MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam là một nước có vị trí địa lý nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, địa hình nhiều đồi núi chia cắt nên điều kiện khí hậu cũng rất đa dạng, có nhiều tiểu vùng khí hậu khá đặc trưng. Những yếu tố trên đã tạo nên những hệ sinh thái, thảm thực vật nhiệt đới phong phú và phát triển với nhiều loài thực vật quý hiếm mà trên thế giới không có [1, 2]. Theo ước tính, nước ta hiện có khoảng 12000 loài thực vật thuộc hơn 2256 chi, 305 họ (chiếm 4% tổng số loài, 15% tổng số chi và 57% tổng số họ thực vật trên thế giới) đã được phát hiện và ghi nhận, những cây thuốc này đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống của người dân Việt Nam, 1/3 trong tổng số các loài thực vật này đã được sử dụng trong y học cổ truyền và các mục đích khác phục vụ cho đời sống con người [3, 4]. Tuy nhiên, trong số đó mới chỉ có khoảng dưới 2% được nghiên cứu hiện đại về mặt hóa học và dược lý học [5]. Ngoài sự phong phú về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn có giá trị to lớn trong việc điều trị các căn bệnh khác nhau trong dân gian. Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức độc vị hay phối hợp với nhau tạo nên các bài thuốc cổ phương, đang tồn tại phát triển đến tận ngày nay. Ngoài ra, hàng trăm cây thuốc đã được khoa học y - dược hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng. Xu hướng đi sâu nghiên cứu các cây thuốc và động vật làm thuốc để tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao nhằm sản xuất các loại thuốc có giá trị cao phục vụ cuộc sống ngày càng được thế giới quan tâm [2]. Việc sử dụng các loại thảo dược theo cổ truyền hay các hợp chất nguồn gốc thiên nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học, sinh học, công nghiệp và nông nghiệp thực phẩm. Chế phẩm thảo dược có thể bao gồm một hay nhiều loại dược liệu nhưng trong đó lại chứa hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau, và trong mọi trường hợp hầu hết đều chưa xác định rõ hoạt chất của từng chất. Trong vài năm trở lại đây, đã xuất hiện một số công trình nghiên cứu về các nhóm cây có ích, trong đó nhóm cây có hoạt tính sinh học ngày càng được quan tâm và nghiên cứu có hệ thống. Có thể nói, nhóm cây có hoạt tính sinh học có nhiều ý nghĩa trong đời sống xã hội của loài người, đặc biệt là giá trị sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Vì vậy, những bài thuốc sử dụng thảo dược là đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên. Từ đó, định hướng cho việc nghiên cứu, chiết xuất để tìm ra các loại hoạt chất mới hay các hợp chất có hoạt tính mạnh trong việc chữa trị nhiều căn bệnh khác nhau.Các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên từ sinh vật nói chung và từ thực vật nói riêng thể hiện hoạt tính sinh học rất phong phú và đặc biệt như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống ung thư, kháng virus, chống sốt rét, điều hòa miễn dịch… Đây là nguồn nguyên liệu lý tưởng để tạo ra nhiều loại thuốc mới chữa bệnh, đặc biệt là các căn bệnh hiểm nghèo, các sản phẩm thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng và điều trị bệnh, các chế phẩm phục vụ nông nghiệp và thủy hải sản (thuốc phòng và chữa bệnh dịch cho động vật, diệt côn trùng, điều hòa sinh trưởng, phát triển…) có hoạt tính cao mà không ảnh hưởng đến môi sinh. Chính vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI HOÀNG ĐỨC THUẬN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY RÂU MÈO (ORTHOSIPHON STAMINEUS BENTH.) VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu Mã số: 9.