3.3.1. Khảo sát hiệu suất chiết phân đoạn
a. Chuẩn bị nguyên liệu và dung môi
Nguyên liệu: Giá thể sau thu hoạch Nhộng trùng thảo và nấm Nhộng trùng thảo được xay nhỏ đến kích thước < 1mm.
Dung môi khảo sát: n-hexan, ethanol 80%, nước cất. b. Cách tiến hành
Chiết n-hexan
Lấy 10g bột nguyên liệu cho vào túi vải, đặt trong bình chiết của bộ chiết Soxhlet. Rót n-hexan ngập bình để cho dung môi rút xuống bình cầu bên dưới, sau khi dung môi rút hết thì cho tiếp lượng dung môi vào vừa đến mức đủ ngập túi nguyên liệu. Lắp sinh hàn và chiết đến khi thấy dịch chiết không màu. Dịch chiết thu được đem cô thu hồi dung môi đến dịch đậm đặc, sấy ở 80ºC trong 2 giờ. Cân và ghi lại khối lượng.
Tiến hành với 2 mẫu chiết đồng thời để lấy giá trị trung bình. Chiết ethanol 80%
Bã mẫu sau khi chiết bằng n-hexan thì để cho bay hơi hết n-hexan, cho vào bình cầu 250ml, thêm 100ml cồn 80%. Lắp sinh sàn hồi lưu, đun sôi nhẹ trong vòng 1 giờ.
Gạn lọc lấy dịch chiết trong, bã thu được lại chiết với 100ml ethanol 80% và tiếp tục đun trong 1 giờ. Gạn, lọc lấy dịch chiết, bã được chiết tiếp tương tự thêm 1 lần nữa.
Dịch chiết ethanol 80% cô quay đến cắn, sấy ở 80ºC trong 2 giờ, cân và ghi lại kết quả.
Chiết nước.
Bã sau chiết ethanol 80% cho chiết với 100ml H2O ở nhiệt độ sôi, chiết 3 lần, mỗi lần 1 giờ.
Dịch chiết nước cô bốc hơi đến dịch đậm đặc, sấy 800̊C trong 2 giờ, cân và ghi lại kết quả.
c. Kết quả
Bảng 3.1: Khối lượng các phân đoạn chiết thu được từ 10g nguyên liệu Mẫu nguyên liệu
Dung môi
Giá thể sau thu hoạch (gam) Nấm nhộng trùng thảo (gam) Hexan 0,14 0,14 Hiệu suất (%) 1,4 1,4 Ethanol 80% Lần 1 0,36 1,38 Lần 2 0,20 0,85 Lần 3 0,12 0,68 Tổng cộng 0,68 2,91 Hiệu suất (%) 6,8 29,1 H2O Lần 1 0,46 1,03 Lần 2 0,18 0,88 Lần 3 0,08 0,19 Tổng cộng 0,72 2,10 Hiệu suất (%) 7,2 21,0
Hình 3.6. Biểu đồ hiệu suất chiết phân đoạn
d. Nhận xét
Kết quả thu được cho thấy:
- Hiệu suất chiết cồn 80% từ Nấm nhộng trùng thảo là cao nhất trong 3 phân đoạn chiết, đạt 29,1%, cao hơn 1,4 lần so với hiệu suất chiết phân đoạn nước và gấp 20 lần so với hiệu suất chiết phân đoạn n-hexan.
- Hiệu suất chiết các phân đoạn cồn 80% và nước từ giá thể sau thu hoạch đều thấp hơn từ nấm nhộng trùng thảo tương ứng là hơn 4 lần với cồn 80% và khoảng gần 3 lần với nước.
- Hiệu suất chiết phân đoạn n-hexan của 2 mẫu nguyên liệu đều thấp, chỉ đạt 1,4% so với khối lượng nguyên liệu ban đầu. Điều này cho thấy các hợp chất kém phân cực trong Nấm nhộng trùng thảo chiếm hàm lượng rất thấp.
3.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ cồn nước đến hiệu suất chiết
Nguyên liệu: 40g giá thể Nhộng trùng thảo được xay nhuyễn <1mm. Dung môi: nước cất, ethanol (30%, 50%, 70%).
b. Cách tiến hành
Cân 10g mẫu giá thể vào túi vải. Sau đó, cho vào bình cầu đáy tròn 250ml, thêm vào 100ml nước cất.
Lắp sinh hàn hồi lưu và đun sôi hỗn hợp trên bếp điện trong vòng 1 giờ.
Sau 1 giờ, rót dung dịch trong bình cầu ra cốc 250ml. Tiếp tục thêm 100ml nước cất vào đun sôi thêm 3 lần mỗi lần 1 giờ nữa.
Dịch chiết thu được chuyển vào cốc 250ml đem cô cạn cách thủy cho đến dịch đậm đặc. Sau đó, cho vào tủ sấy (sấy ở 80ºC trong 2 giờ). Cân xác định khối lượng cao chiết thu được?
Tiến hành tương tự với các dung môi còn lại: cồn 30%, 50%, 70%. Với mỗi dung môi tiến hành chiết theo quy trình như trên.
c. Kết quả
Kết quả được trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.7.
Bảng 3.2.Khối lượng sản phẩm chiết được bằng các dung môi từ 10 g nguyên liệu. Nước cất (g) Cồn 30% (g) Cồn 50% (g) Cồn 70% (g) Lần 1 0,53 0,35 0,37 0,16 Lần 2 0,23 0,23 0,26 0,21 Lần 3 0,14 0,05 0,09 0,08 Lần 4 0,08 0,06 0,02 0,06 Tổng 0,98 0,69 0,74 0,51 Hiệu suất (%) 9,8 6,9 7,4 5,1
Hình 3.7. Biểu đồ hiệu suất chiết theo nồng độ cồn và nước d. Nhận xét
Hiệu suất chiết cao nhất đạt được khi dùng nước cất (tổng sau 4 lần chiết là 0,98g). Điều này có lẽ là do trong nguyên liệu nhộng trùng thảo thường chứa polysaccharid là
nhau. Mặc khác, hiệu suất chiết ở lần 3 và lần 4 chênh lệch nhau không nhiều. Vì vậy để tiết kiệm dung môi và thời gian ta nên chọn chiết 3 lần.
Do đó, nước cất là dung môi chiết phù hợp nhất và chiết 3 lần để khảo sát các yếu tố tiếp theo.
3.3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất chiết
a. Nguyên liệu và dung môi
Giá thể nhộng trùng thảo với 3 kích thước: mịn (<1mm), trung bình (1-2mm), nguyên hạt (3-4mm)
3-4mm 1-2mm <1mm Dung môi chiết: nước cất.
b. Cách tiến hành.
Lấy 10g mẫu cho vào túi vải, cho vào bình cầu đáy tròn 250ml. Thêm vào đó 100ml nước cất.
Lắp sinh hàn hồi lưu, đun sôi hỗn hợp trên bếp điện 150 phút. Sau 150 phút, bỏ bã mẫu, thu lấy dịch chiết nước cho vào cốc 250ml đem cô cách thủy đến dung dịch đặc. Sau đó, cho vào tủ sấy (sấy ở 80ºC trong 2 giờ). Cân và ghi lại kết quả.
c. Kết quả
Kết quả được trình bày trong bảng 3.3 và hình 3.8.
Bảng 3.3. Khối lượng sản phẩm chiết với các cỡ mẫu khác nhau (g)
Kích thước hạt <1mm 1-2mm 3-4mm
Khối lượng cao
(g) 1,94 0,69 0,31
Hiệu suất (%) 19,4 6,9 3,1
Hình 3.8. Biểu đồ hiệu suất kích thước nguyên liệu
Kết quả cho thấy kích thước hạt càng nhỏ thì hiệu suất chiết được càng cao. Với mẫu được xay mịn thì cho khối lượng sản phẩm chiết là cao nhất (đạt hiệu suất 19,4%) và vượt trội so với hai kích thước được khảo sát còn lại. Vì vậy, kích thước nguyên liệu chiết được chọn là hạt xay mịn < 1mm.
3.3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian chiết đến hiệu suất chiết
a. Nguyên liệu và dung môi
Nguyên liệu: 100g bột giá thể Nhộng trùng thảo. Dung môi: nước cất.
b. Cách tiến hành
Cân 10g mẫu giá thể vào túi vải. Sau đó, cho vào bình cầu đáy tròn 250ml, thêm vào 100ml nước cất.
Lắp sinh hàn hồi lưu và đun sôi hỗn hợp trên bếp điện trong vòng 30 phút.
Sau 30 phút, rót dung dịch trong bình cầu ra cốc 250ml. Dịch chiết nước trong cốc 250ml đem cô cạn cách thủy cho đến dịch đậm đặc. Sau đó, cho vào tủ sấy (sấy 80ºC). Cân khối lượng cao khô thu được.
Tiến hành tương tự với các thời gian còn lại: 45 phút, 60 phút, 75 phút, 90 phút, 105 phút, 120 phút, 135 phút, 150 phút, 180 phút. Với mỗi thời gian tiến hành chiết theo quy trình như trên.
c. Kết quả
Kết quả được trình bày trong bảng 3.4 và hình 3.9.
Bảng 3.4. Khối lượng sản phẩm chiết với các thời gian khác nhau (g) Thời gian (phút) 30 45 60 75 90 105 120 135 150 180 Khối lượng cao (g) 0,53 0,55 0,76 0,82 0,88 1,03 1,07 1,09 1,08 1,07 Hiệu suất (%) 5,3 5,5 7,6 8,2 8,8 10,3 10,7 10,9 10,8 10,7
d. Nhận xét
Từ bảng kết quả trên cho thấy hiệu suất chiết ở 120 phút, 135 phút, 150 phút và 180 phút chênh lệch không đáng kể. Vì vậy, để tiết kiệm thời gian thì nên chọn chiết ở 120 phút cho mỗi lần chiết.
3.3.5. Khảo sát sự ảnh hưởng cuả tỷ lệ nước và nguyên liệu đến hiệu suất chiết
a. Nguyên liệu và dung môi
Nguyên liệu: 40g giá thể Nhộng trùng thảo sau thu hoạch được xay mịn <1mm. Dung môi: nước cất theo các tỷ lệ nước /nguyên liệu khác nhau:
- Phương án 1: chiết 3 lần theo tỷ lệ: 9/1, 6/1, 4/1 - Phương án 2: chiết 3 lần theo tỷ lệ: 7/1, 6/1, 5/1 - Phương án 3: chiết 3 lần theo tỷ lệ: 6/1, 6/1, 5/1 - Phương án 4: chiết 3 lần theo tỷ lệ: 5/1, 5/1, 5/1
b. Cách tiến hành
Cân 10g mẫu giá thể cho vào bình cầu 250ml, thêm vào bình cầu 90ml nước cất. Lắp sinh hàn hồi lưu và đun sôi hỗn hợp trong vòng 120 phút. Sau khi đun xong, lọc lấy dịch nước chiết bằng giấy lọc thu được vào cốc 250ml, cô bốc hơi nước cho đến cắn. Sau đó, cho vào tủ sấy (sấy ở 80ºC trong 2 giờ). Cân và ghi kết quả.
Bã sau khi chiết lần 1, thêm 60ml nước cất vào lại bình cầu. Tiếp tục đun thêm 120 phút. Làm tương tự như trên thêm 1 lần nữa với lượng nước cất lần 3 là 40ml.
Tiến hành tương tự với các tỷ lệ còn lại: (70/60/50) trên 10g mẫu, (60/60/50) trên 10g mẫu, (50/50/50) trên 10g mẫu.Với mỗi thời gian tiến hành chiết theo quy trình như trên.
Bảng 3.5. Khối lượng sản phẩm chiết với tỉ lệ nước cất khác nhau (g) Phương án 1
(g) Phương án 2(g) Phương án 3(g) Phương án 4(g)
Lần 1 0,85 0,70 0,62 0,58
Lần 2 0,51 0,50 0,52 0,47
Lần 3 0,36 0,40 0,25 0,13
Tổng 1,72 1,60 1,39 1,18
Hiệu suất (%) 17,2 16,0 13,9 11,8
Hình 3.10. Biểu đồ hiệu suất chiết với tỷ lệ nước cất khác nhau
d. Nhận xét
Từ bảng kết quả trên cho thấy hiệu suất chiết với tỷ lệ 9/1, 6/1, 4/1 có khối lượng cao nhất (bằng 1,72g). Nếu tính theo lượng cao chiết thu được từ một đơn vị thể tích nước (9,05mg/ml nước) thì phương án này cũng cho hiệu quả chiết là cao nhất. Vì vậy, đây là phương án phù hợp được chọn.
3.3.6. Xây dựng quy trình và khảo sát độ ổn định của quy trình
Qua quá trình khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất chúng tôi đã chọn được những điều kiện để xây dựng quy trình chiết xuất từ giá thể Nhộng trùng thảo ở quy mô phòng thí nghiệm như sau:
- Dung môi chiết là nước cất - Kích thước dược liệu: <1mm
- Thời gian chiết là 120 phút cho mỗi lần chiết, chiết 3 lần - Tỷ lệ nước/nguyên liệu cho 3 lần chiết là 9/1, 6/1, 4/1 Quy trình chiết được thực hiện như sơ đồ ở hình 3.11 sau:
Dịch chiết 3
100g giá thể Nhộng trùng thảo xay nhuyễn (< 1mm)
Bã dược liệu Dịch chiết 1
Dịch chiết 2 Bã dược liệu
Bã dược liệu 900ml nước cất Chiết lần 1, đun 120 phút lọc 400ml nước cất Chiết lần 3, đun 120 phút, lọc 600ml nước cất Chiết lần 2, đun 120 phút lọc Sản phẩm Cô đến dịch đặc Sấy 80ºC
Tương tự làm thêm 2 lần như quy trình chiết xuất trên.
Hình 3.12. Sản phẩm thu được sau khi chiết Kết quả như trên bảng 3.6 và hình 3.13.
Bảng 3.6. Khối lượng khảo sát độ ổn định của quy trình (g)
Mẫu kết quả 1 (g) Mẫu kết quả 2 (g) Mẫu kết quả 3 (g) Trung bình 3 mẫu kết quả Lần 1 8,57 8,42 8,62 Lần 2 5,19 5,21 4,99 Lần 3 3,52 3,43 3,58 Tổng từng mẫu (g) 17,28 17,06 17,19 17,18 Hiệu suất (%) 17,28 17,06 17,19 17,18
Hình 3.13. Biểu đồ khảo sát độ ổn định của quy trình
Kết quả thu được cho thấy quy trình chiết xuất đã xây dựng có tính ổn định khi áp dụng với lượng 100g nguyên liệu/mẻ. Hiệu suất chiết trung bình đạt 17,18% so với khối lượng nguyên liệu ban đầu.
3.3.7. Khảo sát sơ bộ hàm lượng polysaccharid trong sản phẩm cao chiết
a. Nguyên liệu và dung môi
- Nguyên liệu: 0,5g sản phẩm cao chiết. - Dung môi: Cồn 90%.
b. Cách tiến hành
Cân 0,5g sản phẩm cao chiết cho vào cốc beaker 100ml, thêm vào 10ml ethanol 90%. Đặt vào Bể siêu âm Elma – tra 30 H Elmasonic trong 15 phút. Sau đó, lọc lấy cặn bằng giấy lọc. Cho vào tủ sấy (sấy 100ºC). Cân và ghi kết quả.
d. Kết quả trên bảng 3.7 và hình 3.14.
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát sơ bộ polysaccharid trong sản phẩm cao chiết Sản phẩm tan trong cồn
90%
Sản phẩm không tan trong cồn 90%
Khối lượng (g) 0,09 0,41
Hiệu suất (%) 18 82
Hình 3.14. Biểu đồ phân bố các chất tan trong cồn và polysaccharid trong sản phẩm e. Nhận xét
Từ kết quả thu được có thể thấy chỉ 16% cao chiết thu được là các chất tan trong cồn 90%, còn phần lớn các chất trong cao có thể là thành phần polysaccharid (82%) mà một phần trong đó có lẽ là polysaccharid từ nhộng trùng thảo, còn một phần lớn có thể là từ polysaccharid có trong giá thể bắp mẻ.
3.3.7. Đánh giá hàm lượng adenosin và cordycepin trong sản phẩm cao chiết bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Điều kiện sắc ký:
- Hệ thống sắc ký: hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HP Hewlett Packard series1050, detector DAD – ELSD (Viện Công nghệ Hóa học –TPHCM)
- Cột: intertsil ODS-3, 4,6x250mm, 5µm, GL Science Ir. (Japan) - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Thể tích tiêm: 20µl - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Bước sóng phát hiện: 260nm
- Pha động: Methanol (A) và dung dịch acid formic 0,1% (B) Chương trình dung môi:
Thời gian (phút) A (%) B (%)
0 7 93
11 7 93
14 100 0
Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1,00g bột mẫu thử, thêm chính xác 10ml methanol 80%, siêu âm 15 phút ở 400C, ly tâm ở tốc độ 3500 vòng/phút trong 5 phút, gạn dịch nổi phía trên vào bình định mức 10ml. Để nguội, định mức đến vạch, lọc qua màng lọc 0,45μm lấy dung dịch tiêm sắc ký.
Dung dịch mẫu chuẩn: Cân chất chuẩn và hòa tan trong methanol 80% để thu được dãy dung dịch chuẩn của cordycepin và adenosin có nồng độ chính xác: 5, 10, 25, 50µg/ml.
Tính kết quả: Hàm lượng cordycepin và adenosin trong mẫu được tính theo công thức.
x H x
Trong đó: S là diện tích pic của chất cần phân tích a,b: các hệ số của phương trình đường chuẩn H: độ tinh khiết của chất chuẩn
V: thể tích dịch chiết (ml) m: khối lượng mẫu (g) adl: độ ẩm mẫu thử (%)
Kết quả:
Kết quả định lượng cordycepin và adenosin trong hai mẫu cao chiết nước từ nấm Nhộng trùng thảo và từ giá thể sau thu hoạch nấm được trình bày trong bảng 3.8. Sắc ký đồ HPLC của 2 mẫu cao chiết được trình bày trong hình 3.15 và 3.16.
Bảng 3.8. Kết quả định lượng cordycepin và adenosin trong hai mẫu cao chiết nước từ nấm Nhộng trùng thảo và từ giá thể sau thu hoạch nấm
Stt Tên mẫu Hàm lượng cordycepin
(mg/g) Hàm lượng adenosin(mg/g)
1 Cao chiết nấm nhộng trùng
thảo 4,1450 2,3136
2 Cao chiết từ giá thể sau
Hình 3.15. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cao chiết nấm Nhộng trùng thảo
ình 3.16. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cao chiết giá thể sau thu hoạch Nhộng trùng thảo Kết quả thu được cho thấy vân tay sắc ký của mẫu chiết từ giá thể sau thu hoạch hoàn toàn giống với mẫu nấm Nhộng trùng thảo. Hàm lượng các nucleosid đặc trưng trong nấm Cordyceps là cordycepin và adenosin trong mẫu cao chiết từ giá thể sau thu hoạch tương ứng là 2,8135 và 2,0697mg/g, thấp hơn so với mẫu cao chiết từ nấm Nhộng trùng thảo nhưng vẫn là những số liệu rất có ý nghĩa.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. KẾT LUẬN
- Đã nghiên cứu khảo sát các điều kiện chiết xuất và xây dựng được quy trình chiết xuất hoạt chất từ giá thể sau thu hoạch nấm Nhộng trùng thảo với các điều kiện chiết như sau: Nguyên liệu xay mịn đến kích thước <1mm, chiết bằng nước ở 100oC, tỷ lệ nước/nguyên liệu cho 3 lần chiết là 9/1, 6/1, 4/1, thời gian chiết mỗi lần là 120 phút.
- Quy trình đã được áp dụng ổn định ở quy mô 100g nguyên liệu/mẻ. Hiệu suất chiết trung bình đạt 17,18% so với khối lượng nguyên liệu.
- Đã đánh giá hàm lượng cordycepin và adenosin trong sản phẩm chiết từ giá thể sau thu hoạch Nhộng trùng thảo tương ứng là 2,8135 và 2,0697mg/g.
4.2. ĐỀ XUẤT
- Tiếp tục nghiên cứu áp dụng quy trình chiết xuất đã xây dựng ở quy mô lớn hơn, tiến tới áp dụng tạo nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng để tận dụng khai thác