Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất từ nguồn giá thể sau thu hoạch nhộng trùng thảo (cordyceps militaris)

Trong số tất cả các loài nấm dược liệu đang được nghiên cứu hiện nay, Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) được chú ý hơn cả bởi chúng là loại dược liệu quý, rất tốt cho sức khỏe con người, phù hợp với mọi lứa tuổi. Bên cạnh đó, Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) cũng được nghiên cứu nhiều như một nguồn thay thế cho Đông trùng hạ thảo bởi thành phần hóa học và dược tính của chúng tương tự nhau. Quả thể của cả hai loài C. sinensis và C. militaris rất có giá trị và có chứa những chất chuyển hóa khác với sợi nấm sinh dưỡng.

EBOOKBKMT.COM MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH .2 DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 1.1 Tổng quan nấm đông trùng hạ thảo (cordyceps sinensis) 1.2 Tổng quan nấm nhộng trùng thảo (cordyceps militaris) .10 1.3 Phân biệt nấm đông trùng hạ thảo (cordyceps sinensis) nấm nhộng trùng thảo (cordyceps militaris) 13 1.4 Các phương pháp phân tích hoạt chất đông trùng hạ thảo 14 1.5 Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo 16 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 2.2 Vật liệu nghiên cứu 17 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu .18 2.4 Xử lý số liệu 19 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20 3.1 Xử lý nguyên liệu 20 3.2 Phân tích so sánh thành phần nguyên liệu (giá thể sau thu hoạch) với nhộng trùng thảo 20 3.3 Xây dựng quy trình chiết hoạt chất từ giá thể 25 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Đề xuất 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 EBOOKBKMT.COM DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nấm Đơng trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) .7 Hình 1.2 Nấm Nhộng trùng thảo nuôi trồng (Cordyceps militaris) .11 Hình 1.3 Cơng thức hóa học cordycepin .11 Hình 1.4 Cơng thức hóa học adenosin 12 Hình 2.1 Giá thể Nhộng trùng thảo sau thu hoạch 17 Hình 3.1 Sắc ký đồ TLC dịch chiết n-hexan mẫu nấm giá thể với hệ dung môi 21 Hình 3.2 Sắc ký đồ TLC dịch chiết n-hexan mẫu nấm giá thể với hệ dung môi 22 Hình 3.3 Sắc ký đồ TLC dịch chiết MeOH mẫu nấm giá thể với hệ dung môi 22 Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC dịch chiết MeOH mẫu nấm giá thể với hệ dung môi 23 Hình 3.5 Sắc ký đồ TLC dịch chiết MeOH mẫu nấm giá thể với hệ dung môi 24 Hình 3.6 Biểu đồ hiệu suất chiết phân đoạn 26 Hình 3.7 Biểu đồ hiệu suất chiết theo nồng độ cồn nước 28 Hình 3.8 Biểu đồ hiệu suất kích thước nguyên liệu .30 Hình 3.9 Biểu đồ hiệu suất chiết theo thời gian 31 Hình 3.10 Biểu đồ hiệu suất chiết với tỷ lệ nước cất khác 33 Hình 3.11 Sơ đồ quy trình chiết xuất giá thể Nhộng trùng thảo 35 Hình 3.12 Sản phẩm thu sau chiết .36 Hình 3.13 Biểu đồ khảo sát độ ổn định quy trình 36 Hình 3.14 Biểu đồ phân bố chất tan cồn polysaccharid sản phẩm .37 Hình 3.15 Sắc ký đồ HPLC mẫu cao chiết nấm Nhộng trùng thảo .40 Hình 3.16 Sắc ký đồ HPLC mẫu cao chiết giá thể sau thu hoạch Nhộng trùng thảo 40 EBOOKBKMT.COM DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Khối lượng phân đoạn chiết thu từ 10g nguyên liệu .26 Bảng 3.2 Khối lượng sản phẩm chiết dung môi từ 10 g nguyên liệu .28 Bảng 3.3 Khối lượng sản phẩm chiết với cỡ mẫu khác (g) 29 Bảng 3.4 Khối lượng sản phẩm chiết với thời gian mẫu khác (g) 31 Bảng 3.5 Khối lượng sản phẩm chiết với tỉ lệ nước cất khác (g) 33 Bảng 3.6 Khối lượng khảo sát độ ổn định quy trình (g) 36 Bảng 3.7 Kết khảo sát sơ polysaccharid sản phẩm cao chiết 37 Bảng 3.8 Kết định lượng cordycepin adenosin hai mẫu cao chiết nước từ nấm Nhộng trùng thảo từ giá thể sau thu hoạch nấm 39 EBOOKBKMT.COM ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, thiên nhiên ưu đãi nguồn tài nguyên sinh học phong phú đa dạng Bên cạnh hệ động thực vật quý hiếm, Việt Nam nơi lưu trữ giống nấm dược liệu da dạng, có hoạt tính sinh học cao, có nhiều tác dụng việc làm thuốc chữa bệnh, thực phẩm chức Tuy nhiên, dựa khai thác tự nhiên không đáp ứng nhu cầu, để sản xuất tạo nguồn lợi nhuận hàng năm từ việc lưu giữ, phát triển ứng dụng công nghệ sản xuất nấm dược liệu lĩnh vực nước ta Trong số tất loài nấm dược liệu nghiên cứu nay, Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) ý chúng loại dược liệu quý, tốt cho sức khỏe người, phù hợp với lứa tuổi Bên cạnh đó, Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) nghiên cứu nhiều nguồn thay cho Đông trùng hạ thảo thành phần hóa học dược tính chúng tương tự Quả thể hai loài C sinensis C militaris có giá trị có chứa chất chuyển hóa khác với sợi nấm sinh dưỡng Theo tài liệu ghi chép đông dược cổ số nghiên cứu đại, Đông trùng hạ thảo Nhộng trùng thảo vị thuốc bồi bổ quý giá, có tác dụng tích cực tới bệnh bệnh hệ tiết, bệnh xương khớp, bệnh đường hô hấp, nâng cao lực miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư, chống di căn, chống chất phóng xạ, có tác dụng tốt trẻ em bị cịi xương chậm lớn, Hơn nữa, thị trường xuất nhiều loại sản phẩm thuốc thực phẩm chức chiết xuất từ Nhộng trùng thảo Yến Nhộng trùng thảo, Pure cordyceps capsules… Hiện nay, Việt Nam tạo quy trình ni cấy Nhộng trùng thảo phịng thí nghiệm cách ni cấy nấm giá thể bắp ngô mẻ trộn với bột nhộng tằm Chúng muốn tận thu giá trị dinh dưỡng lại đế nấm sau thu hoạch nấm để nguồn dinh dưỡng có ích khơng bị lãng phí Chính tính chất độc đáo dược liệu thúc chúng thực đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất từ nguồn giá thể sau thu hoạch Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris)” EBOOKBKMT.COM Mục tiêu đề tài xây dựng quy trình chiết xuất hoạt chất từ nguồn giá thể sau thu hoạch Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) Để hoàn thành mục tiêu trên, đề tài thực nội dung sau: Phân tích so sánh thành phần nguyên liệu (giá thể sau thu hoạch) với Nhộng trùng thảo Khảo sát điều kiện chiết xuất hoạt chất Xây dựng quy trình Đánh giá sản phẩm EBOOKBKMT.COM CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 1.1 TỔNG QUAN VỀ NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps sinensis) 1.1.1 Vị trí phân loại Đơng trùng hạ thảo có vị trí phân loại sau: Giới (regnum): Fungi Ngành (phylum): Ascomycota Lớp (Class): Sordariomycetes Bộ (ordo): Hypocreales Họ (familia): Clavicipitaceae Chi (genus): Cordyceps Loài (species): C sinensis 1.