm đặc trưng của giai đoạn cyst chuyển thành màu nâu đỏ do sự phân giải astaxanthin. Cùng với sự thay đổi hình thái là quá trình biến đổi hàm lượng
các sắc tố bên trong nội bào, đặc trưng là tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a có xu hướng giảm và đạt giá trị 0,60 ± 0,20.
Quá trình chuyển giai đoạn của TB vi tảo H. pluvialis từ dạng sinh dưỡng sang dạng bào nang tổng hợp - tích lũy astaxanthin cao có thể được thực hiện theo 2 con đường khác nhau:
- Nuôi tảo trong môi trường cho đến khi dịch tảo tự chuyển sang màu đỏ do cạn kiệt nguồn dinh dưỡng. Tiến hành nuôi theo phương thức này thể hiện vòng đời tự nhiên của TB tảo H. pluvialis với thời gian chuyển giai đoạn tương đối dài (trên 50 ngày) và hàm lượng astaxanthin được tổng hợp là không cao.
- Điều khiển quá trình chuyển giai đoạn trong vòng đời của H. pluvialis bằng nuôi cấy 2 pha. Trong đó, pha đầu sẽ nuôi cấy tảo ở điều kiện tối ưu để tảo đạt mật độ TB cực đại. Tiếp theo tiến hành chuyển sinh khối tảo vào pha thứ hai có môi trường nuôi cấy bất lợi về cường độ ánh sáng, nhiệt độ cao, thiếu nitơ, shock về muối... để kích thích TB nhanh chóng chuyển sang dạng nang bào tử có tích lũy astaxanthin cao.
Một số hình ảnh minh họa hình thái và kích thước TB thay đổi ở các giai đoạn trong vòng đời của H. pluvialis nuôi ở bình tam giác 250 ml được chỉ ra trên hình 9.
Hình ảnh TB chụp trên kính hiển vi quang học cho thấy được rõ các các dạng TB khác nhau trong từng giai đoạn của chúng. TB ở dạng màu xanh với 2 roi trong khoảng 10 ngày nuôi cấy và bắt đầu hình thành nang bào từ 15 đến 20 ngày. Sau 20 ngày nuôi cấy, trong nội chất TB bắt đầu hình thành astaxanthin, TB có mầu nâu đỏ, giai đoạn này kéo dài đến 60 ngày, lúc này trong nội chất TB chủ yếu là astaxanthin và TB có màu đỏ rực. Giai đoạn nảy mầm từ TB chín màu đỏ rực sang TB sinh dưỡng có 2 roi mất khoảng 15 ngày
Hình 9. Một số hình ảnh minh họa hình thái và kích thước TB thay đổi ở các giai đoạn trong vòng đời của H. pluvialis nuôi ở bình tam giác 250 ml:
Ngày 0 10 16 22 32 50 60 KT: 13,34 x 22,72 µm KT: 15,54 x 24,31 µm KT: 24,95 μm KT: 23,87 µm KT: 36,89 μm KT: 39,07 µm KT: 36,37 μm Ngày 0 2 7 9 15 Giai đoạn nảy mầm KT: 37,02 μm KT: 24,46 μm KT: 21,79 μm KT: 11,14 x 15,54 µm KT: 12,84 x 17,56 µm
PHẦN 4