báo cáo thí nghiệm tin sinh phytoene desaturase

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM Mơn: Tin Sinh Lớp: Thứ Nhóm: Thành viên: Trịnh Trà My - 20174954 Trần Thu Yên - 20175381 I Tổng quan đối tượng: Enzyme ​Phytoene desaturase - Là enzyme tìm thấy vi khuẩn cổ, vi khuẩn nấm có liên quan đến sinh tổng hợp carotenoid - Chúng xúc tác cho q trình chuyển đổi 15-cis-phytoene khơng màu thành lycopene màu đỏ tươi đường sinh hóa-con đường poly-trans - Ứng dụng: Dựa vào cấu trúc đặc tính enzyme để tạo chủng vi khuẩn có gene tái tổ hợp có khả sinh tổng hợp carotenoid Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng) lồi tụ cầu khuẩn có khả sinh tổng hợp carotenoid - Trong gene ​Staphylococcus aureus c​ hứa gene mã hóa enzyme Phytoene desaturase - Có biến đổi gene II Quy trình tiến hành: Bước 1: Tìm đoạn nucleotit mã hóa gen ​Phytoene desaturase vi khuẩn Staphylococcus aureus: Vào trang web: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Chọn Protein tìm với từ khóa: Phytoene desaturase Trong mục Top Organisms: Chọn Staphylococcus aureus Đọc chọn lựa trình tự phù hợp với điều kiện nghiên cứu Chọn trình tự có kí hiệu là: >CP029080.1:281269-282774 Staphylococcus aureus strain AR466 chromosome, complete genome CACGCCTTGCTCAATATCTTTAATTATTTCGTCTACAGTTATTTTCGCACTCGTTAAGACAATAGGAAC G CCTGCACCTGGATGCGTACTTGCACCTGCAAAATATAAATCTTTATAATCTCGCGATACATTTTGTGG AC GATAATAATTACTTTGCGATAAAGTTGGCATTAAACCGAATGCCGAACCAAATTTCGCATGATACGTT TG CTCAAAATCATTCGGCGTAAAGATGGTTTCCGATATAATATGCGATTTTATATCTTCAAATGCTTCAA TT GTTGCTAGTTTACGATAAATAACATCTTTTATTTGTTGTGTCAAAGCTTCATCTGACCAATCGATTCCG C TACCTGTTTTAAGTTCCGGAGTCGGCATTAACACATAAATACCAGTTTTGCCTTCTGGCGCAAGTGAT TT ATCAGCGACCGCTGGAACATACACATAAATAGAAGGATCATATGATAAACGTCCCTCAAATATTTCT TCA ATATTGCCTCTAAAATCATCTGAAAAAATAACATTATGAAGTCTCACTTGATCTGTCACATCAATATCT A TACCGATATACATTAAAAATGCTGAACAAGAGTAATCTAAGTCTGCAATTTTATGTGGTGGATACTTT TT AATAGGTGCAAAATCTGGCATTAATGATTCCGCAACACTAGGGAAATCAGCCGTACATAAAATTTTA TCA AATTTTCTTATGTCACGATTCACTTTTATCGCATCGGCCCTTTTGAATTTAGGATCAATAATAATTTGC T CAATTTCAGCATTAAGTTCAATATTAGCGCCTAAGTCTTTATTTAATTGTGCTAGCCCTTGAGCCATGC C ATACATACCGCCTTTAATAAAATGCACACCAAACATCATTTCAATCATAGGAATAATTGAATATAGTG AC GGGCCTCGTTTTGGATCAATTCCTATGTATAACGTTTGAAAGGCTAACAGTTTTTGTATTTTTTCATTA T CAATGTACTGCTCAATTAATTGATCTGCATGATTTAGAGTTTTTAATTTAGCACCTTGCACAAGTGAC GT CATATTATAAAAGTCACTTGGTTTGCGATACGTTCTTTCTAAGAAATAGCGACGTGCAATTTCATATT TT TTATAAACATCTGTTAAAAAGGACATAAAACCATGTGTTGAACCCGGTTCTATACTTTCTAGCATGTG CT GTAATTCAGCTAAATCTGTAGGCACCGTTATACAATCATCGCGGTCAAAATACACGTCGTAAATATA ACG TAATTGTCTCAATTCAATATAATCTTCATAATTTTTACCACACATTGTAAATACATCTTTATAAACATCT GGCATCATGACAATTGTGGGACCCATATCAAATGTAAAGCCGTCTTTCTTTAATTGATTCATACGCCC GC CTACATTTGTATTTTTTTCAAATATCGTCACTTCATGACCTTGAGAAGCAATACGGGCTGCCGCTGCT AA TCCTGTGACACCTGCACCAATTACTGCAATCTTCAT >CP006044.1:2680724-2682229 Staphylococcus aureus CA-347, complete genome CACGCCTTGCTCAATATCTTTAATTATTTCGTCTACAGTTATTTTCGCACTCGTTAAGACAATAGGAAC G CCTGCACCTGGATGCGTACTTGCACCTGCAAAATATAAATCTTTATAATCTCGCGATACATTTTGTGG AC GATAATAATTACTTTGCGATAAAGTTGGCATTAAACCGAATGCCGAACCAAATTTCGCATGATACGTT TG CTCAAAATCATTCGGCGTAAAGATGGTTTCCGATATAATATGCGATTTTATATCTTCAAATGCTTCAA TT GTTGCTAGTTTACGATAAATAACATCTTTTATTTGTTGTGTCAAAGCTTCATCTGACCAATCGATTCCG C TACCTGTTTTAAGTTCCGGAGTCGGCATTAACACATAAATACCAGTTTTGCCTTCTGGCGCAAGTGAT TT ATCAGCGACCGCTGGAACATACACATAAATAGAAGGATCATATGATAAACGTCCCTCAAATATTTCT TCA ATATTGCCTCTAAAATCATCTGAAAAAATAACATTATGAAGTCTCACTTGATCTGTCACATCAATATCT A TACCGATATACATTAAAAATGCTGAACAAGAGTAATCTAAGTCTGCAATTTTATGTGGTGGATACTTT TT AATAGGTGCAAAATCTGGCATTAATGATTCCGCAACACTAGGGAAATCAGCCGTACATAAAATTTTA TCA AATTTTCTTATGTCACGATTCACTTTTATCGCATCGGCCCTTTTGAATTTAGGATCAATAATAATTTGC T CAATTTCAGCATTAAGTTCAATATTAGCGCCTAAGTCTTTATTTAATTGTGCTAGCCCTTGAGCCATGC C ATACATACCGCCTTTAATAAAATGCACACCAAACATCATTTCAATCATAGGAATAATTGAATATAGTG AC GGGCCTCGTTTTGGATCAATTCCTATGTATAACGTTTGAAAGGCTAACAGTTTTTGTATTTTTTCATTA T CAATGTACTGCTCAATTAATTGATCTGCATGATTTAGAGTTTTTAATTTAGCACCTTGCACAAGTGAC GT CATATTATAAAAGTCACTTGGTTTGCGATACGTTCTTTCTAAGAAATAGCGACGTGCAATTTCATATT TT TTATAAACATCTGTTAAAAAGGACATAAAACCATGTGTTGAACCCGGTTCTATACTTTCTAGCATGTG CT GTAATTCAGCTAAATCTGTAGGCACCGTTATACAATCATCGCGGTCAAAATACACGTCGTAAATATA ACG TAATTGTCTCAATTCAATATAATCTTCATAATTTTTACCACACATTGTAAATACATCTTTATAAACATCT GGCATCATGACAATTGTGGGACCCATATCAAATGTAAAGCCGTCTTTCTTTAATTGATTCATACGCCC GC CTACATTTGTATTTTTTTCAAATATCGTCACTTCATGACCTTGAGAAGCAATACGGGCTGCCGCTGCT AA TCCTGTGACACCTGCACCAATTACTGCAATCTTCAT >CP047845.1:1727804-1729309 Staphylococcus