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Quốc Trung TS Nguyễn Phi Hùng HÀ NỘI – 2020 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Đối tượng nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu 4 Phương pháp nghiên cứu Những đóng góp luận án Cấu trúc luận án CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Chi Orthosiphon Râu mèo (Orthosiphon stamineus) 1.1.1 Sơ lược chi Orthosiphon 1.1.2 Sơ lược Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) 1.2 Tình hình nghiên cứu Râu mèo 10 1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 10 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước Râu mèo 26 Tiểu kết chƣơng I 28 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 30 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .30 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Điều tra, nghiên cứu phân bố, thu thập mẫu thực vật bảo quản 30 2.2.2 Phương pháp xử lý chiết mẫu 30 2.2.3 Phương pháp phân lập tinh chế hợp chất 31 2.2.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 32 2.2.5 Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học 32 2.3 Hóa chất thiết bị 34 2.3.1 Hoá chất 34 2.3.2 Thiết bị 34 2.4 Phân tích thống kê kết .36 2.5 Phân lập tinh chế hợp chất từ Râu mèo .37 2.5.1 Phân lập tinh chế hợp chất từ phân đoạn BuOH 39 2.5.2 Phân lập tinh chế hợp chất từ phân đoạn EtOAc 42 2.5.3 Phân lập tinh chế hợp chất từ phân đoạn CHCl3 45 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Kết thu thập xác định tên khoa học mẫu thực vật 47 3.2 Kết phân lập tinh chế hợp chất 49 3.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc từ phân đoạn BuOH 51 3.3.1 Hợp chất B1 (OSB-7.4.2): Lithospermic acid 51 3.3.2 Hợp chất B2 (OSB-7.4.4): Hợp chất 54 3.3.3 Hợp chất B3 (OSB-7.5.4): 9-Methyl lithospermate 58 3.3.4 Hợp chất B4 (OSB-3.3.1): (S)-()-rosmarinic acid 61 3.3.5 Hợp chất B5 (OSB-3.3.2): (R)-()-rosmarinic acid 62 3.3.6 Hợp chất B6 (OSB-3.3.3): methyl rosmarinate 63 3.3.7 Hợp chất B7 (OSB-7.1.2): Clinopodic acid A 64 3.3.8 Hợp chất B8 (OSB-7.4.2.1): Clinopodic acid B 65 3.3.9 Hợp chất B9 (OSB-7.1.1): Astragalin 67 3.3.10 Hợp chất B10 (OSB-1.1.1): 3-(3,4-dihydroxyphenyl)lactic acid 69 3.3.11 Hợp chất B11 (OSB-1.2.0): Protocatechuic acid 70 3.3.12 Hợp chất B12 (OSB-1.2.1): Dihydrocaffeic acid 70 3.3.13 Hợp chất B13 (OSB-1.2.2): p-hydroxybenzoic acid 71 3.3.14 Hợp chất B14 (OSB-2.1.1): Oresbiusin A 72 3.3.15 Hợp chất B15 (OSB-2.1.2): Caffeic acid 73 3.3.16 Hợp chất B16 (OSB-2.3.1): Methyl 3,4-dihydroxycinnamate 74 3.3.17 Hợp chất B17 (OSB-2.3.2): Vanillic acid 76 3.4 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc từ phân đoạn EtOAc 78 3.4.1 Hợp chất E18 (OSEA-12.1.1): 3,7,3′,4'-tetramethylquercetin 78 3.4.2 Hợp chất E19 (OSEA-11.9): 3,5-dihydroxy-7,4'-dimethoxyflavone 80 3.4.3 Hợp chất E20 (OSEA-11.6.3): 5,7,4'-trimethoxyflavone hay 5,7,4'trimethylapigenin 81 3.4.4 Hợp chất E21 (OSEA-11.1.5.1): pentamethylquercetin 82 3.4.5 Hợp chất E22 (OSEA-11.1.4.0): 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone 83 3.4.6 Hợp chất E23 (OSEA-11.1.4.1): 3,5,7,4'-tetramethoxyflavone 84 3.4.7 Hợp chất E24 (OSEA-10.6.1): 5,7,2′,5′-tetramethoxyflavone 86 3.4.8 Hợp chất E25 (OSEA-10.5.1): 3-hydroxy-5,7,4′-trimethoxyflavone 87 3.4.9 Hợp chất E26 (OSEA-10.5.2): 5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone 88 3.4.10 Hợp chất E27 (OSEA-10.2.1): 7-hydroxy-3,5,3′,4′-tetramethoxyflavone 90 3.4.11 Hợp chất E28 (OSEA-10.2.2): 7,3′,4′-trimethylquercetin 91 3.4.12 Hợp chất E29 (OSEA-9.6.1): 3,5,3′-trihydroxy-7,4′-dimethoxyflavone 93 3.4.13 Hợp chất E30 (OSEA-9.6.2): 5,7,3′,4′-tetramethylquercetin 94 3.4.14 Hợp chất E31 (OSEA-9.6.3): 5,7,4′-trimethylquercetin 95 3.4.15 Hợp chất E32 (OSEA-9.6.11): 5,6,7,3',4'-pentamethoxyflavanone 96 3.4.16 Hợp chất E33 (OSEA-9.6.12): 5′-hydroxy-5,7,3′,4′-tetramethoxyflavanone 98 3.5 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc từ phân đoạn CHCl3 100 3.5.1 Hợp chất C34 (OSC-1.5): orthosiphol F 100 3.5.2 Hợp chất C35 (OSC-1.4.4): siphonol D 102 3.5.3 Hợp chất C36 (OSC-1.4.3): siphonol B 105 3.5.4 Hợp chất C37 (OSC-1.5.3): orthosiphol I 107 3.5.5 Hợp chất C38 (OSC-1.5.2): orthosiphol G 108 3.5.6 Hợp chất C39 (OSC-1.3.2): orthosiphol B 110 3.5.7 Hợp chất C40 (OSC-1.3.1): orthosiphol N 112 3.6 Kết đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất 114 3.6.1 Hoạt tính sinh học hợp chất phenylpropanoids (B1B17) phân lập từ phân đoạn BuOH 114 3.6.2 Hoạt tính sinh học hợp chất flavonoids (E18E33) phân lập từ phân đoạn EtOAc 119 3.6.3 Hoạt tính sinh học hợp chất pimarane-diterpenes (C34C40) phân lập từ phân đoạn CHCl3 122 KẾT LUẬN 127 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO 132 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 13 Carbon-13 Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon- Spectroscopy 13 Proton Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton C-NMR H-NMR Spectroscopy ACN Acetonitrile Acetonitrile CC Column Chromatography Sắc kí cột FC Flash Chromatography Sắc ký cột nhanh HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography CTPT Molecular formula Cơng thức phân tử Đ.n.c Melting point Điểm nóng chảy DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxide EI-MS Electron Impact-Mass Phổ khối va chạm electron Spectroscopy ESI-MS Electron Spray Ionzation-Mass Phổ khối lượng phun mù electron Spectroscopy Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều Correlation liên kết H→C HR-ESI- High Relution-Electron Spray Phổ khối lượng phân giải cao phun MS Impact Mass Spectroscopy mù electron HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân trực tiếp Correlation H→C Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử HMBC IC50 nghiệm IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại Hằng số tương tác tính Hz J (Hz) KLPT Molecular weight Khối lượng phân tử MDA468 Human breast cancer cell line Tế bào ung thư vú di ác tính MeOH Methanol Methanol MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng ppm parts per million Phần triệu RT retention time Thời gian lưu TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng TLTK Reference Tài liệu tham khảo TMS Tetramethylsilan Tetramethylsilan Số thứ tự TT δC Carbon chemical shift Độ chuyển dịch hóa học carbon δH Proton chemical shift Độ chuyển dịch hóa học proton br s Broad singlet singlet tù d Doublet doublet dd Doublet of doublet doublet doublet dt Doublet of triplet doublet triplet m Multiplet multiplet s Singlet singlet t Triplet Triplet PTP1B Protein Tyrosine Phosphatase 1B Enzyme protein tyrosine phosphatase 1B 2-NBDG 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3benzoxadiazol-4-yl)amino]-Dglucose DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách hợp chất phân lập từ Râu mèo 49 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) hợp chất B1 53 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) hợp chất B2 57 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, methanol-d4) 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) hợp chất B3 hợp chất B1: 60 Bảng 3.5 Số liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) hợp chất B4 hợp chất tham khảo rosmarinic acid 62 Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) hợp chất B5 hợp chất tham khảo rosmarinic acid 62 Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) hợp chất B6 hợp chất methyl rosmarinate 64 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, methanol-d4) 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) hợp chất B7 hợp chất clinopodic acid A: 65 Bảng Dữ liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) hợp chất B8 hợp chất tham khảo clinopodic acid B: 66 Bảng 3.10 Dữ liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) hợp chất B9 hợp chất astragalin: 68 Bảng 3.11 Tác dụng ức chế