Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá đu đủ rừng (trevesia palmata (roxb ex lindl ) vis , họ nhân sâm araliaceae) tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG (Trevesia palmata (Roxb e x Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliace ae) Chuyên ngành : Công nghệ dược phẩm Bào chế thuốc Mã số : 9720202 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC HÀ NỘI- NĂM 2020 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Võ Xuân Minh PGS.TS Đỗ Quyên Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Ngọc Chiến Phản biện 2: PGS.TS Trần Việt Hùng Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Văn Minh Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Học viện Quân y vào hồi: 00 ngày tháng năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc Gia Thư viện Học viện Quân y DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Lê Thị Thanh Thảo, Đỗ Quyên, Nguyễn Thị Ngọc, Lê Thanh Sơn, Bùi Hữu Tài, Phan Văn Kiệm (2016), “Phân lập số hợp chất saponin từ Đu đủ rừng (Trevesia palmata)”, Tạp chí Y-Dược học Quân số chuyên đề Dược, tr 23-31 Le Thi Thanh Thao, Do Quyen, Duong Binh Vu and Phan Van Kiem (2018), “New acetylated saponins from the leaves of Trevesia palmata”, Natural Product Communications, Vol 12, N001-2, p.407-410 Le Thi Thanh Thao, Nguyen Trong Diep, Nguyen Hong Van, Nguyen Nu Huyen My, Vo Xuan Minh (2019), “Study on the extraction of total saponin from folium Trevesiae palmatae using Ultrasonic method” Tạp chí Y-Dược học Quân sự, số tháng 12/2019, p.175-180 Lê Thị Thanh Thảo, Đỗ Quyên, Nguyễn Hồng Vân, Võ Xuân Minh (2020), “Đánh giá ảnh hưởng yếu tố, thông số qui trình phun sấy đến chất lượng cao khô đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb ex Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae)” Tạp chí Y học Việt Nam, số tháng 5/2020, p 73-78 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt A Aer AO BC C 13 C-NMR CI CR/DP 10 11 12 13 14 15 cs Cyc DĐVN DM/DL ĐĐR EtOH HMBC 16 HPLC 17 18 19 20 HS chiết HSPL HSPS HR-ESIMS 21 IL Phần viết đầy đủ Độ hấp thụ quang Aerosil Acid oleanolic Bạch cầu Nồng độ Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ carbon 13) Carr's compressibility index (Chỉ số nén Carr) tỷ lệ % (khối lượng/khối lượng) chất rắn tổng khối lượng dịch phun sấy Cộng Cyclophosphamid Dược điển Việt Nam Dung môi/dược liệu (ml/g) Đu đủ rừng Ethanol Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy (Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) Hiệu suất chiết Hệ số pha loãng Hiệu suất phun sấy High resolution - electrospray ionization - mass spectroscopy (Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử) Interleukin 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 INF KLCT KTTP KLRbk LD50 LOD LOQ M Mal MeOH m/z OA RSD 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 SPN SD SE STT TCCS TCMD TD/CR TLC KLLTĐ KLTƯTĐ TB TNF UV – VIS Interferon Khối lượng thể Kích thước tiểu phân Khối lượng riêng biểu kiến Lethal Dose 50 (Liều gây chết 50% số vật thử) Limit of detection (Giới hạn phát hiện) Limit of Quantification (Giới hạn định lượng) Khối lượng Maltodextrin Methanol Mass to charge ratio (tỉ lệ khối lượng/điện tích) Ovalbumin + Al(OH)3 Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) Hàm lượng Saponin toàn phần Standard deviation (Độ lệch chuẩn) Standard error (Sai số chuẩn) Số thứ tự Tiêu chuẩn sở Tăng cường miễn dịch Tá dược/Chất rắn Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) Khối lượng lách tương đối Khối lượng tuyến ức tương đối Trung bình