PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ MỤC LỤC MỤC LỤC .1 CHƯƠNG LÝ THUYẾT CƠ BẢN Định nghĩa: Nguyên lý hoạt động: .3 Thiết bị: 3.1 Nguồn cung cấp khí (Pha động): 3.2 Bộ phận tiêm mẫu: 3.3 (Cột sắc ký) Pha tĩnh: 3.3.1 Cột mao quản (open- tubular or cabillary column): 3.3.2 Cột nhồi (packed column): 10 3.4 Lò cột (buồng tiêm) 11 3.4.1 Kỹ thuật tiêm “on-column” 15 3.4.2 Tiêm chia/không chia 15 3.4.3 Hóa chương trình nhiệt độ (kỹ thuật PTV) 17 3.5 Đầu dò (Detector) 17 3.5.1 Đầu dò dẫn nhiệt (TCD): .17 3.5.2 Đầu dị ion hóa lửa (FID): 19 3.5.3 Đầu dò bẫy điện tử (ECD): 20 3.5.4 Đầu dò quang kế lửa (FPD): 22 3.5.5 Đầu dò Nitơ – Phospho (NPD): .23 3.5.6 Đầu dò khối phổ (MS), hay gọi GC-MS: 24 3.5.7 Một số loại khác: .27 3.6 Thiết bị nhận phân tích tín hiệu (ghi sắc ký đồ) .27 Chu trình mẫu: 27 Các đại lượng sắc ký khí 28 5.1 Thời gian lưu 28 5.2 Độ chọn lọc (α) .29 5.3 Độ phân giải cột (R) 30 5.4 Định lượng hiệu cột .30 5.4.1 Số đĩa lý thuyết n: 31 Một số dạng peak sắc ký khí 32 6.1 Dạng đối xứng 32 6.2 Dạng không đối xứng 32 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tách pic 32 Page 1/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ Các kỹ thuật lấy mẫu 33 8.1 Lấy mẫu headspace 33 8.2 Bẫy lọc 33 8.3 Giải hấp nhiệt 33 8.4 Nhiệt phân .33 Yêu cầu kỹ thuật 34 CHƯƠNG – XỬ LÝ DỮ LIỆU 35 CHƯƠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG SẮC KÝ KHÍ 38 Phân tích định tính .38 Phân tích định lượng 38 2.1 Phương pháp chuẩn hóa diện tích .39 2.2 Phương pháp tính theo hệ số hiệu chỉnh 39 2.3 Phương pháp lập đường chuẩn 39 2.4 Phương pháp dùng nội chuẩn 39 Page 2/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ CHƯƠNG LÝ THUYẾT CƠ BẢN Định nghĩa: Sắc ký khí loại sắc ký phổ biến sử dụng hóa học phân tích để tách phân tích hợp chất bị bay mà khơng bị phân hủy Các ứng dụng điển hình GC bao gồm kiểm tra độ tinh khiết chất cụ thể tách thành phần khác hỗn hợp Nguyên lý hoạt động: Sắc ký khí phương pháp tách dựa phân bố khác chất hai pha không trộn lẫn vào nhau, mẫu chứa chất cần phân tích “pha động”, thường dịng chảy dung mơi, di chuyển qua “pha tĩnh” chứa cột Sắc ký khí áp dụng để tách chất dẫn xuất chúng mà hóa nhiệt độ phân tích Sự lực khác chất cần phân tích pha tĩnh làm chúng di chuyển với vận tốc khác pha động hệ thống sắc ký Các hợp chất dạng khí cần phân tích tương tác với thành cột – phủ pha tĩnh, dẫn đến hợp chất tách thời điểm khác – Giống vận động viên chạy maratông Một cách lý tưởng, thành phần qua hệ thống khoảng thời gian riêng biệt gọi thời gian lưu hợp chất Khi chất hóa học cuối cột, phát xác định điện tử (detector) Phương pháp sắc ký khí dựa chế hấp phụ, phân bố loại theo kích thước (dùng rây phân tử) Hình 1: Mơ q trình tách chất pha tĩnh