aureus strain UP_591 chromosome, complete genome CACGCCTTGCTCAATATCTTTAATTATTTCGTCTACAGTTATTTTCGCACTCGTTAAGACAATAGGAAC G CCTGCACCTGGATGCGTACTTGCACCTGCAAAATATAAATCTTTATAATCTCGCGATACATTTTGTGG AC GATAATAATTACTTTGCGATAAAGTTGGCATTAAACCGAATGCCGAACCAAATTTCGCATGATACGTT TG CTCAAAATCATTCGGCGTAAAGATGGTTTCCGATATAATATGCGATTTTATATCTTCAAATGCTTCAA TT GTTGCTAGTTTACGATAAATAACATCTTTTATTTGTTGTGTCAAAGCTTCATCTGACCAATCGATTCCG C TACCTGTTTTAAGTTCCGGAGTCGGCATTAACACATAAATACCAGTTTTGCCTTCTGGCGCAAGTGAT TT ATCAGCGACCGCTGGAACATACACATAAATAGAAGGATCATATGATAAACGTCCCTCAAATATTTCT TCA ATATTGCCTCTAAAATCATCTGAAAAAATAACATTATGAAGTCTCACTTGATCTGTCACATCAATATCT A TACCGATATACATTAAAAATGCTGAACAAGAGTAATCTAAGTCTGCAATTTTATGTGGTGGATACTTT TT AATAGGTGCAAAATCTGGCATTAATGATTCCGCAACACTAGGGAAATCAGCCGTACATAAAATTTTA TCA AATTTTCTTATGTCACGATTCACTTTTATCGCATCGGCCCTTTTGAATTTAGGATCAATAATAATTTGC T CAATTTCAGCATTAAGTTCAATATTAACGCCTAAGTCTTTATTTAATTGTGCTAGCCCTTGAGCCATGC C ATACATACCGCCTTTAATAAAATGCACACCAAACATCATTTCAATCATAGGAATAATTGAATATAGTG AC GGGCCTCGTTTTGGATCAATTCCTATGTATAACGTTTGAAAGGCTAACAGTTTTTGTATTTTTTCATTA T CAATGTACTGCTCAATTAATTGATCTGCATGATTTAGAGTTTTTAATTTAGCACCTTGCACAAGTGAC GT CATATTATAAAAGTCACTTGGTTTGCGATACGTTCTTTCTAAGAAATAGCGACGTGCAATTTCATATT TT TTATAAACATCTGTTAAAAAGGACATAAAACCATGTGTTGAACCCGGTTCTATACTTTCTAGCATGTG CT GTAATTCAGCTAAATCTGTAGGCACCGTTATACAATCATCGCGGTCAAAATACACGTCGTAAATATA ACG TAATTGTCTCAATTCAATATAATCTTCATAATTTTTACCACACATTGTAAATACATCTTTATAAACATCT GGCATCATGACAATTGTGGGACCCATATCAAATGTAAAGCCGTCTTTCTTTAATTGATTCATACGCCC GC CTACATTTGTATTTTTTTCAAATATCGTCACTTCATGACCTTGAGAAGCAATACGGGCTGCCGCTGCT AA TCCTGTGACACCTGCACCAATTACTGCAATCTTCAT >CP047851.1:2641533-2643038 chromosome, complete genome Staphylococcus aureus strain UP_338 CACGCCTTGCTCAATATCTTTAATCATTTCATCTACAGTTATTTTCGCACTCGTTAAGACAATAGGAAC G CCTGCACCTGGATGCGTACTTGCACCTGCAAAATATAAATCTTTATAATCTCGCGATACATTTTGTGG AC GATAATAATTACTTTGCGCTAAAGTTGGCATTAAACCGAATGCCGAACCAAATTTCGCATGATACGTT TG CTCAAAATCATTTGGCGTAAAGATTGTTTCTGAAACAATATGCGATTTTATATCTTCAAATACTTCAAT A GTTGCTAATTTACGATAAATAACATCTTTTATTTGGTCTGTTAATGCTTCATCTGACCAATCGATTCCG C TACCTGTTTTAAGTTCTGGTGTTGGCATTAAAACATAAATACCTGTTTGTCCTTGTGGTGCAAGAGAT TT GTCAGCAACCGCAGGAACATACACATAAATAGAAGGATCATGCGATAATCGCCCTTCAAATATTTCT TCA