Tumor necrosis factor (Yếu tố hoại tử khối u) Ultraviolet-visible (Tử ngoại - khả kiến) ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh suy giảm miễn dịch nhóm tình trạng khác gây nên hay nhiều khiếm khuyết hệ miễn dịch biểu lâm sàng gia tăng tình trạng dễ mắc bệnh nhiễm trùng Ngày nay, bệnh suy giảm miễn dịch có xu hướng ngày gia tăng với hậu cấp tính, tái diễn hay mạn tính thường nặng nề Hiện nay, quan quản lý Thực phẩm Thuốc Hoa Kỳ (US FDA) cấp phép cho nhiều thuốc có tác dụng điều trị cho bệnh nhân suy giảm miễn dịch dùng lâm sàng Các thuốc tăng cường miễn dịch (TCMD) có nguồn gốc phong phú, chất có nguồn gốc từ chế phẩm sinh học (Immunoglobulin, Interferon, …) sản phẩm công nghệ đại, giá thành cịn cao Các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược thường có nhiều tác dụng khơng mong muốn Có nhiều nghiên cứu tác dụng TCMD lồi thực vật cơng bố Đặc biệt, số nhóm hợp chất thiên nhiên, nhóm chất saponin nhóm có tác dụng TCMD bật Đu đủ rừng (ĐĐR, Trevesia palmata (Roxb ex Lindl.) Vis họ Nhân sâm Araliaceae) nhỡ, mọc nhiều dễ mọc bìa rừng hay rừng tái sinh Với nguyên liệu nghiên cứu lá, nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có khu vực Hà Giang, Ba Vì, Cúc Phương, Phú Thọ…, nên việc thu hái không làm ảnh hưởng đến môi trường sinh thái hay đa dạng sinh học Cho đến nay, ĐĐR Việt Nam sử dụng theo kinh nghiệm dân gian lấy lõi thân thay cho vị thuốc thông thảo Trên giới có nghiên cứu lồi chưa có chế phẩm có tác dụng TCMD từ ĐĐR nghiên cứu Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch cao khô Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb ex Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliace ae)” nghiên cứu với mục tiêu sau: Xây dựng qui trình bào chế cao khơ Đu đủ rừng qui mơ phịng thí nghiệm Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng bước đầu đánh giá độ ổn định cao k hô Đu đủ rừng Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch độc tính cao khơ Đu đủ rừng động vật thực nghiệm *Những đóng góp luận án: Đã xác định nhóm chất có ĐĐR saponin Đã phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất saponin, có chất Đã xây dựng thẩm định TCCL ĐĐR Đã khảo sát xây dựng qui trình chiết xuất cao ĐĐR qui mô kg dược liệu/mẻ, qui trình bào chế cao khơ ĐĐR phương pháp phun sấy Đã xây dựng thẩm định TCCL sản phẩm cao khô ĐĐR Sản phẩm ổn định điều kiện nghiên cứu Đã đánh giá tác dụng TCMD động vật thực nghiệm, cho thấy sản phẩm bào chế có khả cải thiện đáp ứng miễn dịch động vật thực nghiệm *Nội dung cấu trúc luận án: Luận án bao gồm 147 trang Đặt vấn đề: trang; chương (tổng quan): 27 trang; chương (nguyên liệu, thiết bị, đối tượng phương pháp nghiên cứu): 23 trang; chương (kết nghiên cứu): 66 trang; chương (bàn luận): 26 trang; kết luận kiến nghị: trang * Tài liệu tham khảo: Luận án bao gồm 107 tài liệu, có 84 tài liệu tiếng Anh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan luận án cập nhật vấn đề: - Về ĐĐR: Đặc điểm thực vật phân bố, thành phần hóa học, tác dụng sinh học dược lý công bố, công dụng-liều dùng dùng theo dân gian - Cao thuốc: khái niệm; phân loại theo DĐVN V DĐ Châu Âu giai đoạn kỹ thuật điều chế cao thuốc: chiết xuất làm khơ Trong có trình bày chiết xuất siêu âm làm khô phun sấy kỹ thuật sử dụng luận án - Mô hình đánh giá tác dụng TCMD: in vitro invivo: tổng quan mơ hình nghiên cứu nước giới CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên vật liệu Lá ĐĐR thu hái vào tháng 5/2015, nguyên liệu rửa sạch, sấy khô (40oC) tủ sấy có quạt gió đến độ ẩm 12%, làm nhỏ đến kích thước mong muốn bảo quản túi nilon kín, để nơi thống mát, khô Để xây dựng TCCS mẫu thu hái tỉnh Việt Nam Nghiên cứu chiết xuất, phân lập, bào chế sử dụng mẫu thu hái Hà Giang 2.1.2 Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng trưởng thành dịng Swiss, khơng phân biệt giống, cân nặng 18 - 22 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp; Chuột cống trắng trưởng thành, dịng Wistar, khơng phân biệt giống, cân nặng thời điểm bắt đầu thí nghiệm 160 - 180 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm ban chăn ni Học viện Quân Y cung cấp 2.1.3 Thuốc thử, hóa chất, dung mơi Các thuốc thử, hóa chất, dung mơi, trang thiết bị đạt tiêu chuẩn cho nghiên cứu chiết xuất, phân lập hợp chất; xây dựng tiêu chuẩn; bào chế; đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch độc tính 2.1.4 Máy móc, trang thiết bị nghiên cứu Các thiết bị đặc thù: thiết bị chiết siêu âm (SONY MEDI SM30- CEP, Hàn Quốc), thiết bị phun sấy PG-5 (Trung Quốc), máy đo quang phổ UV-VIS, hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao, máy phân tích huyết học, máy xét nghiệm sinh hóa số thuốc thử, hóa chất, thiết bị dụng cụ thơng thường khác 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình bào chế cao khơ Đu đủ rừng 2.2.1.1 Phương pháp xác định số hợp chất sử dụng làm chất đánh dấu Khảo sát nhóm thành phần hố học phản ứng hóa học đặc trưng Lá ĐĐR (5kg) chiết siêu âm với methanol; chiết phân đoạn dung môi có độ phân cực tăng dần Phân lập hợp chất phương pháp sắc ký Phát chất đèn tử ngoại dùng thuốc thử, kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập phương pháp kết hợp như: TLC, HPLC NMR Xác định cấu trúc hóa học dựa thơng số lý hóa so sánh với số liệu công bố 2.2.1.2 Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Đu đủ rừng * Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng SPN UV-Vis - Nguyên tắc: Saponin toàn phần ĐĐR định lượng đo quang phổ UV-Vis sau thực phản ứng tạo màu Rosenthaler Hàm lượng SPN tính theo AO - Chuẩn bị: dãy dung dịch chuẩn AO MeOH nồng độ từ 100 - 300 µg/ml; dung dịch thử: 5,0 g ĐĐR, sau loại chlorophyl, chiết siêu âm lần với MeOH x h 50◦C, gom dịch chiết, thêm dung môi vừa đủ 200 ml, pha loãng 2,5 lần; lọc qua màng lọc 0,45 µm trước làm phản ứng; mẫu trắng: MeOH - Tiến hành phản ứng tạo màu Rosenthaler: Hút xác 0,2 ml dung dịch thử (hoặc chuẩn trắng), cho vào ống nghiệm, thêm 0,2 ml dung dịch vanilin 5% acid acetic băng 1,2 ml acid percloric Đậy kín ống nghiệm ủ cách thủy 70oC±1oC khoảng thời gian thích hợp Ngâm ống nghiệm nước đá chuyển vào bình định mức ml, tráng ống nghiệm ethyl acetat bổ sung ethyl acetat vừa đủ đến vạch - Xây dựng phương pháp: + Khảo sát cực đại hấp thụ: Quét phổ từ 400 tới 800 nm, chọn λmax + Khảo sát thời gian phản ứng tạo màu: Thực phản ứng tạo màu với dãy dung dịch chuẩn làm việc AO có nồng độ: 92,50; 138,75; 185,0; 231,25; 277,50 µg/ml với thời gian ủ 10, 20, 10 + Khảo sát cực đại hấp thụ: Quét bước sóng từ 400 -800 nm, có cực đại hấp thụ 550 nm + Khảo sát thời gian phản ứng tạo màu: kết cho thấy mẫu có hệ số tương quan cao mẫu có thời gian phản ứng 40 phút có độ hấp thụ quang cao Do vậy, đề tài lựa chọn thời gian để làm phản ứng màu 40 phút để khảo sát tiếp - Thẩm định phương pháp + Xác định khoảng tuyến tính: Kết cho thấy, khoảng nồng độ AO khảo sát, độ hấp thụ lượng AO có tương quan tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan r2 = 0,9986 phương trình hồi qui tuyến tính Y = 0,0742 X – 0,0364 + Độ lặp lại độ đúng: Kết cho thấy giá trị RSD ngày khác ngày nhỏ 2,21%, đáp ứng yêu cầu độ lặp lại phương pháp phân tích Tỷ lệ % chất chuẩn tìm lại ngày ngày thay đổi khoảng từ 92,67% - 97,11%, đáp ứng yêu cầu độ phương pháp phân tích * Phương pháp định lượng AO HPLC - Kết thẩm định + Tính tương thích hệ thống: Kết cho thấy: RSD thời gian lưu diện tích pic acid oleanolic nhỏ 2% Giá trị số đĩa lý thuyết cao N>20.000 hệ số bất đối xứng píc khoảng 1,15 Như vậy, phương pháp phân tích tương thích với hệ thống sắc ký + Tính đặc hiệu phương pháp: sắc đồ mẫu thử có píc trùng với thời gian lưu chuẩn AO; sắc đồ mẫu trắng không xuất píc thời gian lưu AO So sánh phổ píc chất AO sắc đồ chuẩn píc có thời gian lưu mẫu thử cho 11 thấy phổ chồng khít với mức tương quan 99%, chứng tỏ phương pháp có tính đặc hiệu cao + Khoảng nồng độ tuyến tính: Kết cho thấy, khoảng nồng độ khảo sát (từ 11,13 đến 111,25 µg/ml) có mối liên quan tuyến tính diện tích pic nồng độ chất phân tích Đường hồi qui y = 11333 x – 9726,9 với r2 =0,9972 + Độ lặp lại độ đúng: Kết cho thấy phương pháp có độ lặp lại cao với giá trị RSD ngày khác ngày nhỏ 3,3%, đáp ứng yêu cầu độ lặp lại phương pháp phân tích Tỷ lệ % tìm lại ngày ngày thay đổi khoảng từ 96,30 99,05%, đáp ứng yêu cầu độ phương pháp phân tích + Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ): kết thu LOD = 0,0122 µg/ml LOQ = 0,04 µg/ml 3.1.2.2 Kết xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu Đu đủ rừng TCCS dược liệu đề xuất có tiêu sau: Mơ tả dược liệu: hình thái thực vật, vi phẫu, soi bột; khối lượng làm khơ (≤12%); tro tồn phần (10%); giới hạn kim loại nặng theo phương pháp AAS (As ≤ 1,0 mg/kg; Cd ≤ 1,0 mg/kg; Hg ≤ 0,1 mg/kg; Pb ≤ 3,0 mg/kg); định tính acid oleanolic: theo phương pháp TLC; định lượng: hàm lượng SPN ≥ 15 mg/g tính theo AO UV – Vis, hàm lượng AO ≥ 750 µg/g HPLC 3.1.3 Kết xây dựng qui trình bào chế cao khơ Đu đủ rừng 3.1.3.1 Kết xây dựng qui trình bào chế dịch chiết Đu đủ rừng Từ kết khảo sát lựa chọn thông số qui trình chiết xuất dịch chiết ĐĐR phương pháp chiết siêu âm sau: 12 Bảng 3.18 Thơng số qui trình chiết xuất dịch chiết Đu đủ rừng phương pháp chiết siêu âm STT Phương pháp/ thông số Chiết siêu âm Bột khô ĐĐR Dung môi chiết Nhiệt độ chiết Số lần chiết Tỷ lệ DM/ DL Thời gian chiết Thiết bị/ thông số Thiết bị SM30-CEP Kích thước 0,5 - 1mm Ethanol 50º 70ºC lần 15ml/1g/ lần x lần 90 phút/ lần x lần Tiến hành chiết xuất qui mô kg/mẻ x mẻ chiết khác Tiến hành cô cao, loại tạp (lọc qua vải dày, cô thu hồi dung môi (70ºC, áp suất giảm, cô tới cao 3:1, để lắng 24h, gạn Cắn thêm EtOH gấp lần, lắng, gạn, lọc điều chỉnh cao 3:1) kết thu sau: Bảng 3.20 Kết chiết xuất, cô đặc loại tạp cao Đu đủ rừng 3:1 Dịch chiết Cao 3:1 chưa loại tạp Cao 3:1 loại tạp Khối lượng, 5,48 kg thể tích 170,0 lít 1,83 kg 1,83 kg SPN (1) 683,98 µg/ml 156,00 ± 4,61 mg/g 205,67 ± 4,45 mg/g Nội dung Lá ĐĐR 22390 µg/g Khối lượng 123,28 g 116,28 g 102,33 g SPN Tỷ lệ cắn khô cao 35,93% Hiệu suất chiết, cao tính theo SPN 83,44% Hiệu suất chiết, loại tạp tính theo SPN Tỷ lệ làm giàu SPN (1) 94,77 g 25,24% 77,27% 131,84% : hàm lượng SPN g chất rắn cao tính theo k hô kiệt 13 Kết cho thấy: Hàm lượng SPN cao 3:1 chưa loại tạp 156,00 ± 4,61 mg/g Sau loại tạp, cô đặc điều chỉnh cao 3:1 cho hàm lượng saponin toàn phần 205,67 ± 4,45 mg/g Tỷ lệ làm giàu SPN 131,84% 3.1.3.2 Kết bào chế cao k hô Đu đủ rừng phun sấy Từ kết khảo sát, lựa chọn công thức thơng số qui trình bào chế cao khơ ĐĐR phương pháp phun sấy sau: Bảng 3.29 Cơng thức thơng số qui trình bào chế cao khô Đu đủ rừng phun sấy STT Tên thông s ố Thông số Dịch phun sấy Tá dược phun sấy Aerosil Tỷ lệ tá dược/ chất rắn 30% Nhiệt độ đầu vào 130 ± 2ºC Tốc độ cấp dịch 30 ml / phút Tỷ lệ CR/DP 14% Áp suất khí nén đầu phun Bar Cao ĐĐR (3:1) phối hợp thêm tá dược 14 Xây dựng qui trình bào chế cao khô ĐĐR sau: Bột ĐĐR Đạt TCCS EtOH 50º DM/DL = 15ml/1g Chiết siêu âm lần 700 C, 90 phút Gạn, lọc Bã ĐĐR DM/DL = 15ml/1g Chiết siêu âm lần 700 C, 90 phút Gạn, lọc Bã ĐĐR EtOH thu hồi Dịch chiết ĐĐR Dịch chiết ĐĐR Dịch chiết ĐĐR 1+2 Cô thu hồi dung môi Cao ĐĐR 3:1 Để lắng, gạn EtOH 96º Phần cắn Phần dịch lỏng Để lắng, gạn Phần cắn Phần dịch lỏng Cô thu hồi dung môi Cao ĐĐR 3:1 Kiểm nghiệm: - Hàm lượng SPN: 165 245 mg/g - Tỷ lệ chất rắn: 20 - 30% Hình 3.12 Sơ đồ giai đoạn điều chế cao đu đủ rừng 3:1 15 Cao ĐĐR 3:1 - Thêm Aer, nước: tỷ lệ Aer 30% so với chất rắn, tỷ lệ CR/ DP: 14%; - Khuấy đồng Dịch phun sấy Cấp dịch phun (30ml/phút) Phun sấy Nhiệt độ đầu vào 130 ± 20 C Áp suất khí nén đầu phun Bar Cao k hô ĐĐR Đóng gói Kiểm nghiệm theo TCCS Hình 3.13 Sơ đồ tóm tắt giai đoạn bào chế cao khơ đu đủ rừng phương pháp phun sấy 3.2 Kế t nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đánh giá độ ổn định cao khô Đu đủ rừng 3.2.1 Kết xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cao khô Đu đủ rừng Tiến hành lô cao khô (mỗi lô mẻ chiết, mẻ kg dược liệu); kết đề xuất TCCS cao khô ĐĐR gồm 16 tiêu sau: tính chất (khối bột khơ tơi, màu vàng nâu nhạt, đồng nhất, vị đắng, mùi đặc trưng); khối lượng làm khơ (≤5%); tro tồn phần (15%); giới hạn kim loại nặng theo phương pháp AAS (As ≤ 1,0 mg/kg; Cd ≤ 1,0 mg/kg; Hg ≤ 0,1 mg/kg; Pb ≤ 3,0 mg/kg); độ nhiễm khuẩn (đạt mức 4, phương pháp đĩa thạch DĐVN V); định tính acid oleanolic: theo phương pháp TLC; định lượng: hàm lượng SPN ≥ 100 mg/g ≤ 200 mg/g tính theo AO UV – Vis; hàm lượng AO ≥ 7,5 mg/g ≤ 12,5 mg/g HPLC tính theo chế phẩm khô kiệt 3.2.2 Kết đánh giá độ ổn định cao khô Đu đủ rừng Kết cho thấy, tất tiêu chí đánh giá sau tháng điều kiện lão hóa cấp tốc 12 tháng điều kiện dài hạn có thay đổi, đạt TCCS chế phẩm 3.3 Kế t đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch độc tính cao khơ Đu đủ rừng động vật thực nghiệm 3.3.1 Kết đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch cao khô Đu đủ rừng - Trên số miễn dịch chung: Cao khô ĐĐR hai liều 400 800 mg/kg khơng có tác dụng gây tăng khối lượng quan lympho, gây tăng tế bào BC lympho ĐĐR liều làm tăng số lượng bạch cầu ngoại vi, tăng số lượng tế bào BCTT Trong liều lại làm giảm số lượng bạch cầu chung, làm giảm BCTT - Trên số miễn dịch dịch thể: Cao khơ ĐĐR hai liều có tác dụng làm tăng nồng độ IgG máu ngoại vi - Trên số miễn dịch qua trung gian tế bào: Cao khô ĐĐR hai liều có tác dụng tăng khả chế tiết cytokin 17 IL-2, liều có tác dụng giảm tiết TNF-α, nhiên liều lại gây tăng tiết TNF-α 3.3.2 Đánh giá độc tính cao khơ Đu đủ rừng 3.3.2.1 Độc tính cấp Kết cho thấy tỷ lệ % chuột chết mức liều dùng cao khơ ĐĐR theo hàm số mũ có tương quan chặt chẽ với hệ số tương quan r² = 0,9707 theo phương trình y = 4,738e0,016x Từ tính LD50 = 10,54 (8,79 – 12,65) g cao khô ĐĐR/kg, lớn gấp 26,35 lần so với liều dự kiến có tác dụng 3.3.2.2 Độc tính bán trường diễn Trên lô chuột dùng cao khô ĐĐR liều 240 mg/kg/ngày liều 720mg/kg/ngày, theo dõi 90 ngày liên tục, cho thấy: chuột khỏe mạnh, tăng trọng tốt, đều; không làm thay đổi số huyết học; không làm thay đổi tiêu sinh hóa đánh giá chức gan, thận; khơng gây tổn thương mô bệnh học gan, lách, thận Chương 4: BÀN LUẬN 4.1 Về xây dựng qui trình bào chế cao khơ Đu đủ rừng 4.1.1 Về xác định nhóm chất đánh dấu Xác định nhóm chất ĐĐR saponin Luận án phân lập hợp chất saponin triterpenoid; có hợp chất saponin biết hợp chất mới; góp phần bổ sung sở liệu hóa học cho lồi SPN nhóm chất có nhiều tác dụng liên quan đến miễn dịch nghiên cứu Trong số hợp chất biết, kalopanaxsaponin H nghiên cứu số hoạt tính kháng khối u gây độc tế bào ung thư Acid oleanolic chứng minh nhiều tác dụng dược lý có liên quan đến miễn dịch chống ung thư, tiểu đường, chống viêm, bảo vệ 18 gan, chống oxy hóa, kháng khuẩn, Vì luận án sử dụng SPN toàn phần AO làm chất đánh dấu 4.1.2 Về lựa chọn phương pháp định lượng Luận án sử dụng hai phương pháp định lượng: SPN định lượng phương pháp quang phổ UV-Vis, AO định lượng phương pháp HPLC Việc cần thiết góp phần làm tăng chặt chẽ xác đánh giá chất lượng sản phẩm Xây dựng thẩm định phuong pháp định lượng thực theo hướng dẫn ICH, kết cho thấy qui trình định lượng đảm bảo yêu cầu phương pháp phân tích 4.1.3 Về tiêu chuẩn sở Đu đủ rừng Hiện Việt Nam giới chưa có nhiều cơng bố nghiên cứu ĐĐR, chưa có chuyên luận ĐĐR Dược Điển Trong nghiên cứu này, từ mẫu thu hái tỉnh, đề xuất TCCS để đánh giá chất lượng nguyên liệu ĐĐR 4.1.4 Về qui trình bào chế cao Đu đủ rừng Chiết siêu âm ứng dụng ngày nhiều qui mơ phịng thí nghiệm đến cơng nghiệp Kết so sánh phương pháp chiết xuất cho thấy phương pháp chiết siêu âm làm tăng rõ rệt hiệu suất chiết nhiệt độ thấp thời gian ngắn Trong nghiên cứu này, sử dụng chiết siêu âm để khảo sát với thông số khảo sát là: KTTP dược liệu, loại dung môi chiết, tỷ lệ DM/DL, nhiệt độ thời gian chiết Trong khuôn khổ luận án, thiết bị chiết siêu âm cố định tần số sóng siêu âm 60 kHz, nên ảnh hưởng tần số sóng siêu âm (là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết) chưa khảo sát 19 4.1.5 Về thiết bị chiết xuất, cô đặc kết bào chế cao 3:1 Sau lựa chọn thơng số qui trình bào chế dịch chiết Tiến hành chiết xuất mẻ liên tục, mẻ 2kg thiết bị chiết xuất SM30 dung tích 30 lít, tần số siêu âm 60kHz, đầu phát siêu âm, lực siêu âm 400W Các thiết bị siêu âm thường đặc trưng tần số siêu âm (thường khoảng 20 - 100kHz) công suất siêu âm, cấu trúc thiết bị ảnh hưởng đến trình chiết xuất Trong nghiên cứu sử dụng thiết bị siêu âm với đầu siêu âm gắn cố định với tần số siêu âm 60kHz nên không khảo sát ảnh hưởng tần số siêu âm Do đó, nâng cấp qui mơ với thiết bị có tần số siêu âm khác cần tính tốn đánh giá lại thơng số qui trình để đạt mục đích chiết xuất mong muốn 4.1.6 Bào chế cao khô Đu đủ rừng phun sấy Trong luận án này, phương pháp phun sấy lựa chọn để bào chế cao khơ ĐĐR kỹ thuật làm khơ có nhiều ưu điểm, áp dụng rộng rãi qui mô cơng nghiệp nước Để xây dựng qui trình bào chế cao khô ĐĐR phương pháp phun sấy, cần phải khảo sát thông số thiết bị (nhiệt độ khí đầu vào, tốc độ cấp dịch) thông số thuộc dịch phun (tỷ lệ chất rắn, loại tỷ lệ tá dược) Các thông số sản phẩm cần đánh giá là: Mất khối lượng làm khơ, tính hút ẩm, khối lượng riêng biểu kiến, khả trơn chảy, hiệu suất phun sấy, hàm lượng hiệu suất thu hồi hoạt chất - Các tá dược lựa chọn khảo sát Mal, Aer, hỗn hợp Mal, Aer, Starch 1500, lactose Aer lựa chọn có tác dụng bảo vệ hoạt chất, điều hịa độ trơn chảy, cải thiện độ hút ẩm… 20 - Kết khảo sát cho thấy tăng tỷ lệ Aer cải thiện hiệu suất phun sấy số lý hóa khác sản phẩm, hiệu suất thu hồi hoạt chất tăng nhẹ, chứng tỏ Aer thể khả bảo vệ hoạt chất định, hàm lượng saponin toàn phần có xu hướng giảm dần, điều tượng pha loãng nồng độ Trong đề tài này, lựa chọn tỷ lệ tá dược 30% phù hợp - Kết khảo sát cho thấy, công thức phun sấy nhiệt độ tốc độ cấp dịch khác có ảnh hưởng định đến hiệu suất tính chất hóa lý sản phẩm Nhiệt độ sấy cao ảnh hưởng đến độ ổn định hoạt chất, kết khảo sát đề tài cho thấy hàm lượng hiệu suất thu hồi hoạt chất có xu hướng giảm nhiệt độ tăng đến 150°C - Dịch chiết ĐĐR thu sau chiết xuất cao 3:1 có tỷ lệ chất rắn khoảng 25%, phun sấy chỉnh tỷ lệ chất rắn từ 10 - 16% Vì tỷ lệ chất rắn cao làm tăng độ nhớt dịch phun nên phun sấy khó hình thành giọt, làm giảm hiệu suất phun sấy Kết cho thấy, tăng tỷ lệ CR/DP không ảnh hưởng đến hàm lượng hiệu suất thu hồi SPN, lại có xu hướng cải thiện độ ẩm, tính hút ẩm, khả trơn chảy Trong đó, tỷ lệ chất rắn 14 - 16% thích hợp 4.2 Về xây dựng tiêu chuẩn chất lượng độ ổn định cao khô Đu đủ rừng 4.2.1 Về xây dựng tiêu chuẩn sở Sau nghiên cứu bào chế cao khô ĐĐR luận án xây dựng TCCS để chuẩn hóa chất lượng sản phẩm Chỉ tiêu giới hạn định lượng lấy tương ứng khoảng 70% giá trị định lượng thực tế khảo sát) … 21 4.2.2 Về đánh giá độ ổn định Kết đánh giá độ ổn định sau tháng điều kiện lão hóa cấp tốc 12 tháng điều kiện dài hạn, không nhận thấy khơng có biến đổi đáng kể độ ổn định vật lý hoá học Chỉ riêng hình thức bột sau thời gian dài bảo quản, bột có xu hướng liên kết thành khối lắc nhẹ lọ dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ khối bột lại vỡ giải phóng tiểu phân ban đầu 4.3 Về tác dụng tăng cường miễn dịch độc tính cao khơ Đu đủ rừng 4.3.1 Tác dụng tăng cường miễn dịch Cơ sở chọn liều: Kết định lượng cho thấy hàm lượng SPN cao khô ĐĐR 150,16 ± 3,79 mg/g; hàm lượng SPN dịch chiết theo phương pháp sắc với nước 9,98 ± 0,59 mg/g, tỷ lệ cao khô/dược liệu khoảng 15/1 TheoVõ Văn Chi, liều dược liệu khuyến cáo dùng 20 - 30 g ĐĐR/ngày (25 g dùng theo phương pháp sắc tương ứng với 1,66 g cao khơ ĐĐR/ngày (~ 1700 mg) Vậy ta có liều dự kiến sử dụng người 1700 mg/người/ngày Tính quân bình người 50 kg liều dùng dự kiến người 50 kg 34 mg/kg/ngày Theo hướng dẫn WHO ngoại suy liều lượng loài, qui đổi liều tương đương chuột nhắt với hệ số qui đổi 12 liều dự kiến có tác dụng chuột nhắt 400 mg/kg/ngày Qui đổi liều tương đương chuột cống với hệ số qui đổi 07 liều dự kiến có tác dụng chuột cống 240 mg/kg/ngày Tác dụng tăng cường miễn dịch + ĐĐR liều 400 mg/kg (liều dự kiến lâm sàng) thể tác dụng TCMD rõ ràng có xu hướng làm tăng số lượng bạch cầu 22 ngoại vi, tăng số lượng tế bào BCTT, làm tăng số lượng BC lympho, tăng nồng độ IgG, tăng chiều dày bàn chân chuột phản ứng bì với kháng nguyên OA, tăng nồng độ IL-2, giảm TNF-α + Ở liều cao (800 mg/kg, gấp lần liều dự kiến) ĐĐR thể KTMD ko rõ ràng làm tăng tế bào BC lympho, tăng nồng độ IgG, tăng chiều dày bàn chân chuột phản ứng bì với kháng nguyên OA, tăng nồng độ IL-2 Tuy nhiên, lại làm giảm số lượng bạch cầu chung, làm giảm BCTT làm tăng TNF-α điều sử dụng liều cao gây tổn thương số mô, quan gây giảm số lượng bạch cầu Đây đặc điểm chung thuốc KTMD chế đáp ứng miễn dịch phức tạp Trong tương lai, sử dụng chế phẩm từ ĐĐR để làm thuốc hỗ trợ sức khỏe cần lưu ý vấn đề kiểm sốt liều dùng 4.3.2 Độc tính cao khơ Đu đủ rừng Theo hướng dẫn Tổ chức Y tế giới qui định Bộ y tế Việt Nam thuốc có nguồn gốc từ dược liệu phải đánh giá độc tính cấp bán trường diễn động vật trước đưa vào thử nghiệm người Cao khô ĐĐR chế phẩm bào chế từ dược liệu, với định hướng phát triển thành sản phẩm dùng cho người nên việc nghiên cứu độc tính gồm nghiên cứu độc tính cấp độc tính bán trường diễn động vật thực nghiệm cần thiết Theo qui định Mỹ, thời gian dự định sử dụng người dùng hàng ngày 30 ngày thời gian nghiên cứu bán trường diễn động vật tháng Như vậy, việc tiến hành nghiên cứu bán trường diễn thời gian tháng bảo đảm để đánh giá tính an tồn chế phẩm