Sàng lọc di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetics Screening – PGS) là phương pháp sử dụng các kỹ thuật sàng lọc phân tích bản chất di truyền bên trong của phôi để chọn được những phôi bình thường về di truyền giúp tăng tỉ lệ chuyển phôi thành công trong thụ tinh trong ống nghiệm (In Vitro Fertilization - IVF). Bài viết trình bày đánh giá tình trạng bất thường NST của phôi ngày năm bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS).
NỘI TIẾT, VÔ SINH VÀ HỖ TRỢ TỔNG SINH QUAN SẢN NGUYỄN THỊ BÍCH VÂN, HỒNG VĂN LƯƠNG, NGUYỄN VIẾT TIẾN, ĐẶNG TIẾN TRƯỜNG, NGUYỄN DUY BẮC MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM RỐI LOẠN NHIỄM SẮC THỂ Ở PHÔI NGÀY NĂM THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Nguyễn Thị Bích Vân(2), Hồng Văn Lương(1), Nguyễn Viết Tiến(2), Đặng Tiến Trường(1), Nguyễn Duy Bắc(1) (1) Học viện Quân y, (2) Đại học Y Hà Nội Từ khóa: Bất thường NST, NGS Keywords: Chromosome abnormality, NGS Tóm tắt Sàng lọc di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetics Screening – PGS) phương pháp sử dụng kỹ thuật sàng lọc phân tích chất di truyền bên phôi để chọn phơi bình thường di truyền giúp tăng tỉ lệ chuyển phôi thành công thụ tinh ống nghiệm (In Vitro Fertilization - IVF) Mục tiêu: Đánh giá tình trạng bất thường NST phôi ngày năm kỹ thuật giải trình tự hệ (NGS) Phương pháp: Phân tích NST 50 mẫu tế bào sinh thiết từ phôi hiến tặng ngày Veriseq (Illumina) hệ thống giải trình tự Miseq phần mềm Multi Bluefuse 4.4 Kết quả: Kết phân tích cho thấy tỷ lệ phơi có NST bình thường 24%, tỷ lệ phơi có NST bất thường 76% 30% bất thường số lượng NST 24% số phơi có bất thường cấu trúc, 22% số phơi có loại rối loạn cấu trúc sô lượng NST Kết luận: Bất thường NST chiếm tỷ lệ cao phôi ngày Vì vậy, sàng lọc di truyền trước chuyển phơi nhằm tăng tỷ lệ thành công thụ tinh ống nghiệm cần thiết Từ khóa: Bất thường NST, NGS Abstract Tập 16, số 01 Tháng 05-2018 CHARACTERISTICS OF CHROMOSOME ABNORMALITIES OF DAY EMBRYOS BY IVF 138 Tác giả liên hệ (Corresponding author): Nguyễn Thị Bích Vân, email: vannhim72@gmail.com Ngày nhận (received): 02/04/2018 Ngày phản biện đánh giá báo (revised): 02/04/2018 Ngày báo chấp nhận đăng (accepted): 27/04/2018 Preimplantation Genetics Screening (PGS) is the method that uses screening techniques to analyze the genetics nature of embryos in order to select embryos of genetic normality so as to increase the successful ratio of the In Vitro Fertilization-IVF technique Objectives: Evaluation of chromosome abnormalities of day embryos using Next Generation Sequencing (NGS) Methods: Analysis of 50 samples of biopsies from donated embryo blastocysts of day by using the Veriseq test kit (Illumina) on Miseq Đặt vấn đề áp dụng phổ biến Tuy nhiên kỹ thuật NGS có ưu điểm xác aCGH, tối ưu hóa chi phí [6], có khả kết hợp PGS chẩn đốn trước chuyển phơi Chính nghiên cứu sử dụng kỹ thuật NGS để bước đầu đánh giá đặc điểm bất thường NST phôi ngày năm cặp vợ chồng thực thụ tinh ống nghiệm Đối tượng phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu 50 tế bào phôi ngày năm hiến tặng cặp vợ chồng vô sinh thực kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn (ICSI) Tiến hành khuếch đại tồn hệ gen (Whole Genome Amplification – WGA) 50 tế bào phôi Đây phôi 18 cặp vợ chồng có người vợ tuổi từ 27 đến 49 tuổi, độ tuổi trung bình 35,3 2.2 Phương tiện nghiên cứu Hóa chất: VeriSeq DNA Library Preparation Kit PGS (Illumina), Miseq Reagent Kit Version (Illumina), PicoPLEX WGA Kit (Rubicon), Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) số hóa chất khác Thiết bị nghiên cứu: Hệ thống giải trình tự Miseq (Illumina), máy PCR ProFlex (Therm Fisher Scientific), Qubit 3.0 Fluorometer số thiết bị khác Phịng Phân tích ADN, Bộ mơn Giải Phẫu, Học viện Quân y Tập 16, số 01 Tháng 05-2018 Sàng lọc di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetics Screening – PGS) phương pháp sử dụng kỹ thuật sàng lọc phân tích chất di truyền bên phơi để chọn phơi bình thường di truyền giúp tăng tỉ lệ chuyển phôi thành công thụ tinh ống nghiệm (In Vitro Fertilization - IVF) [1, 2] Tỷ lệ chuyển phôi thành công thấp chủ yếu nguyên nhân bất thường nhiễm sắc thể (NST) [3] Một số phương pháp sàng lọc phôi xử dụng phương pháp đánh giá chất lượng phơi dựa tiêu chuẩn hình thái cho kết khơng tương xứng với tình trạng bất thường NST phôi [4], phương pháp lai huỳnh quang chỗ (Fluorescence In Situ Hybridization – FISH) áp dụng sàng lọc di truyền trước chuyển phơi, sàng lọc tối đa 14 cặp NST đánh giá khơng có hiệu cải thiện tỉ lệ thành cơng IVF Nhiều thử nghiệm lâm sàng có đối chứng ngẫu nhiên khẳng định sàng lọc kỹ thuật FISH khơng làm tăng tỷ lệ có thai, tỷ lệ sinh sống Nguyên nhân số lượng nhiễm sắc thể sàng lọc độ xác hạn chế [5] Nhiều nghiên cứu cho thấy sàng lọc 23 cặp NST trước chuyển phôi giúp cải thiện tỷ lệ thành cơng IVF Có nhiều kỹ thuật áp dụng cho sàng lọc 23 cặp NST trước chuyển phơi Trong đó, lai so sánh gen (Array Comparative Genomic Hybridization - aCGH) giải trình tự hệ (Next Generation Sequencing - NGS) TẠP CHÍ PHỤ SẢN - 16(01), 138 - 141, 2018 sequencing system and Multi Bluefuse 4.4 software Result: The results showed that the ratio of samples with normal chromosomes was 24% and 76% with abnormalities in which 30% with numeral abnormalities and 24% with structural abnormalities and 22% of the samples had both types of abnormalities Conclusion: The ratio of chromosome abnormalities in day embryos is high Thus, preimplantation genetics screening (PGS) is essential for improving IVF success rate Keyword: Chromosome abnormality, NGS 139 NỘI TIẾT, VÔ SINH VÀ HỖ TRỢ TỔNG SINH QUAN SẢN NGUYỄN THỊ BÍCH VÂN, HỒNG VĂN LƯƠNG, NGUYỄN VIẾT TIẾN, ĐẶNG TIẾN TRƯỜNG, NGUYỄN DUY BẮC 2.3 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu tiến cứu mô tả cắt ngang Các bước tiến hành - Bước 1: Sử dụng kit VeriSeq DNA Library Preparation Kit PGS Miseq Reagent Kit V.3 (Illumina) theo hướng dẫn nhà sản xuất để thực quy trình tạo thư viện giải trình tự hệ - Bước 2: Tiến hành WGA mẫu tế bào sinh Kết Hình 1.Hình Hình1 biểuảnh đồ CNV (Copy Number(Copy Variation) phơi số 19 Hình 1.ảnh Hình ảnh biểu đồ CNV CNV (Copy Number Variation) phôi phơi số số 19 19 Hình biểu đồ Number Variation) Hình 2.Hình Hình ảnh biểu đồảnh CNVbiểu phơi số 50của khơng có rối NST có Hình Hình Hình ảnh biểu đồ CNV CNV phôi số loạn 50 khơng khơng có rối rối loạn loạn NST NST đồ phôi số 50 Tập 16, số 01 Tháng 05-2018 Hình Hình ảnh biểu CNVđồ phơicủa số phơi 21 cósố một21 trúc NST sốtrúc NST Hình Hình Hình ảnh đồ biểu đồcủa CNV phơi số 21bất có thường bất bấtcấu thường cấu trúc NST số số 3 Hình ảnh biểu CNV có thường cấu 140 thiết từ phôi hiến tặng ngày PicoPLEX WGA Kit (Rubicon) kiểm tra chất lượng phương pháp định lượng Qubit - Bước 3: Tạo thư viện chuẩn hóa thư viện - Bước 4: Tiến hành giải trình tự hệ thống Miseq - Bước 5: Phân tích liệu phần mềm Blue Fuse 4.4 2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu Hội đồng Đạo đức nghiên cứu y sinh Học viện Quân y phê duyệt Bảng Đặc điểm rối loạn NST phôi ngày Thời điểm kết thúc thai kỳ Phơi bình thường Phôi rối loạn số lượng NST Bất thường NST Bất thường NST Bất thường NST Thể không nhiễm Thể đơn nhiễm Thể tam nhiễm trở lên Phơi có rối loạn cấu trúc NST Bất thường NST Bất thường NST Bất thường NST Mất đoạn Thêm đoạn Phơi có rối loạn cấu trúc số lượng NST Bất thường NST Bất thường NST Bất thường NST Số