ATGTTTCCTCTAAAATCATCTGCAAAAATAACATTATGAAGTCTCACTTGATCTGTCACATCAATATCT A TACCGATATACATTAAAAATGCTGAACAAGAGTAATCTAAGTCTGCAATTTTATGTGGTGGATACTTT TT AATAGGTGCAAAATCTGGCATTAATGATTCCGCAACACTAGGGAAATCAGCCGTACATAAAATTTTA TCA AATTTTCTTATGTCACCATTCACTTTTATCGCATCGGCTCGTTTGAATTTAGGATCAATAATAATTTGC T CAATTTCAGCATTAAGTTCAATATTAACGCCTAAATCTTTATTTAATTGCGCTAGCCCTTGAGCCATGC C ATACATACCGCCTTTAATAAAATGCACACCAAACATCATTTCAATCATAGGAATAATTGAATATAGTG AC GGGCCTCGTTTTGGATCAATTCCTATGTATAACGTTTGAAACGCTAAAAGCTTTTGTATCTTTTCGTTA T CAATATAATGTTCAATTAGCTGATCTGCATGATTTAACGTTTTTAACTTAGCACCTTGCACAAGTGAC GT CATATTATAAAAGTCACTTGGTTTGCGATACGTTCTTTCTAAGAAATAGCGACGTGCAATTTCATATT TT TTATAAACATCCGTTAAAAAGGACATAAAACCATGCGTTGAACCAGGTTCTATACTTTCTAGCATGTG CT GTAATTCAGCTAAATCTGTAGGCACCGTTATACAATCATCGCGGTCAAAATACACATCGTAAATATAA CG TAATTGTCTCAATTCAATATAATCTTCATAATTTTTACCACACATTGTAAATACATCTTTATAAACATCT GGCATCATGACAATTGTGGGGCCCATATCAAATGTAAAGCCATCTTTCTTTAATTGATTCATACGCCC GC CTACATTATTATTTTTTTCAAATATCGTCACTTCATGACCTTGAGAAGCAATACGGGCTGCCGCTGCTA A TCCTGTGACACCTGCACCAATCACTGCAATCTTCAT Bước 2: Tìm vùng bảo thủ: Vào trang web: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ «Enter or paste a set of» -> RNA «Sequences in any supported format» -> paste chuỗi trình tự nucleotit Click vào «submit» cuối Bước 3: Thiết kế mồi: ● Đăng nhập vào trang web: https://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi ● Sử dụng trình tự chủng CP029080.1 khuôn ảo ● Chọn vùng bảo thủ để thiết mồi ● Chọn trình tự mồi xi mồi ngược có điều kiện thích hợp: ​Chiều dài đoạn mồi khoảng 18-24 bp, tỉ lệ GC khoảng 40-60%, nucleotide đầu 3’ có C G Kết thu được: Left primer: CGCGGTCAAAATACACGTCG Right primer: TGTCACAGGATTAGCAGCGG Bước 4: Kiểm tra chất lượng đoạn mồi PCR ảo: ● Truy cập vào trang web: https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_products.html ● Chọn đoạn mồi xi, ngược vừa tìm bước vào nhận kết PCR ● Kết PCR ảo: CGCGGTCAAAATACACGTCGTAAATATAACGTAATTGTCTCAATTCAATATAATCTTCAT AATTTTTACCACACATTGTAAATACATCTTTATAAACATCTGGCATCATGACAATTGTGG GACCCATATCAAATGTAAAGCCGTCTTTCTTTAATTGATTCATACGCCCGCCTACATTTG TATTTTTTTCAAATATCGTCACTTCATGACCTTGAGAAGCAATACGGGCTGCCGCTGCTA ATCCTGTGACA Bước 5: So sánh tương đồng mạch ảo so với chuỗi tương ứng lưu trữ ngân hàng gen ● So sánh kết PCR ảo với genome