Page 3/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ Thiết bị: Hình Hệ thống máy sắc ký khí Gồm phần chính: 1) nguồn cung cấp khí kiểm sốt dịng khí 2) Buồng tiêm (bộ phận tiêm mẫu) 3) cột sắc ký 4) Lò cột (buồng cột, buồng ổn nhiệt) 5) Đầu dò (detertor phát hiện) 6) thiết bị nhận phân tích tín hiệu (ghi sắc ký đồ) 3.1 Nguồn cung cấp khí (Pha động): Khí mang tạo nên pha động hệ thống sắc ký khí Trong suốt trình sắc ký, phân tử hợp phần từ mẫu trao đổi liên tục pha tĩnh pha động Mỗi lần phân tử vào pha khí, chúng mang bị phía đầu dị dịng khí mang Bởi dịng khí mang biến số quan trọng để kiểm sốt thời gian lưu thành phần có mẫu thử, tồn phép phân tích thay đổi hồn tồn thời gian phân tích mẫu thử – dịng khí mang tăng gấp đơi thời gian lưu tất cấu tử cột ngắn gấp đôi (từ 10 phút  phút) ngược lại Khi xây dựng phương pháp sắc ký mới, người phân tích cần phải tối ưu dịng khí mang tương ứng với cột để đạt độ phân giải sắc ký tốt Tốc độ dịng khí mang cho độ phân giải tốt xác định thí nghiệm đơn giản theo đồ thị Van-Deeter Yêu cầu kỹ thuật Tất khí dùng phân tích sắc ký khí cần phải có độ tinh khiết cao phải bắt giữ loại bỏ mức vết nước, oxy hydrocarbon nhiễm bẩn khỏi khí trước vào thiết bị Oxy chất nhiễm bẩn quan trọng cần Page 4/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ phải loại bỏ gia tăng hủy hoại cột (phá hỏng cột) gây trục trặc với đầu dò nhạy đầu dò bắt giữ điện tử (ECD) đầu dị khối phổ (MSD) Các chất nhiễm bẩn loại bỏ cách cho dịng khí qua ống chất hấp phụ Người ta thường dùng chất hấp phụ có màu để người phân tích dễ dàng kiểm tra chất hấp phụ hết khả hấp phụ Khí cung cấp bình khí áp suất cao khơng giống HPLC, khơng có u cầu cho bơm để dễ dàng di chuyển pha động qua thiết bị Áp bình khí nén điều áp xác để đảm bảo áp suất không đổi đầu cột Bộ kiểm sốt dịng khối đảm bảo tốc độ dịng khí cài đặt ban đầu không đổi suốt trình phân tích khơng bị ảnh hưởng nhiệt độ lò cột Điều đảm bảo cho thời gian lưu lặp lại tốt Khuyến nghị: • Quy định khí dùng phân tích sắc ký khí trách nhiệm người sử dụng Luôn dùng khí mang có độ tinh khiết cao, thường 99.995% cao ý khuyến cáo kỹ thuật hãng sản xuất thiết bị nhà cung cấp khí • Tn theo hướng dẫn hãng sản xuất nhà cung cấp để lựa chọn hệ thống hiệu nhằm loại bỏ chất nhiễm bẩn từ khí • Kiểm tra thường xun đảm bảo thành phần bẫy khí sử dụng làm việc hiệu thay ống chất hấp phụ dùng để bẫy chất nhiễm bẩn cần thiết • Ngăn ngừa khơng khí vào dịng khí thiết bị cách kiểm tra rò rỉ tất cổ nối điểm nối hệ thống chuyển khí Điều khơng quan trọng cài đặt hệ thống thiết bị ban đầu mà ta thay cột đầu dị • Ln kiểm tra lượng khí dự trữ đủ cho thiết bị chạy qua đêm ngày nghỉ cuối tuần ngày lễ Pha động (hay pha chuyển động) thường khí trơ Heli khí khơng hoạt động Nitơ, Hydro, argon Page 5/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ Hình Bình khí nén máy sinh khí Nguồn cấp khí:  Bình khí nén: khí Ni tơ (pha động), Hydro khơng khí (duy trì lửa đầu dị FID) Nếu khơng sử dụng đầu dị FID khơng cần sử dụng đến bình Hydro khơng khí  Máy sinh khí (sinh loại khí cần sử dụng) yêu cầu mức độ tinh khiết cao (99,995%) Sinh khí Hydro (từ điện giải nước), Sinh khí Ni tơ (từ khơng khí), sinh khơng khí u cầu pha động:  Khơng tương tác với chất phân tích (chỉ có nhiệm vụ đem chất phân tích qua cột)  Thích hợp với đầu dị  Độ tinh khiết cao (ảnh hưởng tới kết sắc ký độ bền thiết bị) ≥ 99,995%  Phù hợp với detector  Rẻ  Cho hiệu cột tốt  Khơng có CO2, nước, oxy khí lạ khác (để chắn người ta lắp thiết bị lọc nước dung môi pha động trước pha động vào thiệt bị GC)  Lưu lượng khí: ổn định kiểm soát ( sử dụng van điều áp để chỉnh lưu lượng khí khỏi bình chứa) Lưu lượng khí thơng thường cột nhồi 75-100ml/phút, cột mao quản 1-50 ml/phút Page 6/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ Hình 4: Van điều áp, Thiết bị điều chỉnh lưu lượng khí, lọc khí (làm khí, bẫy khí, hấp phụ CO2, Oxy, Hydrocacbon, halogen, dẫn xuất, hấp thụ nước) Ảnh hưởng khí mang:  Khối lượng phân tử: Cao  Khuếch tán  Pic gọn Thấp  độ nhạy cao (đầu dò dẫn nhiệt TCD)  Độ nhớt khí mang: Tỷ lệ với độ giảm áp suất qua cột, thời gian phân tách, tốc độ khí mang 3.2 Bộ phận tiêm mẫu: Buồng tiêm gia nhiệt 100-300oC nên thành phần mẫu bay chuyển sang thể Khí mang trộn với phần mẫu thử mang mẫu vào cột Tiêm mẫu trực tiếp: Là kiểu tiêm mẫu thường dùng trừ có dẫn khác Có thể tiêm mẫu trực tiếp vào đầu cột bơm tiêm (syringe) dùng van tiêm mẫu đưa vào buồng hóa có gắn thêm chia dịng Tiêm pha hơi: Có thể thực hệ thống tiêm mẫu head-space tĩnh hay động Hệ thống tiêm mẫu head-space động (kỹ thuật bẫy làm sạch): Bao gồm thiết bị nhúng chìm vào dung dịch cho chất bay bám vào cột hấp phụ nhiệt độ thấp Các chất lưu giữ giải hấp phụ vào pha động cách làm nóng nhanh cột hấp phụ Page 7/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ Hệ thống tiêm mẫu head-space, tĩnh: Bao gồm buồng ổn nhiệt mẫu có kiểm sốt nhiệt độ đặt lọ đựng mẫu chứa mẫu rắn lỏng thời gian cố định thành phần bay đạt trạng thái cân pha pha lỏng rắn Sau đạt trạng thái cân bằng, lượng mẫu khí xác định trước đưa vào máy sắc ký khí 3.3 (Cột sắc ký) Pha tĩnh: Cột ống gồm lớp: lớp vỏ bảo vệ, ống xung silic pha tĩnh Cột đóng vai trị trực tiếp trình tách hợp chất Pha tĩnh chứa cột là: Cột mao quản làm silica nung chảy, pha tĩnh phủ thành cột Cột nhồi chứa hạt chất mang, trơ pha tĩnh lỏng, chứa pha tĩnh rắn Bảng 1: Một số pha tĩnh thường dùng (độ phân cực tăng dần) 10 11 12 Methylsylicone Methylphenyl (5%) silicone