Bài viết trình bày một số kết quả sàng lọc hoạt tính CDH của một số chủng nấm phân lập tại Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) và Mường Phăng (Điện Biên) và lần đầu tiên xác định hoạt tính enzyme này từ loài nấm phân lập Coprinellus aureogranulatus MPG14.
Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 135-145, 2020 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CELLOBIOSE DEHYDROGENASE TỪ MỘT SỐ LỒI NẤM PHÂN LẬP Ở RỪNG MƯA PHÍA BẮC VIỆT NAM Vũ Đình Giáp, Thái Thị Mỹ Hiệp, Đỗ Hữu Nghị* Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam * Người chịu trách nhiệm liên lạc E-mail: dohnghi@gmail.com Ngày nhận bài: 26.9.2019 Ngày nhận đăng: 15.3.2020 TÓM TẮT Enzyme từ nấm biết đến có khả thủy phân hiệu vật liệu giàu lignocellulose Quá trình phân hủy cần nhiều enzyme tham gia hoạt động phối hợp để thủy phân cấu trúc polymer Trong số đó, số enzyme oxi hóa cần thiết lignin peroxidase, mangan peroxidase hay laccase Cellobiose dehydrogenase (CDH) enzyme ngoại bào sinh tổng hợp nhiều loài nấm khác nhau, chúng phát vào năm 1974 Westermark nấm thối trắng Trametes verscolor Phanerochaete chrysosporium Vai trò sinh học CDH chứng minh tham gia vào phân hủy polymer cellulose, hemicellulose lignin cách tạo gốc hydroxyl thơng qua phản ứng Fenton CDH có đặc tính xúc tác điện hóa sinh học độc đáo sử dụng cảm biến sinh học để phát cellodextrin, maltose, lactose hợp chất diphenol ứng dụng y sinh sản xuất axít lactobionic Vì thế, CDH thành phần quan trọng hệ thống enzyme ngoại bào để phân giải lignocellulose Trong nghiên cứu này, 47 chủng nấm phân lập vùng sinh thái (rừng quốc gia Cúc Phương, Mường Phăng) sàng lọc hoạt tính enzyme CDH Trong đó, 33 chủng biểu hoạt tính CDH từ 8,89 đến 74,4 U/L phát triển môi trường rắn, chất rơm Chủng thể hoạt tính cao xác định Coprinellusaureogranulatus MPG14 với hoạt độ CDH đạt 77,4 U/L môi trường 237,4 U/L điều kiện thích hợp: bổ sung nguồn carbon từ α-cellulose (20 g/L), nguồn nitrogen từ pepton (5 g/L) sau 12 ngày lên men dịch thể, 30 oC, pH 5,5, điều kiện nuôi lắc 200 v/ph Như vậy, chủng nấm có tiềm để khai thác enzyme CDH ứng dụng việc tiền xử lý vật liệu giàu lignocellulose Từ khóa: cellobiose dehydrogenase, cellodextrin, mannodextrin, fenton, lignocellulose degrading enzymes ĐẶT VẤN ĐỀ Sinh vật phân hủy lignocellulose đóng vai trị quan trọng việc trì vịng tuần hồn carbon nhờ khả chuyển hóa hiệu vật liệu giàu lignocellulose hệ enzyme thủy phân oxi hóa Chúng chịu trách nhiệm việc phá vỡ cấu trúc phức tạp lignocellulose (Hetti, et al., 2004) Trong số sinh vật phân hủy lignocellulose, lồi nấm biết có hệ xúc tác sinh học hiệu Việt Nam quốc gia có đa dạng sinh học cao giới với 72.000 loài thực vật bậc cao, có khoảng 2.250 lồi nấm (Roberts, Evans, 2011) Enzyme từ nấm lớn biết đến có khả thủy phân hiệu vật liệu giàu lignocellulose Để phân hủy lignocellulose, hệ enzyme ngoại bào cellulase q trình thủy phân lignocellulose cịn cần enzyme thủy phân khác bao gồm esterase (feruloyl esterase, acetyl xylan esterase), chúng hoạt động phối hợp với enzyme công 135 Vũ Đình Giáp et al mạch (cellulase/xylanase) mạch nhánh cấu trúc polymer Tuy nhiên, cấu trúc phức tạp lignocellulose thành tế bào làm hạn chế hoạt động nhiều loại enzyme (Peters, et al., 2007) Do vậy, q trình phân hủy lignocellulose cịn cần enzyme oxi hóa lignin/mangan peroxidase, laccase, cellobiose dehydrogenase hoạt động phối hợp để thủy phân cấu trúc polymer (Sachslehner, et al.,1997) Cellobiose dehydrogenase (EC 1.1.99.18) enzyme ngoại bào sinh tổng hợp loài nấm khác nhau, phát lần đâu tiên vào năm 1974 Westermark (Westermark, Eriksson, 1974) Nhiều enzyme Vì thế, enzyme CDH thành phần quan trọng hệ thống enzyme ngoại bào để phân giải lignocellulose (Morpeth, 1985) Các đặc tính xúc tác điện hóa sinh học độc đáo CDH sử dụng cảm biến sinh học để phát cellodextrins, maltose, lactose, hợp chất diphenolic ứng dụng y sinh sản xuất axít lactobionic (Nyanhongo, et al., 2013) Trong nghiên cứu này, chúng tơi trình bày số kết sàng lọc hoạt tính CDH số chủng nấm phân lập Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) Mường Phăng (Điện Biên) lần xác định hoạt tính enzyme từ lồi nấm phân lập Coprinellus aureogranulatus MPG14 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Chủng nấm 47 chủng nấm nghiên cứu phân lập, 136 CDH từ loài nấm khác quan tâm nghiên cứu, điển hình như: Sclerotium rolfsii (Baminger, et al., 2001), Termitomyces clypeatus (Tanima, et al., 2008) Enzyme CDH oxi hóa cellodextrin hịa tan, mannodextrin lactose hiệu thành lacton tương ứng theo chế riêng biệt cách sử dụng chất nhận điện tử bao gồm quinone, phenoxyradicals, Fe3+, Cu2+ ion triiodide (Zamocky, 2006; Wood, 1992) Các kết gần chứng minh vai trò sinh học CDH việc hỗ trợ chế tạo gốc hydroxyl cách khử Fe3+ thành Fe2+ O2 thành H2O2, nhờ làm biến đổi cellulose, hemicellulose lignin thông qua phản ứng Fenton (Henriksson, et al., 2000) tinh từ mẫu nấm thu thập VQG Cúc Phương (Ninh Bình) Mương Phăng (Điện Biên) Một số chủng tiềm sau tinh định tên phương pháp sinh học phân tử phục vụ cho nghiên cứu sâu lưu giữ Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên Trong số 47 chủng nấm có 31 chủng định tên theo phương pháp hình thái giải phẫu so sánh, kết kế thừa từ nghiên cứu trước Danh sách chủng thể Bảng Môi trường nhân giống Nấm phát triển môi trường thạch PDA (khoai tây 200 g/L, dextrose 20 g/L, agar 17 g/L, H2O lít), ni cấy 27oCvà lưu giữ 4oC sau khuẩn ty phát triển đầy bề mặt thạch Để nhân giống cho trình sinh tổng hợp enzyme, khuẩn ty nấm từ môi trường thạch cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch mới, khoảng tuần để nấm phát triển phục vụ cho nghiên cứu Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 135-145, 2020 Phương pháp nuôi cấy nấm cho sàng lọc enzyme CDH Nấm nuôi cấy môi trường bao gồm thành phần cần thiết cho phát triển (MgSO4 0,5 g/L, KH2PO4 1,5 g/L, cao nấm men g/L, dịch vi lượng 0,1 lít, pH 7,0) bổ sung 2% (w/v) chất giàu lignocellulose (rơm) Sau ni cấy bình Erlenmeyer 250 mL chứa 75 mL mơi trường điều kiện lắc liên tục 200 v/ph, 25oC Sau 10 ngày, dịch chiết thô từ môi trường ni cấy lỏng lấy để