chủng CP006044.1 ● So sánh kết PCR ảo với genome lồi khác (LAKG0100037.1) => Có tương đồng trình tự kết PCR ảo với chủng khác loài khác => Đoạn bảo thủ lựa chọn phù hợp ● Quay lại BLAST định danh: - Truy cập NCBI => BLAST: Nucleotide => Protein - Chọn Per Ident cao E value thấp để có tương đồng cao Chọn Protein có tương đồng cao với mục tiêu >SRC83945.1:10-92 Dehydrosqualene desaturase (Diapophytoene desaturase) (4,4-diapophytoene desaturase) [Staphylococcus aureus] VTGLAAAARIASQGHEVTIFEKNTNVGGRMNQLKKDGFTFDMGPTIVMMPDVYKDV FTMCGKNYEDYIELRQLRYIYDVYFDR Buổi 4: Dự đoán pI, khối lượng phân tử: Dùng Expasy: ​https://www.expasy.org/proteomics => Proteomics => Compute pI/MW pI = 5,71 M = ​9568.96​ Da Dự đoán chức : - Truy cập: https://www.uniprot.org/uniref/ - BLAST trình tự PCR ảo => Chọn Protein có độ tương đồng cao - Vào mục Funtion => Chức Protein: Tham gia vào trình sinh tổng hợp carotene, có vai trị chức bảo vệ chống lại oxy hóa Xúc tác ba phản ứng khử hydro để liên kết ba thành liên kết đôi (4,4'-diapophytoene (dehydrosqualene)), với 4,4'-diapophytofluene 4,4'-diapo-zeta-carotene chất trung gian 4,4' 4'4-diaponeurosporene (sắc tố màu vàng đậm chủng staphylococci) sản phẩm cuối Tìm vị trí Vào trang : ​http://phobius.sbc.su.se/cgi-bin/predict.pl =>> Enzyme ngoại bào Buổi 5: Cấu trúc không gian chiều: - Sử dụng kết BLAST Tìm Region name - Tìm Structure : COG1233 - Kết quả: - ​ ownload máy => ​Sử dụng phần mềm Cn3D 4.3.1 => M ​ file D - Vào Style ​=> ​Coloring Shortcuts => Secondary Structure - - - Cấu trúc hóa học khơng nằm cấu trúc sinh học : Flavin-adnine Dinucleotide ... Protein có tương đồng cao với mục tiêu >SRC83945.1:10-92 Dehydrosqualene desaturase (Diapophytoene desaturase) (4,4-diapophytoene desaturase) [Staphylococcus aureus] VTGLAAAARIASQGHEVTIFEKNTNVGGRMNQLKKDGFTFDMGPTIVMMPDVYKDV... khả sinh tổng hợp carotenoid - Trong gene ​Staphylococcus aureus c​ hứa gene mã hóa enzyme Phytoene desaturase - Có biến đổi gene II Quy trình tiến hành: Bước 1: Tìm đoạn nucleotit mã hóa gen ? ?Phytoene. .. đối tượng: Enzyme ? ?Phytoene desaturase - Là enzyme tìm thấy vi khuẩn cổ, vi khuẩn nấm có liên quan đến sinh tổng hợp carotenoid - Chúng xúc tác cho trình chuyển đổi 15-cis -phytoene không màu