enzyme PTP1B cao tổng hợp chất phenylpropanoids (B1B17) phân lập từ phân đoạn BuOH Râu mèo 116 Bảng 3.12 Tác dụng ức chế enzyme PTP1B hợp chất flavonoids (E18E33) phân lập từ phân đoạn EtOAc Râu mèo 119 Bảng 3.13 Tác dụng gây độc tế bào hợp chất (E18E33) phân lập từ phân đoạn EtOAc Râu mèo 121 Bảng 3.14 Tác dụng ức chế enzyme PTP1B hợp chất pimaranediterpenes (C34C40) phân lập từ phân đoạn CHCl3 Râu mèo 122 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh phần mặt đất Râu mèo Hình 1.2 Hình ảnh Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) Ngọc Hồi, huyện Thanh Trì, thành phố Hà Nội Hình 1.3 Các hợp chất flavonoids phân lập từ Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) 12 Hình 1.4 Các hợp chất diterpenes khung pimarane phân lập từ Râu mèo 15 Hình 1.5 Các hợp chất diterpenes khung pimarane phân lập từ Râu mèo (tiếp) 16 Hình 1.6 Các hợp chất diterpenes phân lập từ loài Râu mèo (Orthosiphon aristatus var aristatus) 16 Hình 1.7 Các hợp chất triterpenoids phân lập từ Râu mèo 17 Hình 1.8 Các hợp chất phenylpropanoids phân lập từ Râu mèo 18 Hình 1.9 Các hợp chất hóa học khác phân lập nhận dạng từ Râu mèo 19 Hình 1.10 Các hợp chất monoterpenes sesquiterpenes thành phần tinh dầu Râu mèo (Orthosiphon aristatus) 20 Hình 1.11 Các hợp chất monoterpenes sesquiterpenes thành phần tinh dầu Râu mèo (Orthosiphon aristatus) (tiếp) 21 Hình1.12.Các hoạt chất phân lập từ Râu mèo (Orthosiphon staminues Benth.) Việt Nam 28 Hình 2.1.Quá trình ngâm chiết mẫu dược liệu Râu mèo sử dụng máy siêu âm 37 Hình 2.2 Quá trình lọc mẫu, cô quay đuổi dung môi thu hồi cao chiết 38 Hình 3.1 Hình ảnh Râu mèo tươi thu hái Hà Nội Thái Nguyên 47 Hình 3.2 Hình ảnh tiêu mẫu dược liệu Râu mèo (OS201701.HN) 48 Hình 3.3 Cấu trúc hóa học tín hiệu tương tác HMBC hợp chất B1 52 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học hợp chất B2 54 PL-96 Phụ lục 190 Phổ 13C NMR hợp chất C38 Phụ lục 191 Phổ 13C NMR hợp chất C38 PL-97 Phụ lục 192 Phổ HMBC NMR hợp chất C38 Phụ lục 193 Phổ HMBC NMR hợp chất C38 PL-98 Phụ lục 194 Phổ HMBC NMR hợp chất C38 Phụ lục 195 Phổ HMBC NMR hợp chất C38 PL-99 Phụ lục 196 Phổ HMBC NMR hợp chất C38 Phụ lục 197 Phổ HMBC NMR hợp chất C38 PL-100 39 Phụ lục phổ hợp chất C39 (OSC-1.3.2): orthosiphol B Phụ lục 198 Phổ 1H NMR hợp chất C39 Phụ lục 199 Phổ 1H NMR hợp chất C39 PL-101 Phụ lục 200 Phổ 1H NMR hợp chất C39 Phụ lục 201 Phổ 13C NMR hợp chất C39 PL-102 Phụ lục 202 Phổ 13C NMR hợp chất C39 Phụ lục 203 Phổ HSQC NMR hợp chất C39 PL-103 Phụ lục 204 Phổ HSQC NMR hợp chất C39 Phụ lục 205 Phổ HSQC NMR hợp chất C39 PL-104 Phụ lục 206 Phổ COSY NMR hợp chất C39 Phụ lục 207 Phổ HMBC NMR hợp chất C39 PL-105 Phụ lục 208 Phổ HMBC NMR hợp chất C39 Phụ lục 209 Phổ HMBC NMR hợp chất C39 PL-106 Phụ lục 210 Phổ HMBC NMR hợp chất C39 Phụ lục 211 Phổ HMBC NMR hợp chất C39 PL-107 Phụ lục 212 Phổ HMBC NMR hợp chất C39 Phụ lục 213 Phổ HMBC NMR hợp chất C39 PL-108 40 Phụ lục phổ hợp chất C40 (OSC-1.3.1): orthosiphol N Phụ lục 214 Phổ 1H NMR hợp chất C40 Phụ lục 215 Phổ 1H NMR hợp chất C40 PL-109 Phụ lục 216 Phổ 1H NMR hợp chất C40 Phụ lục 217 Phổ 13C NMR hợp chất C40 PL-110 Phụ lục 218 Phổ 13C NMR hợp chất C40 ... Tình hình nghiên cứu nước 1.2.1.1 Các nghiên cứu thành phần hóa học Râu mèo Các nghiên cứu thành phần hóa học Râu mèo thực từ sớm, có khoảng 120 hợp chất hóa học phân lập nhận dạng từ Râu mèo bao... hoạt tính sinh học Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth) Việt Nam? ?? để nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu chúng tơi chọn tồn phần mặt đất Râu mèo thu hái Trung tâm nghiên cứu. .. đề nghiên cứu cách hệ thống thành phần hóa học tác dụng sinh học cụ thể chống tiểu đường, béo phì chống ung thư loài Râu mèo Việt Nam thực Do vậy, chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt