Tụ cầu da (S. epidermidis) là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng cơ hội quan trọng ở da và niêm mạc, thường gặp nhất là các nhiễm trùng trên da, niêm mạc và ở các bệnh nhân đã được thực hiện can thiệp thủ thuật ngoại khoa. Các nghiên cứu cho thấy, tình trạng kháng kháng sinh của tụ cầu da ngày một nghiêm trọng. Bài viết trình bày khảo sát khả năng diệt khuẩn (theo thời gian và nồng độ) của nano bạc đối với các chủng tụ cầu da trên invitro.
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DIỆT TỤ CẦU DA (STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS) CỦA NANO BẠC TRÊN INVITRO Tống Thị Kim Tuyến*, Nguyễn Minh Hoan*, Hoàng Thị Thanh Hoa*, Lê Hạ Long Hải*, Lê Văn Hưng** TÓM TẮT Tụ cầu da (S epidermidis) tác nhân gây bệnh nhiễm trùng hội quan trọng da niêm mạc, thường gặp nhiễm trùng da, niêm mạc bệnh nhân thực can thiệp thủ thuật ngoại khoa Các nghiên cứu cho thấy, tình trạng kháng kháng sinh tụ cầu da ngày nghiêm trọng Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát khả diệt khuẩn (theo thời gian nồng độ) nano bạc chủng tụ cầu da invitro Phương pháp nghiên cứu: 30 chủng S epidermidis sau nuôi cấy phân lập từ bệnh phẩm bệnh nhân mắc nhiễm trùng da đến khám Bệnh viện Da liễu Trung ương bệnh nhân có can thiệp thủ thuật ngoại khoa, cho tiếp xúc với nano bạc nồng độ khoảng thời gian khác để đánh giá khả diệt tụ cầu da S epidermidis nano bạc Kết quả: Tại nồng độ 50 mg/L ủ vịng giờ, nano bạc có khả diệt 100% chủng tụ cầu da Tại nồng độ mg/L, nano bạc ủ với S epidermidis từ đến cho thấy khả diệt tụ cầu da 99,9% Kết luận: Nano bạc có khả diệt tụ cầu da gây bệnh, khả tỷ lệ thuận với nồng độ thời gian tiếp xúc Từ khóa: Nano bạc; tụ cầu da ĐẶT VẤN ĐỀ thường gặp nhiễm trùng da trường hợp bệnh nhân có can thiệp Tụ cầu da (S epidermidis) cầu khuẩn Gram thủ thuật đặt nội khí quản, xơng dày, dương khơng có men coagulase, thuộc giống bệnh nhân cấy ghép tạng, sử dụng van tim nhân Staphylococcus Tụ cầu da thành viên vi tạo, phẫu thuật xương,… Tụ cầu da sinh trưởng hệ da niêm mạc người khỏe mạnh bề mặt dụng cụ vật liệu y tế nói Chúng tác nhân gây bệnh hội quan trọng, trên, hình thành màng sinh học (biofilm) [1], Phản biện khoa học: PGS.TS Nguyễn Hữu Sáu *Bộ môn Vi sinh - Ký sinh trùng lâm sàng, Trường Đại học Y Hà Nội **Bộ môn Da liễu, Trường Đại học Y Hà Nội đặc trưng polysaccharide, màng sinh học bao bọc bảo vệ vi khuẩn, dẫn đến ngăn cản tác dụng diệt tụ cầu da kháng sinh hệ miễn Số 28 (Tháng 05/2019) A H 43 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC dịch thể Nếu hướng điều trị thích hợp, trường hợp nặng bệnh nhân có thể bị nhiễm khuẩn huyết tử vong [2] [3] [4] [5] Nano bạc xem chất kháng khuẩn tự nhiên an toàn hiệu Ion bạc có hoạt tính mạnh, dễ dàng liên kết với protein tích điện âm, RNA, DNA, ion clorid Đặc tính đóng vai trị chế kháng khuẩn bạc [8] Hoạt động kháng khuẩn nano bạc dựa vào chế: (1) Bám dính lên bề mặt thành tế bào 2.2 Vật liệu - Dung dịch nano bạc có nồng độ 500mg/L cung cấp Phịng Cơng nghệ thân mơi trường, Viện Công nghệ môi trường - Môi trường thạch thường, môi trường Skim milk, tủ ấm CO2 (Thermo), tủ an toàn sinh học, tủ lạnh thường, tủ âm sâu, máy đo độ đục (BioMérieux), máy vortex (IKA), nhuộm Gram 2.3 Phương pháp nghiên cứu màng tế bào; (2) thâm nhập vào tế bào Mô tả cắt ngang, sử dụng kỹ thuật xét làm hủy hoại cấu trúc nội bào (ty thể, không nghiệm labo: kỹ thuật nuôi cấy, phân lập, kỹ thuật bào, ribosome) phân tử sinh học (protein, pha loãng để khảo sát khả diệt tụ cầu da lipid DNA); (3) gây độc tế bào tăng cường (theo thời gian nồng độ) nano bạc phản ứng oxy hóa với tham gia gốc 2.3.1 Chuẩn bị chủng tự do; (4) Thay đổi đường đường truyền tín hiệu tế bào [9] Ở Việt Nam, chưa có nhiều tác giả nghiên cứu khả tiêu diệt diệt tụ cầu da nano bạc Chính vấn đề nêu trên, tiến hành nghiên cứu với mục đích: “Khảo sát khả diệt tụ cầu da nano bạc invitro (theo thời gian nồng độ)” ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 30 chủng tụ cầu da (S epidermidis) phân lập từ bệnh phẩm bệnh nhân bị viêm nang lông (các sẩn, mụn mủ), viêm kẽ đến khám vật liệu y tế can thiệp ngoại khoa bệnh nhân nằm điều trị viện (ống nội khí quản, van tim nhân tạo, ) định làm xét nghiệm Khoa Xét nghiệm Vi sinh - Nấm - Ký sinh trùng, Bệnh viện Da liễu Trung ương xác định S epidermidis nguyên gây bệnh 44 A H Số 28 (Tháng 05/2019) 30 chủng tụ cầu da (S epidermidis) cấy chuyển lần lên môi trường để ổn định đặc tính sinh học Cấy mơi trường thạch thường, 35 - 370C; - 7% CO2 18 - 24 2.3.2 Chuẩn bị dung dịch nano bạc với nồng độ khác Pha loãng dung dịch nano bạc có nồng độ giảm dần, bắt đầu với nồng độ 500mg/L dung dịch nano bạc gốc, cụ thể sau: NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 2ml dd Nano bạc 1ml 1,8ml Nước cất Nước cất 0,2ml 1/10 1ml 1,2ml 1ml 1,6ml 1ml 1,8ml 1ml 1ml Nước cất Nước cất Nước cất Nước cất Nước cất Nước cất Nước cất 1ml 0,8ml 1/20 1/50 0,2ml 1/100 0,4ml 1/1000 1ml 1/5000 1ml 1/10000 1ml 1/20000 1/40000 Hình 2.1: Pha loãng dung dịch nano bạc nồng độ khác • Ống chứng: ống nghiệm vơ trùng chứa 2ml nước cất tiệt trùng 2.3.3 Đánh giá khả diệt tụ cầu da nano bạc Pha hỗn hợp huyền dịch vi khuẩn dung dịch nano bạc nồng độ khác nhau, điều chỉnh độ đục đạt 0,5 McFarland (tương đương 108 CFU/ml) Vortex để trộn hỗn hợp Cấy 100µl hỗn hợp lên mơi trường thạch thường, nuôi cấy 370C, -7% CO2 Đối chứng có nước cất vơ Hình 2.2: Phương pháp đếm khuẩn lạc trùng khuẩn lạc vi khuẩn S epidermidis Đĩa nuôi cấy sau 24 - 48 lấy để Tác dụng diệt tụ cầu da đánh giá dựa quan sát đếm số lượng khuẩn lạc số lượng khuẩn lạc S epidermidis mọc 2.3.4 Xác định khả diệt tụ cầu da nano môi trường so với nồng độ vi khuẩn ban đầu sau khoảng thời gian tiếp xúc với dung dịch nano bạc Số lượng khuẩn lạc hỗn hợp nồng độ thời gian tiếp xúc mọc đĩa ni cấy tính trung bình 30 chủng Phương pháp đếm khuẩn lạc: bạc theo thời gian tiếp xúc Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum Bactericidal Concentration-MBC) nồng độ thấp làm giảm 99,9% lượng vi khuẩn ban đầu Trong nghiên cứu này, MBC dung dịch nano bạc nồng độ ống mà cấy lên môi trường khuẩn lạc mọc Số liệu xử lý theo chương trình Excel 2016 Số 28 (Tháng 05/2019) A H 45 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KẾT QUẢ Khả diệt tụ cầu da nano bạc theo nồng độ thời gian tiếp xúc Biểu đồ 3.1: Khả diệt tụ cầu da nano bạc theo nồng độ (một số nồng độ thử nghiệm) thời gian tiếp xúc Tại thời điểm giờ, dung dịch nano bạc khơng thể diệt hồn tồn S epidermidis nồng độ thử nghiệm, thời điểm này, nồng độ tăng lên 5mg/L 50mg/L, số chủng vi khuẩn tụ cầu da bị diệt tương ứng 70% 95,3% Khi thời gian ủ nhỏ giờ, nồng độ 0,1mg/L, nano bạc khơng có khả diệt tụ cầu da, thời gian ủ tăng lên giờ, diệt 4% số chủng tụ cầu da 70% số chủng S epidermidis bị diệt thời điểm tiếp xúc > 99% số chủng bị diệt ủ nồng độ nano bạc mg/L điều kiện 15 phút, giờ, Tại nồng độ 50 mg/L, nano bạc cho thấy khả diệt tụ cầu da khoảng > 95% thời điểm vừa tiếp xúc, khả diệt khuẩn tụ cầu da tăng lên đến 100% ủ 46 A H Số 28 (Tháng 05/2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC BÀN LUẬN thuốc tụ cầu da giải vấn đề ngăn Chúng tiến hành thử nghiệm nhiều cản tác động thuốc kháng sinh tới vi khuẩn nồng độ nano bạc khác nhau: 1, 1/10, 1/20, biofilm Tác dụng diệt khuẩn nano bạc 1/50, 1/100, 1/1000, 1/5000, 1/10000, 1/20000, với tụ cầu da góp phần mở hướng điều trị 1/40000 Tuy nhiên, thử nghiệm cho thấy, tất bệnh chuyên ngành Da liễu nồng độ nano bạc, cần thời gian ủ như: viêm kẽ, viêm âm hộ, loét da niêm mạc có khả diệt tụ cầu da Kết có tụ cầu da loài vi khuẩn kháng thuốc khác thể lý giải tụ cầu da vi khuẩn Gram dương, Ngồi ra, ứng dụng nano bạc để sản xuất có lớp vách tế bào chứa peptidoglycan dày dung dịch sát trùng, kem bôi, miếng dán, gạc chúng hình thành lớp biofilm, đòi đắp vết thương nhiều sản phẩm khác hỏi thời gian tiếp xúc với nano bạc với dài băng vệ sinh, bỉm cho trẻ em người già phát huy hiệu diệt tụ cầu da[1] [10] [11] Trên giới, chưa có nhiều nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO cứu liên quan kết luận nhóm nghiên Jawetz Melnick&Adelbergs (2015) Medical Microbiology (27th), McGraw Hill Education cứu phù hợp với nghiên cứu trước Medical (2015) tiến hành Bahman Khameneh Eftekhar F, Dadaei T Biofilm formation and detection of icaAB genes in clinical isolates of methicillin resistant Staphylococcus aureus Iran J Basic Med Sci 2011; 14(2): 132-136 riêng biệt vấn đề này, có nghiên cộng [10], Zenon Foltynowicz cộng [11] Trong kết nghiên cứu, nồng độ mg/L ngưỡng thấp khơng cịn khả diệt hoàn toàn S epidermidis thời gian ủ thử nghiệm Tại nồng độ 10 mg/L, nano bạc cho thấy khả diệt lên đến 100% ủ với S epidermidis diệt khoảng 50% số chủng vừa tiếp xúc với nồng độ Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Emerson Danguy Cavassin cộng [12] KẾT LUẬN Nano bạc cho thấy hiệu diệt khuẩn tụ cầu da tốt, khả diệt khuẩn phụ thuộc vào nồng độ thời gian tiếp xúc Nền y học hướng tới dược phẩm ứng dụng nano bạc điều trị bệnh nhiễm khuẩn tụ cầu da, góp phần giải vấn đề kháng Bose S, Ghosh AK Biofilms A challenge to medical science J Clin Diagn Res 2011; 5(1): 127-130 Morones JR, Elekiguerra JL, Camacho A, Holt K, Kouri JB, Ramirez JT, Yacaman MJ The bactericidal effect of silver nanoparticles Nanotechnology 2005; 16 : 2346-2353 Doi: 10.1088 / 0957-4484 / 16/10/059 [ PubMed ] [ CrossRef ] Ansari MA, HM Khan, AA Khan, Malik A, Sultan A, Shahid M, Shujatullah F, Azam A Evaluation of antibacterial activity of silver nanoparticles MSSA and MRSA Against isolates from skin infections on.Biol Med 2011; : 141-146 Gong P, Li H, He X, Wang K, Hu J, Tan W, Tan S, Zhang XY Preparation and antibacterial activity of Fe3O4 Ag nanoparticles Nanotechnology.2007; 18 : 604-611 Số 28 (Tháng 05/2019) A H 47 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Shunmugaperumal T Microbial and cell viability, Bahman Khamench, Hamed colonization of medical devices and novel Zarei, Bibi Sedigheh Fazly Bazzaz, Nanomedicine preventive strategies Recent Pat Drug Deliv Journal, Jul 12, 2014, Vol 1, No 5, Autumn 2014, Formul 2010; 4(2): 153-173 page 302-307 Chaloupka K, Malam Y, Seifalian AM.(2010) 11 Zenon Foltynowicz et al Antimicrobial Nanosilver as a new generation of nanoproduct Properties of Socks Protected with Silver in biomedical applications Trends Biotechnol Nanoparticles, , Fibres and Textiles in Eastern 2010 Nov; 28(11):580-8 Europe 21(5):91-96 • September 2013 Tikam Chand Dakal , Anu Kumar, Rita S 12 Emerson Danguy Cavassin et cc Majumdar , and Vinod Yadav Mechanistic Basis Comparison of methods to detect in vitro activity of Antimicrobial Actions of Silver Nanoparticles, of silver nanoparticles (AGNP) against multidrug NCBI, Front Microbiol 2016; 7: 1831, Published resistant bacteria, J Nanobiotechnology 2015; 13: online 2016 Nov 64 Published online Oct 2015 10 The effect of silver nanoparticles on Staphylococcus epidermidis biofilm biomass SUMMARY DETERMINATION OF MINIMUM BACTERICIDAL CONCENTRATION OF SILVER NANOPARTICLES TO STAPHYLOCOCCUS AUREUS CAUSING CUTANEOUS DISEASES Staphylococcus epidermidis an important opportunistic infection, most commonly on skin and mucosal infections, and in patients who have had surgical interventions Studies show that the antibiotic resistance of S epidermidis is more serious Method: S epidermidis was isolated from 30 patients with cutaneous infections at National hospital of Dermatology and Venereology and patients who having surgical interventions 30 isolates S epidermidis were exposed to silver nanoparticles at different concentrations and durations to evaluate the bactericidal effect of silver nanoparticles to S epideermidis Results: At 50 mg/L of concentration and in hours of exposure, bactericidal effect of silver nanoparticles to S epidermidis was 100% At mg/L of concentration, bactericidal effect of silver nanoparticles was more than 99,9% in and hours of exposure, respectively Conclusion: Bactericidal effect of silver nanoparticles to S epidermidis isolates was directly proportional to concentration and contacting time period Key word: Silver nanoparticle, Staphylococcus epidermidis 48 A H Số 28 (Tháng 05/2019) ... có nhiều tác giả nghiên cứu khả tiêu diệt diệt tụ cầu da nano bạc Chính vấn đề nêu trên, tiến hành nghiên cứu với mục đích: “Khảo sát khả diệt tụ cầu da nano bạc invitro (theo thời gian nồng... Khả diệt tụ cầu da nano bạc theo nồng độ thời gian tiếp xúc Biểu đồ 3.1: Khả diệt tụ cầu da nano bạc theo nồng độ (một số nồng độ thử nghiệm) thời gian tiếp xúc Tại thời điểm giờ, dung dịch nano. .. 0,1mg/L, nano bạc khơng có khả diệt tụ cầu da, thời gian ủ tăng lên giờ, diệt 4% số chủng tụ cầu da 70% số chủng S epidermidis bị diệt thời điểm tiếp xúc > 99% số chủng bị diệt ủ nồng độ nano bạc