đánh giá hoạt tính enzyme Hoạt tính cao suốt q trình ni cấy so sánh chủng nấm với để lựa chọn chủng có hoạt tính enzyme cao Tách chiết tinh DNA tổng số DNA tổng số tách chiết theo protocol CTAB Doyle (1987) (Doyle, 1987) điện di gel agarose 0,9% (80 - 100 V) Kiểm tra độ hàm lượng DNA tổng số thiết bị đo quang phổ bước sóng λ = 260 nm 280 nm Tinh DNA KIT Fermentas (Thermo Fisher, Waltham, USA) tiến hành quy trình theo hướng dẫn nhà sản xuất Nhân gen đích kỹ thuật PCR Nhân vùng gen nhân (ITS) kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG; ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC (White, et al., 1990) Thành phần phản ứng PCR tích 25 µL gồm thành phần: 13 µL d.H2O, 2,5 µL buffer 10X, µL MgCl2 25 mM, 2,5 µL dNTP 2,5 mM, 1,25 µL mồi xi (10 pmol/µL), 1,25 µL mồi ngược (10 pmol/µL), 0,5 µL Taq polymerase (5 U µL), µL DNA (10-20 ng) Chu trình nhiệt phản ứng PCR gồm: 94oC phút; tiếp sau 35 chu kỳ nối tiếp với bước: 94oC 45 giây, 55oC 45 giây, 72oC 45 giây; kết thúc phản ứng nhân gen 72oC 10 phút, giữ sản phẩm 4oC Sản phẩm PCR kiểm tra cách chạy điện di gel agarose 1,5% tinh Qiaquick gel extraction kit (Qiagen, Đức) Sản phẩm sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp hai chiều (mồi xuôi mồi ngược) với mồi ITS1/ITS4, sử dụng BigDye terminator cycler v3.1 đọc kết hệ thống ABI 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ) Trình tự nucleotide chủng nấm so sánh với trình tự có Genbank, sử dụng phần mền BLAST NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) Trình tự DNA sau đọc hiệu chỉnh mắt với trợ giúp phần mền ChromasPro1.7.6 (Technelysium Pty Ltd., Australia) để loại bỏ vùng tín hiệu nhiễu Các trình tự phân tích xếp thẳng hàng phần mền Bioedit v7.0.5.2 (Hall TA, 1999), Clustal W, geneDoc 2.7 (Nicholas, 1997) Các vùng khơng có khả xếp bị loại bỏ trước phân tích Xác định hoạt độ cellobiose dehydrogenase Hoạt tính cellobiose dehydrogenase xác định dựa khả oxi hóa chất 2,6dichlorophenolindophenol (DCIP, Sigma) hỗn hợp phản ứng Phản ứng thực tổng thể tích 200 µL chứa 20 µL enzyme, 130 µL đệm sosium acetate 100 mM pH 4,0, 20 µL lactose 300 mM, 20 µL DCIP 3mM,10 µL NaF 80 mM (khử hoạt tính laccase) Dung dịch phản ứng ủ 37oC phút đo kết bước sóng 520 nm Một đơn vị hoạt độ enzyme (U) xác định µmol DCIP bị oxy hóa phút điều kiện tiêu chuẩn (Westermark, Eriksson, 1974) Xác định nồng độ nguồn carbon nitrogen thích hợp Để nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ nguồn carbon nitrogen đến sinh tổng hợp enzyme CDH chủng nấm nghiên cứu, nồng độ carbon nitrogen thay đổi môi trường nuôi cấy theo thí nghiệm: carbon cao (αcellulose 20 g/L), nitrogen cao (pepton 20 g/L); carbon cao (α-cellulose 20 g/L), nitrogen thấp (pepton g/L); carbon thấp (α-cellulose g/L), nitrogen cao (pepton 20 g/L); carbon thấp (αcellulose 20 g/L), nitrogen thấp (pepton g/L) Dịch môi trường đựng bình Erlenmeyer 250 mL chứa 75 mL, khử trùng 137 Vũ Đình Giáp et al 121oC, 1atm 20 phút, nấm lên men điều kiện lắc liên tục 200 v/ph Hoạt tính so sánh thí nghiệm để lựa chọn thời gian lên men, nồng độ carbon nitrogen thích hợp cho nghiên cứu thu nhận, ly tâm 5.000 v/ph phút sau xác định hoạt tính enzyme CDH Xác định nhiệt độ, pH thích hợp Sàng lọc chủng nấm có hoạt tính cellobiose dehydrogenase Chủng nấm nghiên cứu nuôi cấy môi trường (pH 7,0) bổ sung nồng độ nguồn carbon nitrogen thích hợp Điều chỉnh pH khoảng - dịch đệm acetate 100 mM (pH 5-5,5) đệm phosphate 100 mM (pH 5,5-8) Nhiệt độ khảo sát bao gồm 23, 25, 28, 32 35oC Dịch enzyme thô từ mẫu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khả sinh tổng hợp enzyme CDH 47 chủng nấm đánh giá qua phân giải chất DCIP Dịch lên men từ chủng nấm ly tâm để loại bỏ sinh khối thành phần tạp Bảng thể kết đánh giá hoạt tính CDH chủng nấm Bảng Hoạt tính cellobiose dehydrogenase chủng nấm nghiên cứu TT Tên chủng/KH Phương pháp định danh Cellobio (1) dehydrogenase (U/l) Deconica coprophila CP1 Sinh học phân tử 21,02 ± 0,7 Mycena sp CP2 Hình thái giải phẫu Umbelopsis isabellina CP3 Sinh học phân tử Psathyrella pygmaea CP4 Sinh học phân tử 58,38 ± 0,5 Xylaria allantoidea CP5 Sinh học phân tử 15,69 ± 0,2 Bisporella sp.CP7 Hình thái giải phẫu 34,65 ± 0,9 Nigrospora oryzae CP8 Sinh học phân tử 42,35 ± 0,8 Auricularia sp.CP11 Hình thái giải phẫu Nemania bipapillata CP13 Sinh học phân tử 15,65 ± 0,7 10 Xylaria xanthinovelutina CP15 Sinh học phân tử 16,51 ± 0,4 11 Trametes sp CP16 Hình thái giải phẫu 12 Polystitus sp.CP17 Hình thái giải phẫu 13 Lecanicillium fungicola CP18 Sinh học phân tử 14 Clitopilus prunulus CP19 Sinh học phân tử 15,52 ± 0,6 15 Trametes sp CP21 Hình thái giải phẫu 15,46 ± 1,3 16 Coprinus sp.CP22 Hình thái giải phẫu 32,42 ± 0,9 17 Inonotus sp CP23 Hình thái giải phẫu 18 Coriolus sp CP24 Hình thái giải phẫu 19 Fomitopsis feei CP25 Sinh học phân tử 20 Ganoderma sp CP26 Hình thái giải phẫu 12,35 ± 0,6 21 Tyromyces sp CP27 Hình thái giải phẫu 14,06 ± 0,9 22 Mycena sp CP28 Hình thái giải phẫu 23 Hygrophoropsis aurantiaca CP29 Sinh học phân tử 50,83 ± 0,7 24 Hexagonia sp CP30 Hình thái giải phẫu 19,22 ± 0,5 25 Tyromyces sp CP31 Hình thái giải phẫu 17,85 ± 1,3 138 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 135-145, 2020 26 Ganoderma sp CP32 Hình thái giải phẫu 17,71 ± 0,7 27 Campanella sp.CP33 Hình thái giải phẫu 19,12 ± 1,2 28 Lentinula sp CP34 Hình thái giải phẫu 18,45 ± 1,0 29 Tyromyces lacteus CP35 Sinh học phân tử 16,20 ± 0,6 30 Ganoderma sp CP36 Hình thái giải phẫu 31 Xylaria polymorpha CP37 Sinh học phân tử 8,89 ± 0,4 32 Hericium sp CP38 Hình thái giải phẫu 33 Flammulina sp CP39 Hình thái giải phẫu 11,58 ± 0,8 34 Hexagonia sp CP40 Hình thái giải phẫu 12,71 ± 1,5 35 Hypsizygus sp CP41 Hình thái giải phẫu 8,91 ± 0,4 36 Tyromyces sp MPN9 Hình thái giải phẫu 19,82 ± 0,9 37 Trametes sp MPN10 Hình thái giải phẫu 38,68 ± 0,3 38 Lentinus squarrosulus MPN15 Sinh học phân tử 15,92 ± 0,5 39 Pleurotus pulmonarius MPN18 Sinh học phân tử 18,09 ± 0,9 40 Poria sp MPL2 Hình thái giải phẫu 23,88 ± 0,5 41 Marasmius sp MPL8 Hình thái giải phẫu 42 Xylaria sp MPL13 Hình thái giải phẫu 15,86 ± 0,2 43 Poria sp MPL14 Hình thái giải phẫu 15,65 ± 0,3 44 Trametes sp MPL17 Hình thái giải phẫu 45 Xylaria sp MPL25 Hình thái giải phẫu 20,35 ± 0,9 46 Nigroporus aratus MPG8 Sinh học phân tử 12,54 ± 0,5 47 Coprinellus sp MPG14 Hình thái giải phẫu 77,40 ± 1,1 (1) Hoạt tính cellobiose dehydrogenaseđược xác định phương pháp quang phổ (λ=520 nm) qua khả oxi hóa chất 2,6-dichlorophenolindophenol Hình Hoạt tính cellobiose dehydrogenase xác định với chất DCIP (Sigma) phiến 96 giếng Theo số liệu Bảng cho thấy, nhiều loài nấm có khả sinh tổng hợp enzyme CDH (33/47 chủng, đạt 70%) Hoạt tính dao động chủng từ 8,91 đến 74,4 U/L chất 2,6-dichlorophenolindophenol Trong đó, có số chủng biểu hoạt tính cao P pygmaea 139 Vũ Đình Giáp et al CP4 (58,38 U/L), N oryzae CP8 (42,35 U/L), Trametes sp MPN10 (38,68 U/L) Đặc biệt, chủng Coprinellus sp MPG14 sinh tổng hợp enzyme CDH cao đạt 74,4 U/L Theo nghiên cứu Tanima cs (2008), chủng nấm lớn T clypeatus có khả sinh enzyme CDH cao môi trường cellulose 55,88 U/mL sau ngày lên men 30oC, pH 6,5 (Tanima, et al., 2008) Khả sinh enzyme CDH cao từ chủng P chrysosporium 0,8 U/mL (Habu, et al., 1997), S commune 0,15 U/mL (Fang, et al., 1999), H bipapillatum U/L (Wolfgang, et al., 2001) S rolfsii 7,5 U/mL (Baminger, et al., 2001) nghiên cứu Như vậy, so sánh với kết từ số nghiên cứu nhận thấy, chủng Coprinellus sp MPG14 có khả sinh enzyme CDH cao (74,4 U/L) môi trường nuôi cấy lỏng với chất rơm Nhằm tăng khả sinh tổng hợp enzyme CDH từ chủng nấm này, nghiên cứu xác định điều kiện ni cấy thích hợp thời gian, nồng độ nguồn carbon, nitrogen, nhiệt độ pH Định danh nấm phương pháp sinh học phân tử Các chủng nấm phân lập định danh hình thái giải phẫu phương pháp sinh học phân tử mô tả phần phương pháp nghiên cứu Ở trình bày chi tiết kết phân loại chủng Coprinellus sp MPG14 biểu hoạt tính CDH cao Kết kiểm tra DNA tổng số chủng ký hiệu MPG14 gel agarose 1% thể Hình Giếng cho băng vạch nhất, băng đậm, sắc nét, thể DNA tách chiết có độ tinh cao Cặp mồi ITS1/ITS4 nhân thành công nhiệt độ gắn mồi 55oC Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 700 bp Chất lượng sản phẩm PCR thể điện di gel agarose 1,5% có băng nhất, sáng đậm, đủ tiêu chuẩn cho tách đoạn gen nhân để giải mã trình tự nucleotide Kết xác định trình tự vùng gen nhân (ITS-rDNA) chủng nấm MPG14 cho ảnh điện di đồ với đỉnh huỳnh quang rõ nét, cường độ 140 mạnh rõ ràng Sau loại bỏ trình tự mồi vùng tín hiệu nhiễu, chúng tơi thu trình tự nucleotide kiểm tra độ tương đồng trình tự ngân hàng gen Trình tự kiểm tra tính tương đồng với trình tự sẵn có ngân hàng Genbank cơng cụ BLAST Kết tìm kiếm cho thấy trình tự mẫu nấm MPG14 tương đồng cao tương đồng cao 100% với lồi Coprinellus aureogranulatus GQ249274 Hình Điện di DNA tổng số gel agarose %(A) sản phẩm PCR phân tích với cặp mồi ITS1/ITS4 điện di gel agarose 1,5% chủng MPG 14 (M: marker phân tử kb) (B) Sơ đồ mối quan hệ di truyền số loài thuộc chi Coprinellus xây dựng theo phương pháp ML Hình Chủng nấm MPG14 lồi C aureogranulatus tạo thành nhóm riêng có mức độ tương đồng di truyền cao (100%) có quan hệ mật thiết với với giá trị bootstrap 100% Kết