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo nhà khoa học Trung Quốc xác định đầu xuất từ vùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dược liệu thực chất tượng ấu trùng loài bướm thuộc chi Thitarodes bị nấm Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc ký sinh Năm 1878 nhà khoa học phát nấm ký sinh sâu non (ấu trùng) lồi trùng thuộc chi Thitarodes Thường dễ gặp sâu non loài Thitarodes baimaensis Thitarodes armoricanus, ngồi cịn 46 lồi khác thuộc chi Thitarodes bị Cordyceps sinensis ký sinh Vào cuối mùa thu chất da sâu non họ Ngài đêm (Noctuidae) tương tác với bào tử nấm tạo sợi nấm, sợi nấm đâm sâu vào ấu trùng, coi chúng chất dinh dưỡng để phát triển Đến đầu mùa hè năm sau, nấm phát sinh mạnh gây chết sâu, sau chúng hình thành chồi, phát triển chui khỏi mặt đất, gốc dính vào đầu sâu Do nhiều người gọi nấm Đơng trùng hạ thảo mùa đơng nấm sống thể trùng, mùa hè nấm phát triển ngồi thể giống cỏ Đầu kỷ XVIII, người truyền giáo Châu Âu đưa Đông trùng hạ thảo đến với nước Pháp để nghiên cứu, họ coi nước Pháp nước có y học đại Đến nhiều nước nghiên cứu, điều tra thu thập nấm Đông trùng hạ thảo tự nhiên để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức phục vụ cho người EBOOKBKMT.COM Hình 1.1 Nấm Đơng trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) 1.1.3 Sự phân bố đặc điểm nấm Đông trùng hạ thảo a Phân bố Đông trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy vào mùa hè, vùng núi cao 4.000m cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc Vân Nam, Theo nhà khoa học chi nấm Cordiceps có tới 400 lồi khác nhau, tính riêng Trung Quốc tìm thấy khoảng 60 lồi Đơng trùng hạ thảo Tuy nhiên người ta nghiên cứu lồi nấm Cordyceps siensis Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt với người Loài nấm phân bố rộng châu Á với trung tâm đa dạng vùng Đông Á Châu Úc b Đặc điểm Loài nấm Cordyceps lây nhiễm vào thể sâu hại đến chưa hiểu nguyên nhân Những sâu ăn phải bào tử nấm chúng mắc bệnh nấm ký sinh từ lỗ thở Đến sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào mô vật chủ, sử dụng hoàn toàn chất dinh dưỡng thể sâu Đến giai đoạn định, nấm phát triển thành dạng (hình dạng giống thực vật) phát tán bào tử Nấm Đơng trùng hạ thảo cịn sống, người ta trơng rõ hình sâu, với đuôi cành nhỏ, mọc Khi sấy khô, có mùi cá, đốt lên có mùi thơm Phần “lá” hình dạng giống ngón tay, dài khoảng – 11cm sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành Đầu sâu non giống tằm, dài chừng 3-5 cm, đường kính khoảng 0,3-0,8 cm Bên ngồi có màu vàng sẫm nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía gần đầu nhỏ Phần đầu có màu nâu đỏ, giống tằm, có tất cặp chân, đôi rõ Chất đệm nấm hình que cong mọc EBOOKBKMT.COM từ sâu non, dài sâu non chút Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên căng đầy, màu trắng vàng; chất đệm nấm dai bên ruột rỗng, có màu trắng ngà [6,7] 1.1.4 Thành phần hóa học nấm Đơng trùng hạ thảo Đơng trùng hạ thảo chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học như: ribonucleosid, mannitol, sterol, acid hữu cơ, loại đường mono-, di-, oligosaccharid polysaccharid, protein, polyamin, vitamin (E, K, B1, B2, B12…) nhiều khoáng chất (K, Na, Ca, Mg, Cu, Mn, Zn, Se, Si…) nhóm hoạt chất có tác dụng quan trọng HEAA (hydroxyl ethyl adenosin analogs) a Các nucleosid Các nucleosid thành phần có hoạt tính Đơng trùng hạ thảo, adenosin, cordycepin sử dụng hoạt chất để đánh giá chất lượng Đơng trùng hạ thảo Ngồi Đơng trùng hạ thảo cịn có nucleosid khác uridin, 2’-3’-dideoxyadenosin (cấu trúc đưa vào hợp chất có hoạt tính antiretrovirus điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV didanosin, hydroxyethyladenosin, guanidin, deoxyguanidin…, hoạt chất khơng thể tìm thấy dược liệu khác tự nhiên) b Các polysaccharid Đây thành phần góp phần vào tác dụng sinh học Đông trùng hạ thảo Bản đồ saccharid dược liệu có đóng vai trị đánh giá chất lượng Một số monosaccharid có Đơng trùng hạ thảo rhamnose, ribose, arabinnose, glucose, manitol, fructose… c Các sterol Các phytosterol Đông trùng hạ thảo (cholesterol, campesterol, β-sitosterol) đóng vai trị quan trọng điều trị ung thư vú, tuyến tiền liệt ung thư trực tràng d Các nhóm hoạt chất khác Đơng trùng hạ thảo có chứa acid amin thiết yếu acid glutamic, acid aspartic, arginin… hợp chất kiểu poliamin cadaverin, spermidin, spermin…, cyclodipeptid cordycedipeptid A Các hoạt chất có hoạt chất chống viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus EBOOKBKMT.COM 1.1.5 Tác dụng nấm Đông trùng hạ thảo Theo ghi chép đông dược cổ, Đông trùng hạ thảo vị thuốc bồi bổ q giá, có tác dụng tích cực với bệnh như: - Chống lại tác dụng xấu tân dược thận, thí dụ độc tính Cephalosporin A - Bảo vệ thận trường hợp gặp tổn thương thiếu máu - Chống lại suy thoái thận, xúc tiến việc tái sinh phục hồi tế bào tiểu quản thận - Làm hạ huyết áp người cao huyết áp - Chống lại tượng thiếu máu tim - Giữ ổn định nhịp đập tim - Tăng cường tính miễn dịch khơng đặc hiệu - Điều tiết tính miễn dịch đặc hiệu - Tăng cường lực thực bào tế bào miễn dịch - Tăng cường tác dụng nội tiết tố tuyến thượng thận làm trương nở nhánh khí quản - Tăng cường dịch tiết khí quản trừ đờm - Làm chậm q trình lão hố thể - Hạn chế bệnh tật tuổi già - Nâng cao lực chống ung thư thể - Chống lại tình trạng thiếu oxygen thể EBOOKBKMT.COM - Tăng cường tác dụng lưu thông máu thể - Hạn chế tác hại tia gamma thể - Tăng cường tác dụng an thần, trấn tĩnh thần kinh - Tăng cường việc điều tiết nồng độ đường máu - Làm giảm cholesterol máu chống xơ vữa động mạch - Xúc tiến tác dụng nội tiết tố (hormone) - Tăng cường chức tiêu hoá hấp thu chất dinh dưỡng - Ức chế vi sinh vật có hại, kể vi khuẩn lao - Kháng viêm tiêu viêm - Có tác dụng cường dương chống liệt dương Với tác dụng nấm đơng trùng hạ thảo cịn trực tiếp ảnh hưởng đến số hệ thống quan trọng thể 1.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM NHỘNG TRÙNG THẢO (Cordyceps militaris) 1.2.1 Vị trí phân loại Nhộng trùng thảo có vị trí phân loại sau: Giới (regnum): Fungi Ngành (phylum): Ascomycota Lớp (Class): Sordariomycetes Bộ (ordo): Hypocreales Họ (familia): Cordycipitaceae Chi (genus): Cordyceps Loài (species): C militaris 1.2.2 Đặc điểm Nhộng trùng thảo Ngồi tự nhiên vào đầu mùa đơng, nấm Cordyceps militaris ký sinh thân sâu non (con nhộng tằm), lấy chất dinh dưỡng nhộng tằm để sinh trưởng Vào đầu mùa hè ấm