Methylphenyl (50%) silicone Methyltrifluoropropyl (50%) silicone Methylphenyl(25%) cyanopropyl (25%) silicone Poly (ethylene glycol), m>40000 Cyanopropyl (50%) phenyl silicone Poly (ethylene glycol) ester hóa với axit 2-nitroterephthalic Diethylene glycol succinate Cyanopropyl (100%) silicon Ethylen glycon succinate 1,2,3- tris(2-cyanoethoxy) propane Bảng Tính ứng dụng số cột pha tĩnh Pha tĩnh Tên thường dùng Squalane OV-1, SE-30 Tính phân cực Ứng dụng Khơng phân cực Không phân cực Poly(phenylmethyl dimethyl) siloxane (10% phenyl) Polyethylene glycol OV-3,SE-52 Hơi phân cực Carbowax Phân cực Poly(phenylmethyl dimethyl) siloxane (50% phenyl) Poly(dicyanoalkyldimethyl ) siloxane OV-17 Phân cực trung bình Các Hydrocarbon Hydrocarbon, nhân thơm, dược phẩm, steroid, PCB’s Axit béo ester hóa, alkaloid, dược phẩm, hợp chất halogen hóa Axit tự do, alcol, ether, tinh dầu, glycol Dược phẩm, steriod, thuốc bảo vệ thực vật, glycol OV-275 Phân cực cao Cycloparaffin Polydimethyl siloxane Axit béo chưa no nhiều nối đôi, axit tự do, alcol 3.3.1 Cột mao quản (open- tubular or cabillary column): - Có đường kính từ 0,1 mm đến 0,53 mm dải từ m đến 60 m Page 8/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ - Pha tĩnh phủ vào mặt cột bề dày từ 0,1 μm đến 5,0 μm gắn kết hóa học vào bề mặt bên - Thường làm từ tinh thể Silicat có độ tinh khiết cao - Nạp mẫu khó khăn - Tỷ lệ dịng pha động lên đến 15ml/phút - Cột mao quản chia làm loại chính: a) WCOT ( wall coated open tubular) Tại thành ống mao quản fused silica phủ trực tiếp lớp pha tĩnh Pha tĩnh thường lớp dạng sệt gần đặc nên dạng sắc ký lỏng- khí Nếu lớp pha tĩnh khơng gắn trực tiếp lên thành cột mà qua lớp trung gian cột SCOT (support coated open tubular) Bề dày lớp pha tĩnh định hệ số lưu giữ dung lượng mẫu cột Được chia làm loại: Cột ống hẹp: có đường kính từ 0,05-0,1mm thường dùng fast –GC Cột thông thường: có đường kính từ 0,18-0,32mm thường dùng phép phân tích thơng thường Cột ống rộng: Thường dùng với máy GC sử dụng cột nhồi lượng mẫu tốc độ dịng khí mang q lớn b) PLOT ( porous layer open tubular) Tại thành ống mao quản fused silica phủ lớp hạt xốp, đồng thời pha tĩnh Bề dày lớp xốp pha tĩnh khoảng 5-50μm Đây loại cột trung gian cột mao quản cột nhồi Thường dùng thay cột nhồi pha tĩnh giống hệt cột nhồi Bảng So sánh số đĩa lý thuyết đường kính cột Chiều dài cột nhồi 3m, cột mao quản 30m Properties Capacity (ng) He Flow (ml/min) Plate/m Total plates 0.18 10-20 0,3 5300 159000 Column ID (mm) 0.25 50-100 0,7 3300 99000 0.53 1000-2000 2,6 1600 48000 2-4 10000 10-60 2500 5000 Page 9/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ Hình Cột mao quản 3.3.2 Cột nhồi (packed column): - Làm thủy tinh hay kim loại (thép không rỉ), thông thường