Nghiên cứu một số đặc điểm bacteriocin của vi khuẩn lactobacillus plantarum UL487 (luận văn thạc sĩ khoa học)

Những năm gần đây, vi khuẩn lactic Lactic Acid Bacteria - LAB đã được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm và một số ngành chế biến khác vì chúng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đồng Thị Hoàng Anh

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BACTERIOCIN

CỦA VI KHUẨN Lactobacillus plantarum UL487

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đồng Thị Hoàng Anh

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BACTERIOCIN

CỦA VI KHUẨN Lactobacillus plantarum UL487

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Quỳnh Uyển

PGS TS Nguyễn Quang Huy

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quỳnh Uyển, cán bộ Viện

Vi sinh học và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm, giúp tôi hoàn thành luận văn theo đúng định hướng ban đầu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

PGS.TS Nguyễn Quang Huy, cán bộ tại Bộ môn Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

CN Hoàng Thu Hà, CN Lê Hồng Anh cùng toàn thể cán bộ, sinh viên tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình làm thực nghiệm

Đề tài “ Đánh giá nguồn gen vi khuẩn lactic bản địa định hướng ứng dụng

trong thực phẩm, dược phẩm và thức ăn chăn nuôi ” - Bộ khoa học và Công nghệ đã

hỗ trợ hóa chất, dụng cụ thí nghiệm trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè và các anh chị đồng học luôn ở bên giúp đỡ, động viên, khích lệ tôi vượt qua những khó khăn trong thời gian học tập suốt 2 năm vừa qua

Hà Nội, tháng 01 năm 2020

Học viên

Đồng Thị Hoàng Anh

Chromatography

mg : Miligram

ml : Millit

µL : Microlit SPFF : Sepharose Fast Flow

LC/MS : Liquid chromatography–

mass spectrometry

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Vi khuẩn lactic 2

1.1.1 Đặc trưng của vi khuẩn lactic 2

1.1.2 Đặc trưng di truyền của vi khuẩn lactic 4

1.2 Bacteriocin 13

1.2.1 Định nghĩa 13

1.2.2 Phân loại 13

1.2.3 Cơ chế tổng hợp của bacteriocin 16

1.2.4 Các đặc tính của bacteriocin 17

1.2.5 Bacteriocin từ vi khuẩn lactic 18

1.2.6 Một số phương pháp tinh sạch bacterioicin từ Lactobacillus plantarum 19 1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn lactic 21

1.3.1 Ứng dụng vi khuẩn lactic 21

1.3.2 Tình hình nghiên cứu bacteriocin 22

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nguyên liệu 26

2.1.1 Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 26

2.1.2 Nguồn vi sinh vật 26

2.1.3 Môi trường, hóa chất và thiết bị 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 28

2.2.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 29 2.2.3 Một số tính chất của bacteriocin 29

2.2.4 Tinh sạch bacteriocin 30

2.2.5 Phương pháp nhân dòng gen 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng vi khuẩn L plantarum UL487 35

3.2 Một số tính chất của bacteriocin từ chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL487 36 3.2.1 Hoạt độ bacteriocin (AU/ml) 36

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin 38

3.2.3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin 38

3.3 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của bacteriocin từ chủng L plantarum UL48740 3.4 Tinh sạch bacteriocin sinh tổng hợp từ chủng Lactobacillus plantarum UL48741 3.4.1 Tinh sạch trên hệ thống AKTA 42

3.4.2 Chương trình tinh sạch trên hệ thống HPLC 44

3.5 Nhân dòng và giải trình tự gen 45

3.5.1 Phát hiện các gen mã hóa cho bacteriocin từ chủng L plantarum UL48745 3.5.2 Nhân dòng các gen trong chủng L plantarum UL487 46

3.5.3 Phân tích trình tự các gen và so sánh với các chủng Lactobacillus plantarum khác 47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

KẾT LUẬN 49

KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Đặc trưng trình tự bộ gen LAB 5

Bảng 1.2 Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn 18

Bảng 1.3 Tinh sạch một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum 20

Bảng 2.1 Các chủng vi khuẩn kiểm định 26

Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật gây bệnh 26

Bảng 2.3 Trình tự các cặp mồi 33

Bảng 3.1 Hoạt độ bacteriocin sinh tổng hợp bởi chủng L plantarum UL487 37

Bảng 3.2 Chương trình tinh sạch bacteriocin từ L.plantarum 487 bằng AKTA 42

Bảng 3.3 Tổng kết quá trình tinh sạch bacteriocin của chủng L plantarum UL487 bằng cột sắc ký trao đổi cation 44

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm I 16 Hình 1.2 cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm II 17 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thí nghiệm 28

Hình 3.1 : Hoạt tính bacteriocin của chủng vi khuẩn L plantarum UL487 với KĐ28

tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau 35

Hình 3.2 Hoạt tính bacteriocin từ chủng L plantarum UL487 tại 100oC và 121 oC 38

Hình 3.3: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocincủachủng Lactobacillus

plantarum UL487 39

Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của UL487 chống lại một số vi khuẩn gây bệnh 40

Hình 3.5 Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum UL487 qua cột

HitrapSPFF 1ml 42

Hình 3.6 Sắc ký đồ dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum UL487 qua cột

semi C4-dionex 44

Hình 3.7 Kết quả PCR kiểm tra các gen plnA, plnEF thuộc vi khuẩn L plantarum

UL487 trên agarose 1.5% 45

Hình 3.8 Kết quả PCR sàng lọc khuẩn lạc với mồi M13 và mồi đặc hiệu gen plnA,

plnEF 46 Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotide gen plnA của chủng L plantarum UL487 47 Hình 3.10 So sánh trình tự nucleotide gen plnEF của chủng L plantarum UL487 48

MỞ ĐẦU

Hiện nay, ở nước ta, việc lạm dụng các chất phụ gia, hóa chất rẻ tiền độc hại trong quá trình sản xuất, chế biến và bảo quản thực phẩm tác động không nhỏ tới sức khỏe con người Trong số các giải pháp được đưa ra nhằm kiểm soát vấn đề này, phải kể đến hướng nghiên cứu sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc tự nhiên để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm với mục tiêu đem tới những thực phẩm an toàn và có lợi cho sức khỏe người tiêu dùng Không giống như hóa chất phụ gia, hay hóa chất thường được sử dụng trong bảo quản thực phẩm, bacteriocin

là các protein kháng khuẩn được sản xuất an toàn, không gây dị ứng và không gây hại cho sức khỏe con người

Những năm gần đây, vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) đã được ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm và một số ngành chế biến khác vì chúng có khả năng sinh acid và ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn nhờ khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Trong đó, vi khuẩn

Lactobacillus plantarum được đánh giá là một trong những ứng cử viên tiềm năng

trong việc sinh tổng hợp bacteriocin giúp ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như

Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes

Hiện nay, trên các tạp chí khoa học trong nước và quốc tế đã có nhiều công

bố nghiên cứu chuyên sâu về bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum, bao

gồm cả tinh sạch cũng như xác định các bacteriocin mới để ứng dụng trong công nghệ thực phẩm nhằm mục đích kéo dài thời gian bảo quản, chống lại sự phát triển của các tác nhân gây bệnh và điều trị một số bệnh và duy trì sức khỏe cho con người Tuy nhiên, những nghiên cứu sâu về bacteriocin ở Việt Nam vẫn còn khiêm tốn Xuất phát từ thực tế cùng xu hướng nghiên cứu hiện nay về việc ứng dụng

bacteriocin, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm của

bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus plantarum UL487” để cung cấp thêm

những thông tin về bacteriocin và góp phần làm phong phú hơn những tiềm năng

ứng dụng của Lactobacillus plantarum

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Vi khuẩn lactic

Con người từ lâu đã biết chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, pho mát, muối dưa, muối cà ), thức ăn ủ chua cho gia súc để tăng thời gian bảo quản cũng như tăng hương vị cho sản phẩm Cho đến những năm 80 của thế kỷ 18, vi khuẩn lactic mới được giới khoa học phát hiện và tập trung nghiên cứu Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wihelm Scheele lần đầu tiên tách được lactic acid từ sữa

bò lên men chua gọi là “axit sữa”, nhưng mãi đến năm 1857, Louis Pasteur mới chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạt động của một nhóm vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn lactic Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi khuẩn

lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactis (nay gọi là Streptococcus lactis) Đến

nay, các nhà khoa học đã phân lập và nghiên cứu nhiều loại vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn hữu cơ khác nhau trong tự nhiên: trong phân, rác, xác động vật, trong các sản phẩm muối chua, thậm chí trong niêm mạc đường tiêu hóa, âm đạo người và động vật Ngoài ra, một số loài vi khuẩn lactic sống kí sinh trên cơ thể thực vật, hút các chất tiết từ mô cây [28,50,54]

1.1.1 Đặc trưng của vi khuẩn lactic

1.1.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria, LAB) là tên gọi chung của những vi khuẩn sinh lactic acid như là sản phẩm chính trong quá trình chuyển hóa carbohydrate Do đặc tính chung này, các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ

Lactobacteriaceace mặc dù chúng không đồng nhất về mặt hình thái (bao gồm cả

các vi khuẩn dạng que ngắn, que dài, lẫn các vi khuẩn hình cầu) Vi khuẩn lactic được đặc trưng bởi khả năng sinh lactic acid từ các loại đường khác nhau, cụ thể là

Firmicutes và Firmicutes Trong ngành Firmicutes, LAB thuộc bộ Lactobacillales

và bao gồm các chi sau: Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Symbiobacterium, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella Sinh vật thuộc các

chi này đều có hàm lượng guanine-cytosine thấp (31- 49%) LAB trong ngành

Actinobacteria chỉ bao gồm các loài Bifidobacterium [41]

Vi khuẩn lactic có tế bào dạng hình cầu hoặc hình que, thành tế bào Gram dương, không di động, không sinh nội bào tử Tuy nhiên, hiện nay người ta tìm thấy một số chủng trong họ vi khuẩn lactic có khả năng sinh nội bào tử Chúng thiếu khả năng tổng hợp cytochrome và porphyrin (các thành phần của chuỗi hô hấp) và do đó không thể tạo ra ATP do gradient proton LAB chỉ có thể thu được ATP bằng cách lên men, thường là lên men đường Vi khuẩn lactic không khử nitrate (NO3−), có phản ứng catalase âm tính, và kị khí tùy ý trừ một vài loài kị khí bắt buộc sống trong hệ tiêu hóa của con người Bên cạnh lactic acid, các sản phẩm phụ khác bao gồm acetate, ethanol, CO2, formate và succinate cũng được tìm thấy [24]

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn đa khuyết dưỡng Chúng dễ dàng chuyển hóa năng lượng các dạng đường đơn: glucose, fructose, maltose, galactose, mannose nhưng không có khả năng chuyển hóa các loại carbohydrate phức tạp như: tinh bột, hay dextrose Bên cạnh đó, nguồn nitơ được sử dụng hiệu quả nhất là từ cao nấm men Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào Vitamin cần cho vi khuẩn lactic chia thành 3 nhóm: vitamin thiết yếu, vitamin kích thích và vitamin không cần thiết Vi khuẩn lactic cũng cần muối vô cơ như kali, phốt pho, lưu huỳnh, đặc biệt mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân chia và ổn định cấu trúc tế bào Vi khuẩn lactic đạt tăng trưởng tối ưu ở pH 5,5-5,8 và nhiệt độ

là 15oC -50oC Ở nhiệt độ 80oC, vi khuẩn lactic dễ bị tiêu diệt [58]

Lactobacillus là chi lớn nhất bao gồm khoảng 175 loài phân lập từ các nguồn

khác đã được công bố Phần lớn các loài (gần một phần ba trong số những nguồn được mô tả) đã được phân lập từ đường ruột người và động vật Rau và các sản phẩm lên men từ rau củ quả (bao gồm dưa chua và kim chi, bột chua, v.v.) là nguồn

phân lập Lactobacillus phong phú Trong ấn bản thứ 2 cuốn Cẩm nang về hệ thống

Vi khuẩn của Bergey (Kandler và Weiss 1986), nhiều loài Lactobacillus đã được

liệt kê, và danh pháp được tổ chức lại thành ba nhóm: nhóm I (chủng lên men đồng hình bắt buộc), nhóm II (chủng lên men dị hình không bắt buộc), nhóm III (chủng lên men dị hình bắt buộc) Dựa trên trình tự 16S rDNA, các nhóm chính là: (1)

nhóm Lb delbrueckii bao gồm chủ yếu là các loài lên men đồng hình; (2) nhóm Lb

pediococcus, bao gồm các loài lên men đồng hình cũng như lên men dị hình bắt buộc và không bắt buộc; (3) nhóm Leuconostoc bao gồm một số loài lên men dị hình bắt buộc và sau đó được chia thành ba chi: Leuconostoc, Oenococcus và Weissella (Collins et al 1991) Lactobacillus được ứng dụng nhiều trong công

nghiệp chế biến và bảo quản sữa, pho mát, thịt, các chế phẩm probiotic [36]

1.1.1.2 Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum

Lactobacillus plantarum được đặt tên lần đầu tiên là Streptobacterium plantarum bởi nhà khoa học Orla-Jennsen vào năm 1919 và được thay tên là L plantarum (1936) bởi Pederson Ông là người đã mô tả loài này bằng các đặc trưng sinh hóa và hình thái Các chủng thuộc nhóm này có hình dạng khuẩn lạc tròn, màu

trắng sữa, tế bào có dạng hình que thường kết đôi hoặc hình chuỗi, bắt màu Gram dương, không sinh bào tử, sinh trưởng tốt trong điều kiện vi hiếu khí [37]