áp, nấm bắt đầu mọc lên từ thân nhộng tằm, hút hết chất dinh dưỡng thân nhộng tằm, nhộng tằm chết nấm vươn lên khỏi mặt đất Vào tháng (mùa hạ) 10 EBOOKBKMT.COM A B C Hình 3.5 Sắc ký đồ TLC dịch chiết MeOH mẫu nấm giá thể với hệ dung môi Ghi chú: A: soi UV 254nm B: soi UV 365nm C: thuốc thử màu H2SO4 10% (105-1100̊C) Nhận xét: Phân tích dịch chiết MeOH mẫu nguyên liệu thành phần hợp chất phân cực với hệ dung môi CHCl 3-MeOH-H2O (65:25:5) cho thấy mẫu giá thể sau thu hoạch (mẫu 2) có chứa chất giống với mẫu nấm (mẫu 1) với độ đậm thấp nhiều Nhìn chung, từ kết phân tích TLC nhận thấy giá thể sau thu hoạch nhộng trùng thảo chứa nhiều hoạt chất tương tự nhộng trùng thảo với hàm lượng thấp rõ rệt 24 EBOOKBKMT.COM 3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT HOẠT CHẤT TỪ GIÁ THỂ 3.3.1 Khảo sát hiệu suất chiết phân đoạn a Chuẩn bị nguyên liệu dung môi Nguyên liệu: Giá thể sau thu hoạch Nhộng trùng thảo nấm Nhộng trùng thảo xay nhỏ đến kích thước < 1mm Dung mơi khảo sát: n-hexan, ethanol 80%, nước cất b Cách tiến hành  Chiết n-hexan Lấy 10g bột nguyên liệu cho vào túi vải, đặt bình chiết chiết Soxhlet Rót n-hexan ngập bình dung mơi rút xuống bình cầu bên dưới, sau dung mơi rút hết cho tiếp lượng dung mơi vào vừa đến mức đủ ngập túi nguyên liệu Lắp sinh hàn chiết đến thấy dịch chiết không màu Dịch chiết thu đem cô thu hồi dung môi đến dịch đậm đặc, sấy 80ºC Cân ghi lại khối lượng Tiến hành với mẫu chiết đồng thời để lấy giá trị trung bình  Chiết ethanol 80% Bã mẫu sau chiết n-hexan bay hết n-hexan, cho vào bình cầu 250ml, thêm 100ml cồn 80% Lắp sinh sàn hồi lưu, đun sơi nhẹ vịng Gạn lọc lấy dịch chiết trong, bã thu lại chiết với 100ml ethanol 80% tiếp tục đun Gạn, lọc lấy dịch chiết, bã chiết tiếp tương tự thêm lần Dịch chiết ethanol 80% cô quay đến cắn, sấy 80ºC giờ, cân ghi lại kết  Chiết nước Bã sau chiết ethanol 80% cho chiết với 100ml H2O nhiệt độ sôi, chiết lần, lần Dịch chiết nước cô bốc đến dịch đậm đặc, sấy 800̊C giờ, cân ghi lại kết c Kết Kết trình bày bảng 3.1 hình 3.6 25 EBOOKBKMT.COM Bảng 3.1: Khối lượng phân đoạn chiết thu từ 10g nguyên liệu Dung môi Mẫu nguyên liệu Giá thể sau thu hoạch (gam) Hexan Hiệu suất (%) Lần Lần Ethanol 80% Lần Tổng cộng Hiệu suất (%) Lần Lần H2O Lần Tổng cộng Hiệu suất (%) Nấm nhộng trùng thảo (gam) 0,14 1,4 0,36 0,20 0,12 0,68 6,8 0,46 0,18 0,08 0,72 7,2 0,14 1,4 1,38 0,85 0,68 2,91 29,1 1,03 0,88 0,19 2,10 21,0 Hình 3.6 Biểu đồ hiệu suất chiết phân đoạn d Nhận xét Kết thu cho thấy: - Hiệu suất chiết cồn 80% từ Nấm nhộng trùng thảo cao phân đoạn chiết, đạt 29,1%, cao 1,4 lần so với hiệu suất chiết phân đoạn nước gấp 20 lần so với hiệu suất chiết phân đoạn n-hexan - Hiệu suất chiết phân đoạn cồn 80% nước từ giá thể sau thu hoạch thấp từ nấm nhộng trùng thảo tương ứng lần với cồn 80% khoảng gần lần với nước - Hiệu suất chiết phân đoạn n-hexan mẫu nguyên liệu thấp, đạt 1,4% so với khối lượng nguyên liệu ban đầu Điều cho thấy hợp chất phân cực Nấm nhộng trùng thảo chiếm hàm lượng thấp 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cồn nước đến hiệu suất chiết a Chuẩn bị nguyên liệu dung môi 26 EBOOKBKMT.COM Nguyên liệu: 40g giá thể Nhộng trùng thảo xay nhuyễn