dài từ m đến m, đường kính từ mm đến mm - Nạp mẫu đơn giản - Độ xác cao - Các loại chất nhồi vào cột: Chất hập phụ (Alumina (Al2O3), Silica (SiO2), Zeolith, Cacbon, hợp chất cao phân tử), chất mang - Chịu tỷ lệ dịng từ 10-40ml/phút - Các hạt chất mang hình cầu trơ mặt hóa học nhồi vào cột Pha tĩnh tẩm lên bề mặt chất mang hay liên kết với bề mặt chất mang (khoảng 30% diện tích) - Pha tĩnh thường chất polymer xốp chất mang rắn phủ pha tĩnh lỏng Trong phân tích hợp chất phân cực cột nhồi với pha tĩnh có dung lượng thấp, tính phân cực thấp, chất mang phải trơ để tránh làm cho pic không đối xứng Hoạt tính chất mang giảm cách silan hóa trước phủ pha tĩnh lên Thường dùng diatomit nung, rửa với acid Các chất mang thường có kích thước hạt khác nhau, thường sử dụng hạt từ 150 μm đến 180 μm 125 μm đến 150 μm - Có hiệu tách thấp số đĩa lý thuyết thường nhỏ 8000, dùng thường xuyên cho mẫu có thành phần đơn giản Do chúng dễ sản xuất không chọn lựa pha tĩnh lớn - Nếu cột dài gây áp suất đầu cột lớn, cột dài dẫn đến số đĩa lý thuyết thấp - Hiện có số loại cột nhồi có đường kính nhỏ ( nhỏ 1mm) cho phép nâng cao chiều dài cột lên vài chục mét Thường dùng cho số ứng dụng đặc biệt mà cột mao quản không đáp ứng Page 10/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ c) Dải động học thấp FID Ví dụ vài đầu dị bẫy ion có dải động học thấp FID đến lần Tuy nhiên, người phân tích phân tích khoảng nồng độ rộng dùng ion để định lượng có độ nhạy khác d) Dùng đầu dị khối phổ xác định trọng lượng phân tử hợp chất Đây ưu điểm quan trọng đầu dò khối phổ đặc biệt lĩnh vực định danh cấu trúc hợp chất e) Một hợp chất định danh từ phổ khối 3.5.7 Một số loại khác: Đầu dị quang hóa ion (PID), Đầu dị ion hóa phóng xung (PDD), Đầu dị ion hóa nhiệt (TID), Đầu dị cực tím chân khơng (VUV), Đầu dị hồng ngoại (IRD), Đầu dị ion hóa Heli (HID), Đầu dị độ dẫn điện phân (ELCD) Đầu dò phát xạ nguyên tử (AED), Đầu dò đốt xúc tác (CCD), Đầu dị phóng ion (DID), Đầu dị độ dẫn điện phân khô (DELCD) 3.6 Thiết bị nhận phân tích tín hiệu (ghi sắc ký đồ) - Thiết bị ghi đo: Tại đây, tín hiệu tương ứng đầu dò ghi đo chuyển vào máy tính để tính tốn cho sắc ký đồ lưu trữ liệu - Sắc ký đồ dạng đồ thị gồm trục, trục hoành biểu diễn thời gian lưu hợp chất, trục tung biểu diễn tín hiệu tương ứng đầu dò Khi lý tưởng, mũi ứng sắc ký đồ tương ứng với hợp chất khỏi cột Chu trình mẫu: Sau thiết bị ổn đinh sẵn sàng để tiêm mẫu tiến hành tiêm Mẫu đưa vào buồng tiêm dạng (nếu sử dụng headspace), dạng lỏng sử dụng Autosampler Ở buồng tiêm mẫu gia nhiệt nhiệt độ cao để đảm bảo tất chuyển dạng hơi, sau trộn với pha động đưa vào cột sắc ký pha động Tại bắt đầu xác trình tách chất khác lực ( lực liên kết chất phân tích với pha tĩnh lức liên kết chất phân tích với pha động) chu trình tăng nhiệt lị cột cài đặt theo tưng phương pháp khác Chất phân tích tách khỏi khỏi cột tiếp tục vào detector bắt đầu tương tác với detector để sinh tín hiệu (ví dụ sử dụng detector FID ion hóa lửa sinh tín hiệu, detector TCD thay đổi dịng điện sinh tín hiệu ) Tín hiệu phần mềm cài đặt máy tính để nhận dạng vẽ sắc ký đồ Tất thông số xuất phần mềm, tiến hành xử lý số liệu cho kết cần phân tích Page 27/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ Hình 17 Quá trình tách sắc ký cột chất A B Các đại lượng sắc ký khí 5.1 Thời gian lưu Thời gian lưu phụ thuộc vào cột, nhiệt độ cột vận tốc tuyến tính khí mang Do GC ln có thay đổi nhỏ nên thời gian lưu có khuynh hướng trơi giạt theo thời gian từ lần chạy đến lần chạy khác Cần ý cột cũ thời gian lưu hợp chất tương ứng cột ngày ngắn lại theo thời gian sử dụng Các hợp chất vào cột chúng pha động (khí mang) Do nhiệt độ cột vận tốc tuyến tính khí mang cố định, hợp chất tốn thời gian pha động Thời gian pha động xác định cách tiêm hợp chất không bị lưu lại vào hệ thống sắc ký khí đo thời gian lưu Thời gian lưu gọi thời gian chết cột biểu thị tM to Bởi hợp chất tiêu tốn thời gian pha động, khác thời gian lưu khác thời gian tiêu tốn pha tĩnh - Thời gian lưu tuyệt đối tR: Thời gian tính từ lúc bơm mẫu đến chất (xuất đỉnh peak chất) - Thời gian chết tM: thời gian chất hoàn tồn khơng tương tác với cột tách (khơng bị lưu giữ) qua cột ( chất: methanol, agron ) thường sử dụng tùy đầu dò Còn gọi thời gian lưu giữ pha động - Thời gian lưu thực tR’: thời gian chất lưu giữ pha tĩnh: t’R = tR – tM Page 28/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ Hình 18: Thời gian lưu chất phân tích Nếu lấy thời gian lưu hợp chất (mũi) trừ thời gian chết cột (tM) ta có thời gian tiêu tốn thật hợp chất pha tĩnh, giá trị gọi thời gian lưu hiệu chỉnh (tR) hay thời gian lưu chất tan Chất tan nằm pha tĩnh lâu dễ tách khỏi cấu tử có độ bay Trong sắc ký khí, hệ số lưu thay đổi cách thay đổi pha tĩnh nhiệt độ cột 5.2 Độ chọn lọc (α) Hệ số chọn lọc (α) cho cấu tử cho biết mức độ chúng tách cột Hình 19 - Hệ số chọn lọc Phương trình: α = (tR)B - tM / (tR)A - tM Trong đó: (tR)B : thời gian lưu cấu tử B lưu giữ mạnh (tR)A : thời gian lưu cấu tử A lưu giữ tM : thời gian chết • Khi α = 1, mặt lý thuyết hai cấu tử tách rời cột thử Khi α > 1, mặt lý thuyết hai cấu tử tách hồn tồn điều cịn phụ thuộc vào độ phân giải độ hồn hảo cột Page 29/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ 5.3 Độ phân giải cột (R) Độ phân giải (R) cột thước đo định lượng khả cột tách hai cấu tử khỏi hỗn hợp Hình 20 - Độ phân giải cột Phương trình: R = ×[(tR)B – (tR)A] / WA+ WB Trong đó: (tR)B: thời gian lưu cấu tử B lưu giữ mạnh (tR)A: thời gian lưu