Tính đặc trưng duy nhất của Lactbacillus plantarum là khả năng dị hóa arginine, và sinh ra nitric oxide Lactobacillus plantarum không có khả năng phân

giải amino acid, ngoại trừ tyrosine và arginine Chúng có đến 6 con đường chuyển hóa arginine khác nhau và đều sinh ra nitric oxide Việc sinh ra nitric oxide giúp

ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida abicans, Escherichia coli, Shigella, Helicobacter pylory, các amip và kí sinh trùng Lactobacillus plantarum ngăn chặn sự bám dính của E coli tiết ra Chúng quan trọng trong việc bảo vệ các

chất chống vi sinh vật và chống lại một cách hiệu ủa các vi sinh vật gây bệnh nội

bào và ngoại bào Lactobacillus plantarum có khả năng giúp tiêu hóa các chất xơ có

trong lúa mì,lúa mạch den và trong men bia Do đó, chúng cải thiện tốt những vấn

đề tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng [45] Ngoài ra còn có một số loài của chi

Lactobacillus khác hư Lactobacillus paracasei, Lactobacillus sporogenes, Lactobacillus brevis, Lactobacillus lactis, đều có ích cho đường tiêu hóa [38]

1.1.2 Đặc trưng di truyền của vi khuẩn lactic

1.1.2.1 Bộ gen vi khuẩn lactic

Bộ gen của Lactococcus lactis subsp lactis IL1403 được công bố vào năm

2001 Đây là đại diện đầu tiên được giải trình tự của bộ gen LAB Kể từ đó hơn 75

bộ gen quan trọng của LAB trong lĩnh vực công nghiệp đã được giải trình tự, trong khi hơn 80 dự án giải trình tự bộ gen đang được tiến hành [33] Bộ gen của LAB có hàm lượng GC thấp và phạm vi kích thước từ 1,3 đến 3,3 Mb Từ các bộ gen hoàn chỉnh được công bố khả năng sinh tổng hợp và trao đổi chất cũng như sự khác biệt tiến hóa của LAB đã được mô tả rõ hơn Số lượng gen mã hóa protein được dự đoán trong LAB khác nhau từ khoảng 1,700 đến khoảng 2,800 gen Nhiều LAB chứa một

số plasmid, một số trong đó rất cần thiết cho sự tăng trưởng trong các môi trường cụ thể và có các gen sử dụng trong quá trình trao đổi chất, vận chuyển màng và sản xuất bacteriocin Các gen được mã hóa từ plasmid trong LAB dao động từ 0% đến 4,8% tổng lượng gen [34] Một số đặc điểm trình tự bộ gen của LAB được trình bày trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Đặc trưng trình tự bộ gen LAB [33]

Loài

Kích thước bộ gen

đường phân Các enzyme của quá trình đường phân là tương đồng giữa các thành viên trong nhóm vi khuẩn lactic Những phân tích gần đây của bộ gen LAB chỉ ra rằng 13-17% tổng số gen mã hóa protein vận chuyển Trong đó sự phân bố các gen liên quan tới vận chuyển và chuyển hóa các carbohydrate chiếm ưu thế trong bộ gen Hệ thống phosphotransferase (PTS) phụ thuộc phosphoenolpyruvate (PEP) là

cơ chế hấp thụ carbohydrate chiếm ưu thế trong chi Lactobacillus Bộ gen của

những loài trong chi này mã hóa trung bình 20-30 kênh vận chuyển PTS, thêm vào một vài kênh vận chuyển cassette liên kết ATP (ABC) và permease Đặc trưng này giúp vi khuẩn lactic chuyển hóa carbohydrate khác nhau từ môi trường [31,34]

Trong phần lớn các loài vi khuẩn lactic, amino acid được sử dụng trong một

số chức năng sinh lý như kiểm soát pH nội bào hay khả năng chống lại áp lực từ môi trường Con đường sinh tổng hợp amino acid ở hầu hết các loài LAB chưa hoàn

chỉnh ở các mức độ khác nhau, ngoại trừ L lactis Lactobacillus bù đắp những thiếu

sót này bằng việc mã hóa số lượng lớn peptidase, amino acid permease và nhiều chất vận chuyển oligopeptide có thể hỗ trợ xử lý và thu hồi amino acid hiệu quả từ môi trường giàu dinh dưỡng [32]

Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic cũng sản sinh một số một số hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn như lactic acid, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, bacteriocin Tại mức pH thấp, tác dụng kháng khuẩn chủ yếu là lactic acid, lúc này lactic acid ức chế khuynh hướng hình thành bào tử của nhiều vi khuẩn Hydrogen peroxide được tạo ra trong điều kiện thiếu oxygen Hydrogen peroxide có khả năng

ức chế sinh trưởng của vi sinh vật gây bệnh Reuterin là hợp chất kháng khuẩn bắt nguồn từ glycerol dưới điều kiện kỵ khí Reuterin đóng vai trò ngăn cản sự hình thành mycotocxin cũng như chống lại các vi khuẩn gram âm, và gram dương Bacteriocin là các peptide kháng khuẩn tổng hợp trên ribosome, có khả năng chống lại các vi khuẩn cùng loài (phổ hẹp) hoặc vi khuẩn trên các chi khác (phổ rộng) Tất

cả các hợp chất kháng khuẩn có thể chống lại sự phát triển của một số vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm [37]

Trong LAB, các gen mã hóa sản phẩm bacteriocin được sắp xếp thành các cụm operon phân bố trong bộ gen hoặc plasmid Các operon sinh tổng hợp

lantibiotic thường chứa các gen mã hóa cho tiền peptide, các enzyme chịu trách nhiệm cho các phản ứng sửa đổi (LanB, C/LanM), các protease chịu trách nhiệm loại bỏ peptide dẫn (LanP), ABC (cassetle liên kết ATP), tập hợp protein vận chuyển liên quan đến chuyển dịch peptide (LanT), protein điều hòa (LanR, K) và protein liên quan đến khả năng tự bảo vệ của sinh vật sản xuất (miễn dịch) (LanI, FEG) Lantibiotic được đặc trưng bởi sự hình thành amino acid lanthionine và 3-methyllanthionine thông qua cải biên hậu dịch mã Phân lớp thứ nhất của non-

lantibiotic bacteriocin (<10 kDa) với đại diện là Pediocin PA-1/AcH, Saracens A và

P, Leucocin A, Carnobacteriocin được đặc trưng bởi một trình tự liên ứng đầu N được bảo tồn YGNGVxCxxxxCxV Phân lớp thứ hai của non-lantibiotic bacteriocin

mã hóa trên cùng operon, hoạt động của chúng phụ thuộc vào hoạt động bổ sung

của hai peptide Ví dụ điển hình Lactoccins G và F, Lactation F, Plantaricin EF và

JK, Brochocin C Phân lớp thứ ba được tổng hợp với trình tự dẫn loại sec đầu N, dẫn đến bài tiết và xử lý thông qua con đường sec (acidocin B, carnobacteriocin A, divergicin A, enterocin P, enterocin B) [15]

1.1.2.2 Đặc trưng di truyền của Lactobacillus plantarum

Năm 2003, bộ gen của Lactobacillus plantarum được công bố lần đầu tiên

Bộ gen của Lactobacillus plantarum có kích thước khoảng 3.2 Mbp với hàm lượng

GC 44.0 – 45.3%, CDS (coding sequences) ~3,000 và có 1 tới 3 plasmid Hầu hết các

loài L.plantarum chứa khoảng hơn 2000 gen Các gen này phần lớn mã hóa protein

có tính tương đồng với các chủng khác trong LAB, còn lại 300 gen là không cho thấy sự tương đồng trong trình tự so với các chủng LAB [37] Một số nghiên cứu

cũng chỉ ra 121 gen đặc trưng duy nhất cho loài L plantarum Những gen này chưa được tìm thấy trong các vi khuẩn lactic khác [52] Lactobacillus plantarum là những

vi khuẩn sử dụng một lượng lớn gen mã hóa cho quá trình vận chuyển đường trong

khi quá trình này ở Streptococcus cần một lượng gen ít hơn Phần lớn các quá trình

vận chuyển thông qua hệ thống phosphotransferase (PTS) phụ thuộc

phosphoenolpyruvate (PEP) L plantarum mã hóa khoảng 20-30 enzyme phức hợp

PTS loại II hoàn chỉnh Số lượng PTS được mã hóa trong các chủng này cao hơn so

với những vi khuẩn khác và chỉ tương tự với Listeria monocytogenes Ngoài ra, bộ

gen của L plantarum còn mã hóa cho hệ vận chuyển liên quan đến quá trình vận chuyển nguồn cacbon Các gen mã hóa enzyme liên quan tới con đường chuyển hóa

được phân bố trong các operon Glucose bị chuyển hóa thành một lượng D- và lactate bởi các hoạt động của các enzyme dehydrogenase Nhiễm sắc thể mã hóa hai gen giả định cho lactate dehydrogenase và một số lượng lớn các enzyme phân giải pyruvate khác được dự đoán sẽ xúc tác cho quá trình sản xuất các chất chuyển hóa khác, bao gồm formate, acetate, ethanol, aceton và 2,3-butanediol Nhiều gen vận chuyển và chuyển hóa đường được tập hợp gần nơi khởi đầu sao chép Cụ thể, khu vực 213 kb mã hóa hầu hết các protein cho quá trình vận chuyển, chuyển hóa và điều tiết carbonhydrate Hơn nữa, toàn bộ khu vực này có hàm lượng GC thấp hơn (41.5%) so với phần còn lại của bộ gen Điều này sẽ phù hợp với giả thuyết rằng

L-khu vực 213-kb của nhiễm sắc thể L plantarum đại diện cho vùng thích nghi với

điều kiện sống [30] Sự phân bố các gen liên quan đến quá trình vận chuyển amino acid đem tới ưu thế hơn so với các chủng LAB khác Một đặc trưng quan trọng của

L plantarum là khả năng thích nghi với những áp lực từ môi trường, bao gồm một

số protein được sản sinh phản ứng lại áp lực môi trường như protein sốc nhiệt ( hrcA-grpE-dnaK-dnaJ ), protein sốc lạnh (CspL, CspC, CspP), protein sốc alkaline, và các protein liên quan tới áp lực oxi hóa (catalase, thiol peroxidase, glutathione peroxidase, halo peroxidase, bốn thioredoxin, bốn reductase glutathione, năm NADH-oxidase, and hai NADH peroxidase) Ngoài ra, vi khuẩn sản xuất axit lactic phải đối phó với khả năng axit hóa môi trường trong môi trường sống F0F1-ATPase có chức năng như là một cơ chế điều chỉnh chủ yếu của pH nội bào Bên

cạnh đó, L plantarum còn có các gen chịu trách nhiệm cho hệ thống điều hòa hai

thành phần và khả năng dẫn truyền tín hiệu [34]

Plantaricin là peptide kháng khuẩn tự nhiên được sản xuất bởi các chủng

Lactobacillus plantarum Peptide kháng khuẩn này có thể nằm trong nhiễm sắc thể

hay plasmid của vi khuẩn plantaricin 423 được mã hóa bởi gen trên plasmid Trong khi plantaricin ST31 được xác định bởi gen trong nhiễm sắc thể Hiện nay có

khoảng năm loci đặc trưng khác nhau từ các chủng L plantarum (C11, NC8,

WCFS1, J23, J51), có khoảng 25 gen trải dài khoảng 18-19 kb trên sợi DNA được tìm thấy trong mỗi locus Các gen này tổ chức thành 5-6 operon Vùng bảo toàn chứa

một operon bacteriocin (pln EFI) và một operon vận chuyển (pln GHSTUVW) Trong

khi các vùng ít bảo toàn hơn gồm một operon điều tiết, và hai hoặc ba operon bacteriocin Hơn nữa, mỗi locus cũng chứa một một hoặc hai operon với những chức

năng chưa được biết đến và ít vùng bảo toàn hơn [19] Bacteriocin từ vi khuẩn L plantarum có cấu trúc là chuỗi peptit đơn hoặc đôi với khối lượng phân tử nằm trong khoảng 0,4 – 14 kDa và có khả năng ức chế nhiều vi sinh vật gây hại như S aureus, E faecalis, P aeruginosa, L monocytogenes [39]

Sản phẩm bacteriocin từ chủng Lactobacillus plantarum được điều hòa bởi

một mạng lưới dẫn truyền tín hiệu Trong đó, peptide pheromone được tạo ra từ gen

pln A đóng vai trò cảm ứng cho sản xuất bacteriocin Pln A thuộc về operon điều hòa (pln ABCD) Trong số các sản phẩm bacteriocin được tạo ra từ operon (pln ABCD), plantaricin EF hiện diện trong toàn bộ loci pln trong khi các plantaricin

khác được tìm thấy ở các chủng khác nhau như plantaricin JK chỉ hiện diện trong

các chủng L plantarum C11, WCFS1, V90, NC8; plantaricin NC8 chỉ có trong

NC8 và J51 [19]

 Plantaricin A

Các bacteriocin được sản xuất bởi vi khuẩn lactic thường là các peptide cation có đặc tính thấm màng và chứa khoảng 25 đến 60 amino acid Quá trình sản xuất bacteriocin trong một vài vi khuẩn được kiểm soát bằng một hệ thống điều tiết

3 thành phần bao gồm một kinase histidine liên kết màng, một hệ điều tiết phản ứng

và một peptide pheromone giống bacteriocin Plantaricin A (PlnA) là một peptide ngắn có hoạt tính như bacteriocin được tìm thấy từ Lactobacillus plantarum C11 Gen plnA mã hóa tiền peptide chứa 26 amino acid Ngoài dạng này, hai dạng rút

ngắn đầu N (chứa 22 và 23 amino acid) cũng được phân lập từ môi trường nuôi cấy

của L plantarum C11 PlnA 22-, 23-, và 26-mer peptide là ba biến thể đều có nguồn gốc từ tiền protein 48 amino acid được mã hóa bởi gen pln A [18] So sánh trình tự

amino acid với một loạt bacteriocin khác cho thấy trình tự dẫn được loại bỏ từ tiền peptide bằng cách cắt acid amin sau hai glycine được bảo toàn Nghiên cứu của Dzung B Diep và các cộng sự chỉ ra rằng hoạt tính của plantaricin A là sự kết hợp

của hai peptide được cho là α và β, tương ứng với hai biến thể Pln A 23- và 26-mer

Khối lượng phân tử của α và β là 2426 và 2497 Da Khối lượng phân tử của α và β khi được xác định bởi khối phổ lần lượt là 2687+/-30 và 2758+/-30 Da Các nghiên

cứu cho thấy rằng chức năng của cả ba biến thể PlnA là một pheromone gây ra sự phiên mã của các gen pln PlnA gây ra sự phiên mã của các gen được sắp xếp trong năm operon: plnABCD, plnEFI, plnJKLR, plnMNOP và plnGHSTUV [18]

Plantaricin A hoạt động với chức năng kép trong hệ thống plantaricin Nó làm việc với cả hai chức năng: nhân tố cảm ứng trong điều tiết gen và peptide kháng khuẩn Plantaricin A được nhận định ban đầu như một bacteriocin Phổ kháng khuẩn của plantaricin A tương đối hẹp Plantaricin A cho thấy khả năng đối kháng

đặc hiệu với các loài Lactobacillus khác như là L casei, L sakei và L viridescensi

Plantaricin A có hoạt tính thấp hơn (khoảng 10 – 100 lần) so với các plantaricin khác như EF và JK Hơn nữa, plantaricin A thiếu đi một protein miễn dịch nên về

cơ bản là một yếu tố cảm ứng, hoạt tính kháng khuẩn của nó là thứ cấp Những nghiên cứu này chứng minh rằng plantaricin A sử dụng một α-helix lưỡng tính (mang cả đặc trưng ưa nước và ưa chất béo) từ amino acid 12 đến 21 (phần đầu C) khi nó tiếp xúc với các điện tích âm trên màng Sự hình thành dạng xoắn này là cần thiết cho cả chức năng pheromone và hoạt tính kháng khuẩn Trong hoạt động pheromone, α -helix tạo điều kiện cho việc định vị phần đầu N của plantaricin A tham gia vào các tương tác đồng phân lập thể (chiral) với thụ thể (PlnB), trong khi đối với hoạt tính kháng khuẩn, các tương tác non- chiral tham gia và chỉ cần có α-helix vừa có cả tính ưa nước và kỵ nước (amphiphilic) đủ để thấm các tế bào nhạy cảm Một khía cạnh thú vị khác của plantaricin A là trong các nghiên cứu trên các tế bào tuyến yên chuột, plantaricin A dường như ưu tiên tính thấm với các tế bào ung thư hơn các tế bào bình thường, và nó có thể phân biệt giữa màng tế bào bên trong

và bên ngoài của các tế bào này Plantaricin A được tìm thấy trong các chủng vi

khuẩn Lactobacillus plantarum C11, WCFS1, V90 [19]

 Plantaricin EF

Sau khi phát hiện ra plantaricin A trong Lactobacillus plantarum C11, có đến

sáu loại bacteriocin khác được phân tách trên cùng vi khuẩn này Tất cả các peptide này ban đầu được tạo ra ở dạng tiền peptide chứa glycine kép quen thuộc Trong số này có plantaricin E và F có tác dụng bổ sung cho nhau khi kết hợp

Plantaricin EF là các peptide kháng khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn nhóm IIb, theo định nghĩa, hoạt động của chúng phụ thuộc vào hoạt động bổ sung của hai peptide khác nhau Bản chất cation của các peptide là rất cần thiết, vì nó tạo điều kiện cho sự tiếp xúc ban đầu giữa các bacteriocin và điện tích âm trên màng thông qua các tương tác tĩnh điện Các bacteriocin được dịch mã thành tiền peptide với trình tự dẫn glycine kép được tách ra trong quá trình xuất bào để tạo ra các peptide hoạt động với kích thước lần lượt là 33 amino acid (PlnE), 34 amino acid (PlnF) Một số peptide riêng lẻ có hoạt tính kháng khuẩn kém, tuy nhiên, hiệu quả của chúng tăng khoảng 1000 lần khi kết hợp với các peptide tương đồng của chúng, PlnE với PlnF Bacteriocin này đều cho thấy phổ ức chế tương đối hẹp, chủ yếu là

kháng lại các loài Lactobacillus (ví dụ: L plantarum, L casei, L sakei, L curvatus)

và một số vi khuẩn gram dương khác như Pediococcus pentosaceus và P acidilactici

Plantaricin EF tiêu diệt vi khuẩn nhạy cảm bằng cách thấm vào màng trong của chúng, gây ra sự chuyển dịch của nhiều loại phân tử màng, cuối cùng dẫn đến việc phá vỡ tế bào như là kết quả của sự sụt giảm điện thế sinh học và gradient pH qua màng Loại bacteriocin này có cả hoạt động bổ sung và trùng khớp đối với phương thức hoạt động của chúng [19]

Các nghiên cứu về cấu trúc đã tiết lộ rằng các peptide của bacteriocin không

có kết cấu trong dung dịch nước Do tương tác với màng, chúng thực hiện cấu trúc xoắn α và hình thành peptide dạng lỗ với đặc trưng lưỡng tính Ngoài ra, sự tương tác với một peptide tương đồng giúp tăng cường đáng kể quá trình xử lý cấu trúc, hai peptide bổ sung được tiếp xúc với nhau khi hình thành lỗ rỗng trong màng tế bào đích Loại bacteriocin này chứa các cấu trúc GxxxG trong trình tự bậc một của

chúng và đã được chứng minh là có liên quan đến tương tác helix-helix Trên thực

tế, một nghiên cứu gần đây cho thấy các peptide của plantaricin EF nằm song song theo kiểu so le với nhau và sự tương tác liên quan đến các cấu trúc GxxxG từ cả hai peptide

1.2 Bacteriocin

Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của colicin Đó là một chất sinh tổng hợp gây tử vong, phổ hoạt động hẹp bị giới hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất Ba chủng vi khuẩn Gram (+) được nghiên cứu cho

việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp.; Listeria sp và Staphylococcus

sp Các nghiên cứu trong những năm 1980 đã cho thấy có sự gia tăng đáng kể về số lượng các công bố về bacteriocin Từ thời điểm này bắt đầu bùng nổ những nghiên cứu về bacteriocin mà được định hướng như một chất kháng khuẩn an toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm [13]

1.2.1 Định nghĩa

Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là peptide hay protein được tổng hợp trên ribosome ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương để chống lại vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó Ngoài ra bacteriocin không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và bị phân hủy nhanh bởi proteinase, lipase [9]

1.2.2 Phân loại

Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin đã xác định, tuy nhiên việc phân loại các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang là vấn đề tranh cãi Các bacteriocin thường được phân loại dựa trên các tiêu chí khác nhau Những tiêu chí chính là họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và cuối cùng

là trình tự chuỗi amino acid Trong đó, phương pháp phân loại được chấp nhận và

sử dụng phổ biến là bacteriocin được chia thành 4 lớp: lớp I, lớp II, lớp III, lớp IV Hai nhóm bacteriocin lớp I và lớp II là đối tượng được tìm hiểu và nghiên cứu nhiều hơn hơn hai nhóm còn lại [15,30]

1.2.2.1 Lớp I

Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ, bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng Một bacteriocin của nhóm này là nisin Dựa trên con đường sinh tổng hợp và sự tương đồng cấu trúc lớp bacteriocin này có thể chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib

1.2.2.2 Lớp II

Còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng lượng phân tử nhỏ hơn, bền nhiệt và không chứa lanthionine Các bacteriocin nhóm II có thể chia thành 3 phân lớp, bao gồm IIa, IIb và IIc

 Lớp IIa

Lớp IIa là lớp lớn nhất, gồm các peptide kháng lại Listeria Đại diện đặc

trưng cho nhóm này là Leucocin A, Pediocin PA-1, Sakacin A, Sakacin P Các bacteriocin nhóm này hoạt động bằng cách phá vỡ tính toàn năng của màng tế bào, làm mất cân bằng và thất thoát ion phosphate hữu cơ do đó mà tiêu diệt vi khuẩn

 Lớp IIb

Lớp IIb hình thành bởi một phức của 2 peptide riêng biệt, những peptide này

ít hoặc không có hoạt động nào và nó không có sự giống nhau giữa các peptide bổ

sung Các bacteriocin nhóm này có thể hoạt động riêng lẻ, cũng có thể liên hiệp khi hoạt động cùng nhau (Enterocin L50A, L50B) tạo lỗ trên màng tế bào, hoặc chúng

có thể cùng cần thiết cho hoạt động kháng khuẩn (lactococcins Gα/Gβ, lactococcins M/N và plantaricins EF, JK)

III cho đến nay chỉ được phân lập từ các thành viên của loài Lactobacillus Đại diện cho nhóm này là Halveticin J được sản xuất bởi vi khuẩn L halveticus 481 và Helveticin V, Acidifilicin A, Lactacin A, Lactacin B được sản xuất bởi L acidophilus [29]

1.2.2.4 Lớp IV

Hiện nay, có rất ít tài liệu nghiên cứu về nhóm này Một cách tổng quát các bacteriocin nhóm IV được định nghĩa là bacteriocin phức tạp có chứa lipid hoặc các loại carbohydrate Bao gồm các glycoprotein (Lactocin 27), hoặc lipoprotein

(lacstrepcins) được quy định bởi non-protein [15]

1.2.3 Cơ chế tổng hợp của bacteriocin

Hầu hết các bacteriocin được tổng hợp là các tiền peptide không hoạt động sinh học mang một peptide dẫn đầu N được gắn vào đến đầu C Quá trình tổng hợp bacteriocin được chia thành hai kiểu chính

Quá trình sinh tổng hợp thứ nhất thuộc nhóm lantibiotic bao gồm: hình thành tiền peptide, tiền peptide được biến đổi bởi LanB và LanC, được dịch mã thông qua kênh vận chuyển ABC-transporter LanT, và được xử lý bởi LanP, hình thành bacteriocin, HPK (histinde protein kinase) nhận diện bacteriocin và tự động phosphoryl hóa, nhóm phosphoryl (P) này được truyền đến bộ điều chỉnh đáp ứng

RR để kích hoạt phiên mã gen điều hòa Đặc trưng miễn dịch của sinh vật sản xuất được tạo ra bởi các protein miễn dịch, LanI và protein chuyên dụng ABC (LanEFG) [11]

Hình 1.1 cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm I [11]

Quá trình tổng hợp thứ hai thuộc về nhóm non-lantibiotic Bacteriocin được tổng hợp như một tiền bacteriocin được tổng hợp như một tiền peptide chứa một đầu N được bảo toàn và một vị trí xử lý cắt glycine kép Bên cạnh sự hình thành tiền peptide một nhân tố cảm ứng IF ( induce factor) - một peptide có cấu trúc giống bacteriocin nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn, do đó HPK phải nhận diện IF

để truyền tín hiệu đến RR để kích hoạt tiếp quá trình phiên mã, tạo được bacteriocin hoàn chỉnh

Hình 1.2 cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm II [11]

1.2.4 Các đặc tính của bacteriocin

1.2.4.1 Thành phần hóa học

Bacteriocin có bản chất là protein Bản chất proteinđược kiểm tra bằng cách

sử dụng các enzyme đặc trưng như proteinase Một vài bacteriocin là protein đơn

giản Tuy nhiên, bacteriocin của Staphylococcus, Clostridium và Lactobacillus là

những phân tử phức tạp với thành phần lipid, carbohydrate và cộng thêm với protein [10, 51]

1.2.4.2 Độ bền

Hiện nay, một số nghiên cứu cho thấy rằng bacteriocin của mỗi loài có khả

năng chịu nhiệt ở một khoảng nhất định nhưng chủ yếu chúng thuộc nhóm I, II

Cũng như độ bền nhiệt, một số bacteriocin có thể hoạt động tốt ở những khoảng pH nhất định Những đặc tính này đều dựa vào bản chất thành phần cấu trúc của bacteriocin đó

Mỗi loại bacteriocin có thành phần cấu trúc các amino acid khác nhau nên sẽ chịu sự phân cắt đặc hiệu của các enzyme khác nhau, thích hợp với nó Bacteriocin mất đi hoạt tính kháng khuẩn khi bị phân cắt bởi các enzyme, đồng thời đây cũng là dấu hiệu giúp ta nhận biết được bacteriocin