cho phép nhận định chủng nấm MPG14 có chung nguồn gốc với lồi C aureogranulatus giới Điều kiện thích hợp cho lên men sinh tổng hợp enzyme CDH Ảnh hưởng nồng độ carbon nitrogen Các chủng nấm phân lập sàng lọc hoạt tính enzyme CDH môi trường rắn với chất rơm môi trường Để tăng hiệu suất sinh tổng hợp tinh enzyme CDH, nghiên cứu sử dụng chất chất cảm ứng với nồng độ khác bổ sung vào môi trường lên men lỏng Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 135-145, 2020 Hình Mối quan hệ họ hàng chủng nấm MPG14 với loài/thứ chi lấy Genbank sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA phương pháp Maximum Likelihood (ML) Các số nhánh tượng trưng cho hỗ trợ bootstrap Psathyrella pygmaea MG734744 xem lồi ngồi nhóm (outgroup) Chủng C aureogranulatus MPN14 ni cấytrên mơi trường có bổ sung nguồn carbon từ chất giàu lignocellulose (α-cellulose) nguồn nitrogen từ pepton với nồng độ khác thời gian từ đến 18 ngày, pH 7,0 Kết hình cho thấy, nấm sinh tổng hợp enzyme CDH mạnh môi trường với nồng độ nguồn carbon nitrogen khác Khả sinh tổng hợp enzyme CDH cao (122,6 U/L) sau 12 ngày nuôi cấy môi trường sử dụng nguồn carbon cao, nitrogen thấp (CCNT) hoạt tính thấp (98,2 U/L) môi trường với nguồn carbon thấp, nitrogen cao (CTNC) Trong thí nghiệm, sinh tổng hợp enzyme nấm bắt đầu sau ngày nuôi cấy, tăng mạnh kể từ ngày thứ bắt đầu giảm ngày thứ 15 (Hình 4) Mơi trường có nguồn carbon thấp nitrogen thấp (CTNT) hoạt tính CDH cao ngày thứ 15 (107,4 U/L), môi trường với nguồn carbon cao nitrogen cao (CCNC) hoạt tính enzyme CDH cao ngày thứ 12 (111,5 U/L), mẫu đối chứng với thành phần môi trường ngày thứ 15 hoạt tính enzyme CDH 80,8 U/L Như vậy, môi trường lên men chủng C aureogranulatus MPN14 với nguồn carbon cao (α-cellulose 20 g/L) nguồn nitrogen thấp (pepton g/L) nguồn dinh dưỡng thích hợp cho sinh tổng hợp CDH ngày nuôi cấy thứ 12 Đa số nấm lớn sử dụng nguồn cacbon giàu cellulose làm tăng suất sinh tổng hợp CDH Điều giải thích nguồn cacbon, cellulose hợp chất cao phân tử cấu tạo từ liên kết mắt xích β-Dglucose, để có nguồn đường cung cấp cho q trình trao đổi lượng nấm phải tăng sinh tổng hợp enzyme CDH để phân hủy chất có mơi trường Cùng với nguồn cacbon, nitrogen yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme CDH nấm Kết cho thấy, nguồn nitrogen từ pepton làm tăng khả sinh tổng hợp CDH nấm từ 1,5 lần so với đối chứng Hoạt tính CDH từ nấm thuộc ngành Ascomycetes nghiên cứu, khả sinh enzyme CDH cao môi trường lên men sử dụng nguôn carbon cao (αcellulose), nitrogen thấp (pepton) chủng A strictum, S thermophilus, G saubinetii N 141 Vũ Đình Giáp et al Hoạt độ cellobiose dehydrogenase (U/L) crassa Mặt khác, môi trường sử dụng nguồn carbon cao, nitrogen cao chủng C atrobrunneum, M brunnea S thermophilum sinh tổng hợp enzyme CDH cao Ngược lại, môi trường sử dụng nguồn carbon thấp, nitrogen thấp carbon thấp, nitrogen cao hoạt tính enzyme CDH thấp âm tính (Wolfgang, et al., 2001) 140.0 120.0 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 12 15 18 Thời gian (ngày) CTNT CTNC CCNT CCNC Đ/C Hình Động học