Thiết kế tách dòng gen alpha hemoglobin mã hóa protein hemoglobin ở chuột

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC Thiết kế tách dịng gen alpha hemoglobin mã hóa protein hemoglobin chuột Tổng quan Hemoglobin  Huyết sắc tố, gọi Hemoglobin protein phức có chứa Fe++, làm nhiệm vụ vận chuyển oxy từ phổi đến tổ chức vận chuyển CO2, từ tổ chức phổi; Hb hồng cầu chiếm 33% trọng lượng hồng cầu  Mỗi protein Hemoglobin (Hb) mang phân tử oxy, thông qua đường máu mà cung cấp oxy cho tế bào mô thể Hemoglobin đóng vai trị việc giúp tế bào hồng cầu có hình dạng đĩa, giúp chúng di chuyển dễ dàng qua mạch máu  Hb đại phân tử có đơn vị (tetramère) mà đơn vị (monomère) có hai phần hem globin  Hem: Là sắc tố chứa sắt hoá trị (+2), chiếm 4% trọng lượng huyết sắc tố; có cấu trúc vịng porphyrin có nhân pyrol liên kết với ion Fe++  Globin: Là chuỗi polypeptid (một chuỗi nhiều acid amin liên kết với nhóm COOH NH2), protein, tổng hợp dựa khn mẫu gen globin Có nhiều loại globin thuộc hai họ (họ α họ khơng α) Mỗi loại có số lượng trình tự acid amin đặc trưng, chuỗi thuộc họ α là: α zeta, chuỗi có 141 acid amin, có cấu trúc gần giống  Các chuỗi thuộc họ không α là: β, γ, δ, ε, chuỗi có 146 acid amin Các chuỗi α khơng α khơng phải có hình dạng mà cấu tạo đặc trưng để tạo nên hình khối, chứa hem có bậc cấu trúc Tại lại chọn đối tượng thiết kế tách dòng gen chuột?  Thiếu máu hồng cầu hình liềm bệnh di truyền hemoglobin hồng cầu Các hồng cầu bệnh nhân có hình lưỡi liềm hemoglobin bất thường có xu hướng đóng cục gây tắc nghẽn mạch máu Bệnh nhân dễ bị nhiễm khuẩn cục máu đơng gây bít tắc mạch máu làm tổn thương nhiều quan  Bệnh nhân có số lượng hồng cầu thấp bình thường tế bào hình liềm khơng thể sống lâu được, tủy xương tạo hồng cầu đủ nhanh để thay tế bào chết Đây bệnh di truyền, kéo dài suốt đời, bệnh xuất từ bệnh nhân sinh  Các phương pháp điều trị trước dùng thuốc giảm đau, truyền dịch chống nước nhằm giảm đau, ngăn ngừa nhiễm khuẩn, tổn thương mắt, đột quỵ, kiểm soát biến chứng Các phương pháp không điều trị dứt điểm bệnh mà làm giảm triệu chứng điều trị biến chứng Ghép tủy xương trị dứt hẳn số trường hợp Các nhà nghiên cứu tiếp tục tìm kiếm cách điều trị cho bệnh bao gồm liệu pháp gen, ghép tủy xương, dùng tế bào gốc, phương pháp dùng tế bào gốc mang đến thành công đáng kể  Bệnh thiếu máu hình liềm bệnh người, nhà nghiên cứu làm cho bệnh biểu chuột chữa lành tế bào gốc sản xuất từ phôi thai  Các nhà nghiên cứu nhân tính hóa chuột, có tế bào biểu hemoglobin người đột biến bệnh hồng cầu hình liềm Người ta lấy tế bào da đuôi chuột nuôi cấy cho tiếp nhận biến đổi di truyền (4 gen) làm tái lập chương trình tế bào Các tế bào trẻ lại giống hệt với tế bào gốc phôi thai Có 24 dịng tế bào gốc xác lập, biến đổi nhờ yếu tố hormon khác thành tế bào gốc sinh huyết, nguồn gốc hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu tủy xương Một dòng nhận gen hemoglobin bình thường thay cho gen bệnh Đó kỹ thuật xem phương pháp đặc biệt, đặc trị Chỉ vài tế bào tế bào tái lập chương trình sinh tế bào gốc sinh huyết bình thường Một thu tế bào gốc "thuốc" rồi, nhà nghiên cứu tiêm vào chuột bị bệnh hồng cầu hình liềm người  Kết khơng sửa chữa khuyết tật hemoglobin cách thay 65% hemoglobin bị bệnh hemoglobin lành mạnh mà nghiên cứu hồng cầu mới, sản xuất từ tế bào gốc bị biến đổi Sau tiêm "thuốc", chuột thể triệu chứng thiếu máu hơn, tủy xương sản sinh hồng cầu có kích thước, hình dáng gần với bình thường Trước tiêm, chuột bị bệnh có sản xuất nhiều tế bào hồng cầu trẻ không trưởng thành để bù lại chết sớm tế bào hồng cầu trưởng thành Sau tiêm, số tế bào giảm chuột điều trị  Vào NCBI, gõ alpha hemoglobin Click vào tên loài chuột khác bên cột Top organisms Ta báo, click vào ta chọn, kết sau Copy tồn trình tự Fasta loại chuột vào nhập trình tự Clustal Omega Submit ta kết thể vùng tương đồng, từ tìm vùng bảo thủ Chọn khuôn ảo chuột Mus Musculus NM_008218.2, dựa theo thơng tin Genbank ngày phát gần số loại, ngày 26/5/2020 theo báo Pubmed tác giả gen nhà khoa học khai thác từ loài chuột nhà Nhật Bản Copy toàn trình tự gen Fasta mus musculus vào nhập trình tự PrimerBlast, nhập thơng số mồi xuôi, mồi ngược, chiều dài gen, nhiệt độ mồi, ấn get Primers Ta kết có mồi, ta chọn mồi thích hợp dựa vào điều kiện tỉ lệ GC nằm khoảng 50-55%, tỉ lệ bắt cặp nhỏ 6, nhiệt độ mồi Tm khoảng 52 – 62 ℃, số Nu nằm khoảng 18-24 Ta kết mồi primer với thông số sau Chạy PCR ảo với mồi vừa tìm cách copy trình tự gen fasta Mus musculus, nhập đoạn mồi xuôi mồi ngược Submit ta kết sản phẩm chạy PCR ảo Copy trình tự gen sản phẩm chạy PCR ảo vừa vào nhập trình tự Blast, submit ta kết  Trong mục Description có đoạn gen có trình tự tương đồng theo tỉ lệ phần trăm cột Per Indent, tỉ lệ cao khả tương đồng gen với gen có ngân hàng liệu lớn Do tính trạng mà gen mã hóa giống với tính trạng gen có ngân hàng liệu Click vào Mus musculus Glnc1 gene for globin c1 accession LT548154, ta có thơng tin gen chiều dài Nu, loại, nguồn gốc trình tự gen Click vào Interpro, ta có thơng tin Hemoglobin, alpha type sau:  Thiết kế phương án tách dòng gen theo bước sau:  Chuẩn bị gen cần tách dòng, phương pháp tổng hợp nhân tạo, bước trên, chạy PCR ảo  Tạo vector tái tổ hợp: chọn vector tách dịng có promoter mạnh, enzyme cắt giới hạn phù hợp để nối gen cần với vector , tạo vector tái tổ hợp  Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ  Sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp  Nuôi cấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phẩm Ta lựa chọn vector tách dòng pET 22b Chọn enzyme cắt giới hạn NdeI có trình tự CATATG XhoI CTCGAG, bổ sung vị trí cắt cặp mồi vào đầu 5’ đoạn mồi xuôi ngược tương ứng ... trúc Tại lại chọn đối tượng thiết kế tách dòng gen chuột?  Thiếu máu hồng cầu hình liềm bệnh di truyền hemoglobin hồng cầu Các hồng cầu bệnh nhân có hình lưỡi liềm hemoglobin bất thường có xu... Glnc1 gene for globin c1 accession LT548154, ta có thơng tin gen chiều dài Nu, loại, nguồn gốc trình tự gen Click vào Interpro, ta có thơng tin Hemoglobin, alpha type sau:  Thiết kế phương án tách. .. Description có đoạn gen có trình tự tương đồng theo tỉ lệ phần trăm cột Per Indent, tỉ lệ cao khả tương đồng gen với gen có ngân hàng liệu lớn Do tính trạng mà gen mã hóa giống với tính trạng gen có ngân