lượng 12 15 4 11 12 12 11 2 Tỉ lệ (%) 24 30 24 22 Trong số 50 tế bào phơi phân tích có 12 phơi bình thường số lượng cấu trúc 23 cặp NST Có 38 tế bào phơi có bất thường số lượng, cấu trúc số lượng cấu trúc chiếm tỷ lệ 76% Một số kết phân tích 23 cặp NST phơi ngày minh họa đây, rối loạn nhiều NST phơi số 19 (hình 1), 23 cặp NST bình thường (hình 2), bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể số phơi số 21 (hình 3) Kết phân tích đặc điểm rối loạn nhiễm sắc thể phơi trình bày bảng Kết bảng cho thấy tỷ lệ phôi có NST bình thường 24%, 24% số phơi có bất thường cấu trúc 30% số phơi bất thường số lượng NST, có 22% số phơi có loại rối loạn NST Bàn luận Kết nghiên cứu cho thấy tỉ lệ rối loạn NST cao phôi ngày (76%), tỉ lệ phơi bị rối loạn số lượng cấu trúc NST đồng (lần lượt 30% 24%), tỷ lệ phôi có loại rối loạn 24% Trong đó, với phơi bị rối loạn cấu trúc NST có xu hướng xảy rối loạn cặp NST (9/12 phôi tương đương với 75% tổng số phôi bị rối loạn cấu trúc NST), cịn phơi bị rối loạn số lượng NST có xu hướng xảy rối loạn từ NST trở lên (11/15 phôi tương đương với 73,3% tổng số phôi bị rối loạn số lượng NST) Trong báo cáo Samer Alfarawati [4] Carmen Rubio [7] tỉ lệ số phơi phát có Tài liệu tham khảo E J Forman, et al In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial Fertility and sterility 2013; 100(1): p 100-107 e1 J A Grifo, et al Single thawed euploid embryo transfer improves IVF pregnancy, miscarriage, and multiple gestation outcomes and has similar implantation rates as egg donation Journal of assisted reproduction and genetics 2013; 30(2): p 259-264 R.T Scott, et al Comprehensive chromosome screening is highly predictive of the reproductive potential of human embryos: a prospective, blinded, nonselection study Fertility and sterility 2012; 97(4):p.870-875 góp phần cho thành công công tác điều trị muộn Kết luận Tỉ lệ bất thường NST phôi ngày thụ tinh ống nghiệm cao vậy, tiến hành sàng lọc rối loạn NST trước chuyến phôi cần thiết để giúp tăng tỷ lệ thành công phương pháp điều trị muộn TẠP CHÍ PHỤ SẢN - 16(01), 138 - 141, 2018 bất thường NST thấp (lần lượt 56,7% 42,8%) Tuy nhiên, báo cáo sử dụng kỹ thuật FISH aCGH để tiến hành PGS, kỹ thuật có độ xác NGS [5, 6] Mặt khác, nghiên cứu bước đầu khảo sát thực cỡ mẫu nhỏ (50 phôi) nên kết chưa có tính đại diện Chúng tơi tiếp tục hồn thiện quy trình triển khai thời gian tới với cỡ mẫu lớn hy vọng có kết xác S Alfarawati, et al The relationship between blastocyst morphology, chromosomal abnormality, and embryo gender Fertility and sterility 2011; 95(2): p 520-524 PR Brezinaand, WG Kearns Preimplantation genetic screening in the age of 23-chromosome evaluation; why FISH is no longer an acceptable technology J Fertiliz In Vitro 2011; 1: p e103 C.D Russo, et al Comparative study of aCGH and Next Generation Sequencing (NGS) for chromosomal microdeletion and microduplication screening Journal of prenatal medicine 2014; 8(3-4): p 57 C Rubio, et al Impact of chromosomal abnormalities on preimplantation embryo development Prenatal diagnosis 2007; 27(8): p 748-756 Tập 16, số 01 Tháng 05-2018 141 ... phôi ngày Thời điểm kết thúc thai kỳ Phơi bình thường Phôi rối loạn số lượng NST Bất thường NST Bất thường NST Bất thường NST Thể không nhiễm Thể đơn nhiễm Thể tam nhiễm trở lên Phơi có rối loạn. .. phôi có loại rối loạn 24% Trong đó, với phơi bị rối loạn cấu trúc NST có xu hướng xảy rối loạn cặp NST (9/12 phôi tương đương với 75% tổng số phôi bị rối loạn cấu trúc NST), cịn phơi bị rối loạn. .. thường cấu trúc nhiễm sắc thể số phơi số 21 (hình 3) Kết phân tích đặc điểm rối loạn nhiễm sắc thể phơi trình bày bảng Kết bảng cho thấy tỷ lệ phôi có NST bình thường 24%, 24% số phơi có bất thường