dự kiến sử dụng người hàng ngày 30 ngày KẾT LUẬN Về qui trình bào chế cao khơ Đu đủ rừng 23 - Đã xác định nhóm chất ĐĐR saponin triterpenoid Từ kg ĐĐR, phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất saponin, có hợp chất đặt tên acetyltrevesiasaponin B (11,0 mg) acetyltrevesiasaponin A (15,0 mg) chất biết là: Ilekudinosid C (100,3 mg), kalopanaxsaponin H (90,0 mg), davisianosid B (140,0 mg) acid oleanolic (167,0 mg) - Đã xây dựng thẩm định TCCS dược liệu ĐĐR, có tiêu định tính AO phương pháp TLC, định lượng saponin toàn phần UV – Vis (≥ 15 mg/g) định lượng AO HPLC (≥ 0,75 mg/g) - Đã xây dựng qui trình chiết xuất cao ĐĐR qui mô kg dược liệu/mẻ với điều kiện: bột khơ ĐĐR kích thước 0,5 - mm; chiết siêu âm, dung môi EtOH 50º, nhiệt độ 70°C, lần chiết, tỷ lệ DM/DL 15ml/1g x lần, thời giàn 90 phút/lần Sau cao nhiệt độ 70 ± 5°C, áp suất 60 - 65 mmHg - Đã xây dựng qui trình bào chế cao khơ ĐĐR với thông số sau: dịch phun sấy: Cao ĐĐR (3:1); tá dược phun sấy: Aerosil; tỷ lệ tá dược/ chất rắn: 30%; nhiệt độ đầu vào: 130 ± 2ºC; tốc độ cấp dịch: 30 ml/phút; tỷ lệ chất rắn dịch phun: 14%; áp suất khí nén đầu phun: Bar Về tiêu chuẩn sở độ ổn định cao khô Đu đủ rừng - Đã xây dựng thẩm định TCCS cho cao khô ĐĐR có tiêu: định tính AO phương pháp TLC; định lượng saponin toàn phần UV – Vis (≥ 100 mg/g ≤ 200 mg/g) định lượng AO HPLC (≥ 7,5 mg/g ≤ 12,5 mg/g) - Đã khảo sát sơ độ ổn định cao khô ĐĐR tháng điều kiện lão hóa cấp tốc 12 tháng điều kiện dài hạn Chế phẩm ổn định điều kiện nghiên cứu 24 Về tác dụng tăng cường miễn dịch độc tính cao khơ Đu đủ rừng - Đã đánh giá tác dụng TCMD cao khô ĐĐR hai mức liều 400 800 mg/kg KLCT chuột nhắt trắng Ở liều 400 mg/kg, chế phẩm thể tác dụng TCMD rõ ràng liều 800 mg + Trên số miễn dịch chung: Cao khô ĐĐR hai liều khơng có tác dụng gây tăng khối lượng quan lympho, tăng tế bào BC lympho ĐĐR liều 400 mg/kg làm tăng số lượng bạch cầu ngoại vi, tăng số lượng tế bào BCTT Trong liều 800 mg/kg lại làm giảm số lượng bạch cầu chung, làm giảm BCTT + Trên số miễn dịch dịch thể: Cao khơ ĐĐR hai liều có tác dụng làm tăng nồng độ IgG máu ngoại vi + Trên số miễn dịch qua trung gian tế bào: Cao khô ĐĐR hai liều có tác dụng tăng khả chế tiết cytokin IL-2, liều 400 mg/kg có tác dụng giảm tiết TNF-α, nhiên liều 800 mg/kg lại gây tăng tiết TNF-α - Đã đánh giá độc tính cao khơ ĐĐR: + Độc tính cấp: LD50 theo đường uống cao khô ĐĐR 10,54 (8,79 – 12,65) g/kg KLCT chuột nhắt trắng, lớn gấp 26,35 lần so với liều dự kiến có tác dụng + Độc tính bán trường diễn: cao khơ ĐĐR an tồn mức liều 240 720 mg/kg KLCT chuột cống trắng/ ngày 90 ngày liên tục ĐỀ XUẤT Khảo sát ĐĐR nhiều địa điểm để xây dựng chuyên luận TCCL ĐĐR DĐVN Khảo sát hàm lượng chất phân lập từ ĐĐR đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch hợp chất Phát triển sản phẩm tăng cường miễn dịch từ chế phẩm cao khô ĐĐR ... ? ?Nghiên cứu bào chế đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch cao khô Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb ex Lindl. ) Vis. , họ Nhân sâm Araliace ae)” nghiên cứu với mục tiêu sau: Xây dựng qui trình bào chế. .. giá tác dụng tăng cường miễn dịch độc tính cao khơ Đu đủ rừng động vật thực nghiệm 3.3.1 Kết đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch cao khô Đu đủ rừng - Trên số miễn dịch chung: Cao khô ĐĐR hai... chế cao khơ Đu đủ rừng qui mơ phịng thí nghiệm Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng bước đầu đánh giá độ ổn định cao k hô Đu đủ rừng Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch độc tính cao khô Đu đủ rừng