sinh tổng hợp CDH nấm C aureogranulatus MPN14 môi trường bổ sung nồng độ nguồn carbon nitrogen khác Đa số nấm lớn sử dụng nguồn cacbon giàu cellulose làm tăng suất sinh tổng hợp CDH Điều giải thích nguồn cacbon, cellulose hợp chất cao phân tử cấu tạo từ liên kết mắt xích β-Dglucose, để có nguồn đường cung cấp cho trình trao đổi lượng nấm phải tăng sinh tổng hợp enzyme CDH để phân hủy chất có mơi trường Cùng với nguồn cacbon, nitrogen yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme CDH nấm Kết cho thấy, nguồn nitrogen từ pepton làm tăng khả sinh tổng hợp CDH nấm từ 1,5 lần so với đối chứng Hoạt tính CDH từ nấm thuộc ngành Ascomycetes nghiên cứu, khả sinh enzyme CDH cao môi trường lên men sử dụng nguôn carbon cao (α- 142 cellulose), nitrogen thấp (pepton) chủng A strictum, S thermophilus, G saubinetii N crassa Mặt khác, môi trường sử dụng nguồn carbon cao, nitrogen cao chủng C atrobrunneum, M brunnea S thermophilum sinh tổng hợp enzyme CDH cao Ngược lại, môi trường sử dụng nguồn carbon thấp, nitrogen thấp carbon thấp, nitrogen cao hoạt tính enzyme CDH thấp âm tính (Wolfgang, et al., 2001) Ảnh hưởng nhiệt độ Để xác định nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme CDH nấm C aureogranulatus MPN14 môi trường lên men bổ sung nguồn chất α-cellulose (20 g/L), nguồn nitrogen từ pepton (5 g/L), pH 7,0, sau 12 ngày lên men Kết thí nghiệm thể Hình Hoạt độ cellobiose dehydrogenase (U/L) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 135-145, 2020 180 160 140 120 100 80 60 40 20 23 25 28 Nhiệt độ 30 37 (0C) Hình Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh tổng enzyme CDH C aureogranulatus MPN14 Hoạt độ cellobiose dehydrogenase (U/L) 300 250 200 150 100 50 4.5 5.5 6.5 pH Hình Ảnh hưởng pH lên sinh tổng enzyme CDH nấm C aureogranulatus MPN14 Sau 12 ngày lên men nhiệt độ từ 23 đến 37oC, chủng C aureogranulatus MPN14 sinh enzyme CDH cao 28oC (157,4 U/L) thấp 23oC (57,85 U/L) Trong khoảng nhiệt độ nghiên cứu đến 28oC, nhiệt độ tăng khả sinh enzyme nấm tăng Ngoài khoảng nhiệt độ sinh tổng hợp enzyme chủng nấm nghiên cứu giảm rõ rệt nhiệt độ tăng lên 37oC hoạt tính enzyme giảm cịn 72,77 U/L Như vậy, 28oC hiệu suất sinh tổng hợp CDH cao từ chủng nấm nghiên cứu Kết tương đồng với nghiên cứu Baminger (2001), nấm S rolfsii sinh enzyme CDH cao 30oC môi trường lên men lỏng sử dụng nguồn carbon α-cellulose (42,6 g/L), pH (Baminger, et al., 2001) Nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh tổng hợp enzyme nấm 143 Vũ Đình Giáp et al Chủng C aureogranulatus MPN14 có khả sinh trưởng phát triển với pH từ 4,5 đến Tuy nhiên, khả sinh enzyme CDH chúng giảm pH mơi trường axít hay kiềm Ở pH 5,5 nấm sinh tổng hợp CDH cao đạt 237,4 U/L thấp 97,9 U/L pH sau 12 ngày lên men Do pH môi trường ảnh hưởng đến độ bền enzyme sinh nên việc lựa chọn đệm pH thích hợp quan trọng Có loại enzyme bền mơi trường axít, lại có enzyme bền mơi trường trung tính kiềm Chủng T clypeatus sinh tổng hợp enzyme cao (55,88 U/mL) môi trường với pH 6,5 Tuy nhiên, phần lớn enzyme CDH hoạt tính mơi trường lên men nấm có pH