Độ bền với nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương được trình bày ở Bảng 1.2

Bảng 1.2 Độ bền nhiệt, pH và enzyme của một số bacteriocin được sinh tổng

hợp bởi vi khuẩn [26]

Bacteriocin Độ bền nhiệt Độ bền

Megacin A-216 600C, 30 phút 2 – 7 Chymotrypsin, Pepsin, Trypsin Clostosin A 1000C, 30 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,

Pronase P, Rnase Clostosin B 800C, 10 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,

Pronase P, Rnase Clostosin C 800C, 10 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,

Pronase P, Rnase Clostosin D 1000C, 30 phút 4 – 9 Trypsin, Chymotrypsin, Dnase,

Pronase P, Rnase Boticin E-S5 1000C, 10 phút 1,1 – 9,5 Trypsin, Chymotrypsin, Dnase, Pepsin Bioticin P 600C, 30 phút 6,5 – 7,5 Trypsin, Rnase, Alkaline

phosphotase, Phospholipases C, D Butyricin 7423 1000C, 10 phút 2 – 12 Trypsin

Perfringocin 11105 1000C, 30 phút 2 – 12 Trypsin

1.2.5 Bacteriocin từ vi khuẩn lactic

1.2.5.1 Bacteriocin từ vi khuẩn lactic

Ngày nay, các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được nghiên cứu nhiều hơn do đặc trưng ưu việt của chúng trong bảo quản thực phẩm cũng như tính an toàn với người sử dụng Các bacteriocin phổ biến nhất do các chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp được tóm tắt trong Bảng 1.3 [66]

Bảng 1.3 Các bacteriocin phổ biến được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic [66]

Bacteriocin Vi khuẩn lactic sản sinh bacteriocin

Lactococcin MN Lactococcus lactis var cremoris

Plantaricin EF, Plantaricin W L plantarum spp

Plantaricin JK, Plantaricin S

1.2.5.2 Bacteriocin từ vi khuẩn L plantarum

Bacteriocin sinh tổng hợp từ L.plantarum đã được phát hiện và nghiên cứu

Đặc điểm của một số bacteriocin từ L plantarum phân lập từ các nguồn khác nhau được thống kê trong Bảng 1.4 [45]

Bảng 1.4 Một số bacteriocin sản xuất bởi L.plantarum được phân lập từ các

mẫu thực phẩm khác nhau [45]

L plantarum ST16MS

ST28MS, ST16MS

L plantarum C11 Plantaricin EF

Plantaricin JK Plantaricin A

L plantarum LPC010 Plantaricin S

Plantaricin T

L plantarum 163 Plantaricin 163 Các sản phẩm

từ sữa

1.2.6 Một số phương pháp tinh sạch bacterioicin từ Lactobacillus plantarum

Quá trình tinh sạch là bước cần thiết để nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc phân

tử, trình tự amino axit, cơ chế hoạt động, các đặc tính của bacteriocin cũng như xác

định những thông tin về trọng lượng phân tử Một số phương pháp tinh sạch bacteriocin được sinh tổng hợp từ vi khuẩn lacticlà chiết dung môi, siêu lọc, hấp phụ - giải hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, kết tủa bằng muối, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Trong đó, HPLC là kỹ thuật được áp dụng phổ biến nhất bởi mức độ tinh sạch cao và chính xác Kết quả tinh sạch một số bacteriocin sinh

tổng hợp bởi vi khuẩn Lactobacillus plantarum được trình bày trong Bảng 1.3

Bảng 1.3 Tinh sạch một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn

Kết tủa bằng muối amonium sunphat

BacTN635

Kết tủa bằng muối amonium sunphat

Plantaricin ASM1

Kết tủa bằng muối amonium sunphat

1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn lactic

1.3.1 Ứng dụng vi khuẩn lactic

1.3.1.1 Ứng dụng vi khuẩn lactic nói chung

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp, nông nghiệp, y dược, và nhiều nhất trong chế biến và bảo quản thực phẩm Trong công nghiệp:vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu acid lactic Trong nông nghiệp và môi trường: vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của

Fusarium, loại nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp Chế phẩm EM

(Effecive Microorganism) hay chế phẩm vi sinh bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó

có sự góp phần của vi khuẩn lactic có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng

và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường Trong y dược: gần đây con người phát hiện một vai trò lớn của vi khuẩn lactic đối với sức khỏe con người cũng như các động vật nuôi Một số vi khuẩn lactic sinh “kháng sinh” được sử dụng làm chế phẩm ‘men tiêu hóa sống” probiotic để chữa một số bệnh rối loạn tiêu hóa, tiêu

chảy và phục hồi cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột Ví dụ Laxitophilus, khi được

bổ sung vào đường tiêu hóa, chúng phát triển tại ruột gà, ức chế một số vi khuẩn gây bệnh Nhờ vào khả năng sinh lactic acid và bacteriocin trong đường ruột,

Lactobacillus cải thiện được tình trạng tiêu chảy, tăng nhu động ruột, chữa được chứng táo bón Các chế phẩm chứa Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa

trị các bệnh rối loạn và viêm nhiễm [45]

1.3.1.2 Ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus plantarum

Rất nhiều ứng dụng gắn liền với L plantarum trong quá trình sản xuất các chế

phẩm probiotic đã được công bố trên các tạp chí khoa học uy tín Hầu hết các nghiên

cứu đều cho rằng, vi khuẩn lactic nói chung và L plantarum nói riêng có vai trò bảo

vệ, tăng cường chức năng đường ruột và cải thiện các triệu chứng ruột kích thích

Ngoài ra, L plantarum còn tác động tích cực đến hệ vi sinh vật trong đường ruột, quá

trình chuyển hóa lipit và làm giảm hội chứng viêm [45]

Vi khuẩn L plantarum có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin trong nhiều

nguồn thực phẩm khác nhau, do vậy nó góp phần cải thiện đặc tính cảm quan và đóng một vai trò thiết yếu trong việc kéo dài thời hạn sử dụng thực phẩm Do vậy,

L plantarum đáp ứng các yêu cầu của người tiêu dùng trong việc sử dụng thực

phẩm tươi sống và thực phẩm đóng gói chứa ít hàm lượng chất bảo quản Trong

lĩnh vực y học, các ứng dụng của L plantarum được các nhà khoa học quan tâm

nhờ khả năng bảo vệ bề mặt da và điều trị nhiễm trùng vết thương gây ra do bỏng

Một ứng dụng khác của L plantarum liên quan đến việc xử lý mùi phân của

heo, đặc biệt là ở các trang trại lớn Bình thường, chế độ ăn uống có thể giảm bớt mùi hôi này nhưng lại tốn kém và hạn chế khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng

Trong khi đó, việc bổ sung vi khuẩn L plantarum vào chế độ ăn của heo làm giảm

đáng kể mùi phân của heo mà không ảnh hưởng đến quá trình tiêu hóa thức ăn

Bên cạnh vai trò là giống khởi động trong quá trình lên men thực phẩm, vi

khuẩn L plantarum và bacteriocin của nó cũng được ứng dụng rộng rãi trong sản phẩm probiotic Nhờ khả năng ngăn chặn sự bám dính của E coli vào màng nhầy,

L plantarum làm giảm hoạt động của nội độc tố do E coli tiết ra, đồng thời đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại các vi sinh vật gây bệnh Ngoài ra, L plantarum cũng hỗ trợ tiêu hóa các chất xơ có trong lúa mì, lúa mạch đen, men

bia,… Do đó, những vấn đề tiêu hóa như đầy hơi, chướng bụng được cải thiện

đáng kể [45]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu bacteriocin

Bacteriocin mang lại nhiều lợi ích và ứng dụng trong cuộc sống của con người nhờ các tính chất đặc trưng của chúng Tuy vậy, vẫn còn khá nhiều vấn đề liên quan đến bacteriocin vẫn cần được làm sáng tỏ Điều này đã thôi thúc các nhà khoa học bắt tay vào nghiên cứu và đã có rất nhiều công trình đã được ứng

dụng thành công vào thực tế, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống

1.3.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Budu-Amoako E cùng cộng sự đã nghiên cứu hiệu quả tiêu diệt Listeria monocytogenes trong các thùng chứa bảo quản tôm hùm khi kết hợp nisin và nhiệt

độ Năm 2006, Marcinowski đã phát triển kẹo cao su có chứa chủng vi khuẩn

Lactobacillus có lợi Nhóm tác giả Todorov và Dicks K M đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân

lập từ boza (một loại đồ uống ngọt lên men từ lúa mì ở Thổ Nhỹ Kỳ) Bacteriocin

ST712BZ (kích thước 14 kDa) ức chế sự phát triển của Lactobacillus casei, E coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococus faecalis, Klebsiellapneumoniae và Lactobacillus curvatus Một nghiên cứu khác của Satish Kumar R, Arul V đã tách chiết một loại bacteriocin, phocaecin PI80, sinh tổng hợp từ chủng Streptococus phocae PI80 phân lập từ tôm thẻ chân trắng Ấn Độ Chất kháng khuẩn ức chế một

số tác nhân gây bệnh quan trọng như: Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, V fischeri [35] Năm 2011, Ozdemir cùng cộng sự đã xây dựng một bộ sưu tập gồm 57 chủng Enterococcal phân lập từ các nguồn khác nhau (bao

gồm nước sông, nước thải, đất, động vật, và các loại rau), được sử dụng để sản xuất bacteriocin [42] Đến năm 2012, Samar L cùng cộng sự đã tìm ra một loại bacteriocin mới (lacticin LC14) Lacticin LC14 cho thấy khả năng diệt khuẩn cũng như sinh tổng hợp nhiều hợp chất kháng khuẩn tiêu diệt một số vi khuẩn lactic và

các chủng gây bệnh bao gồm cả vi khuẩn Listeria monocytogenes [48]

Năm 1990, Daeschel và cộng sự đã nghiên cứu bacteriocin từ vi khuẩn L plantarum C11 phân lập từ rau quả Hai loại bacteriocin sản sinh từ vi khuẩn này là

plantaricin EF và plantaricin JK có khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh như

Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Leuconostoc sp và Streptococcus sp [12] Yang

R., Joshnon M.C và Ray B (1992) đã nghiên cứu phương pháp mới để chiết tách một lượng lớn bacteriocin từ vi khuẩn lactic Năm 1993, nhà khoa học Díaz cùng các cộng sự đã phát hiện ra 2 loại bacteriocin là plantaricin S và plantaricin T Hai

bacteriocin này được sinh tổng hợp từ chủng vi khuẩn L plantarum LPC010 và có khả năng ức chế Propionibacterium sp., Clostridium tyrobutyricum và Enterococcus faecalis Bacteriocin plantaricin F sinh tổng hợp bởi vi khuẩn L plantarum BF001 trong những nghiên cứu của Fricourt và cộng sự (1995) có khối

lượng phân tử nằm trong khoảng 0,4 – 6,7 kDa [16] Những nghiên cứu xoay quanh

vi khuẩn L plantarum UG1 phân lập từ thịt và bacteriocin của nó, được tiến hành

bởi Enan và cộng sự (1996) [44] Nhà khoa học Reenen cùng đồng nghiệp đã có những thông tin bước đầu về khối lượng phân tử của bacteriocin plantaricin 423 (khoảng 3,5 kDa) Nhóm tác giả Todorov S., Reenen C V., Dicks L đã nghiên cứu

khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng L plantarum ST13BR được phân lập

từ bia Barley Bacteriocin của L plantarum ST13BR có kích thước phân tử 10 kDa

và ức chế sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus casein, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae và E coli [66] Và gần

đây nhất vào năm 2016, Hu và cộng sự đã tách chiết bacteriocin 163-1 có khối lượng

phân tử là 825 Da được sinh tổng hợp bởi chủng vi khuẩn L plantarum 163 phân lập

từ củ cải muối Bacteriocin 163-1 có khả năng chống lại những tác nhân gây bệnh bao gồm vi khuẩn Gram dương và Gram âm [27]

1.3.2.2 Các nghiên cứu trong nước

Cũng như nhiều nước trên thế giới, các nhà khoa học Việt Nam cũng rất quan tâm đến bacteriocin và có không ít những công trình khoa học nghiên cứu về vấn đề này Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu này vẫn chỉ tập trung vào xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu của chủng LAB sinh tổng hợp bacteriocin, định danh các chủng và xác định một số tính chất hóa sinh của bacteriocin cũng như độ nhạy của chúng với enzyme

Năm 2002, Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic L24 phân lập từ

nước dưa Các phân tích trình tự rADN 16S cho thấy chủng L24 thuộc loài L plantarum [1] Năm 2004, TS Lê Thị Hồng Tuyết, TS Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu sơ bộ về một số đặc tính của bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus acidophilus [6] Vi khuẩn L acidophilus sản xuất bacteriocin có khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm như E coli, Salmonella và một số vi

khuẩn lactic khác Một nghiên cứu khác của TS Phạm Thùy Linh về khả năng tạo chất diệt khuẩn Enterocin P tái tổ hợp nhằm ứng dụng trong bảo quản thực phẩm Đây là nghiên cứu đầu tiên về tạo bacteriocin tái tổ hợp một cách có hệ thống tại