cấu tử A lưu giữ WA: bề rộng mũi cấu tử A đường (bề rộng đáy A) WB: bề rộng mũi cấu tử B đường (bề rộng đáy B) • Nếu R< 1, mũi trùng trập lên • Nếu R ≥ 1, mũi tách khỏi Thực tế phải có R ≥ 1,5 để hai mũi tách hoàn toàn Ngoài ra, độ phân giải thường biểu diễn dạng phần trăm Hai mũi tách hoàn tồn khí % độ phân giải 100 Khi %R nhỏ 100 mũi trùng chập lên 5.4 Định lượng hiệu cột Trong hình 18, 19 20, mũi phóng minh họa cấu tử khỏi cột dải chất Điều xuất phân tử cấu tử có đường phân tán qua pha khí pha lỏng Do phân tử giải hấp khỏi cột thời gian lưu khác Hiệu ứng không bị ảnh hưởng tương tác hóa học cấu tử pha tĩnh mà phụ thuộc nhiều vào kích cỡ cột chiều dài cột, đường kính cỡ hạt bề dày lớp phim pha tĩnh Hiệu ứng bành rộng mũi tăng tỷ lệ với thời gian cấu tử nằm cột, điều giải thích sắc ký đồ mũi giải hấp sau bị bành rộng thấp mũi khỏi cột trước Từ nhận xét ta thấy rõ khả cột để tách cấu tử có giải hấp liên quan đến mũi cấu tử bành rộng qua Page 30/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ cột (đây hiệu cột) Các nhà phân tích dùng mơ hình đĩa sắc ký để đo hiệu cột; số đĩa lý thuyết lớn hiệu cột cao Hình 21 - Biểu diễn cột dãy đĩa lý thuyết Điều so sánh trình sắc ký với chưng cất định lượng hiệu cột theo số đĩa lý thuyết Bằng cách so sánh này, dễ dàng hiểu kỹ thuật sắc ký khí nhiều so với kỹ thuật sắc ký khác Hình 21 minh họa cột dãy đĩa lý thuyết Ví dụ điều kiện thiết lập trước, cấu tử hydrocabon dầu giải hấp khỏi cột sắc ký theo thứ tự điểm sôi (nhiệt độ sôi) chúng - cấu tử khỏi cột sắc ký nhiệt độ cột gia tăng tương tự trình cột chưng cất 5.4.1 Số đĩa lý thuyết n: Hình 22 - Minh họa phép đo hiệu cột n= 16(tR/wb)2 = 5,545(tR/wh)2 tR:thời gian lưu tuyệt đối wb, wh: độ rộng peak đo chân đường nửa chiều cao peak Page 31/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ Hình 23: chiều rộng chân pic chiều rộng pic Trong thực tế, tùy vào mục đích cần phân tích mà ta dùng cột có chiều dài (L) khác người ta thường biểu diễn hiệu cột số đĩa lý thuyết mét Hiệu tách biểu thị theo số đĩa lý thuyết/ 1m chiều dài cột (n/L) Được biểu diễn qua chiều cao đĩa lý thuyết (Hetp) h= L/n (mm) Chú ý: Giá trị HETP cực tiểu hiệu cột đạt tốt Giá trị n HETP thay đổi theo thời gian cột cũ hiệu (điều giải thích thời gian lưu hợp chất cột sắc ký có khuynh hướng giảm dần theo thời gian cột sử dụng) Nhà phân tích dùng tham số thước đo định lượng để xác định cột khơng cịn “phù hợp với mục đích” cần phải thay Một số dạng peak sắc ký khí 6.1 Dạng đối xứng - Peak đối xứng theo hàm phân bố GAUS Thường diễn trình phân bố chất hai pha động tĩnh xảy nhanh, không phụ thuộc vào nhiệt độ - Nếu lượng mẫu tiêm vào vượt dung lượng cho phép cột thời gian lưu khơng phụ thuộc vào lượng mẫu tiêm vào - Độ đối xứng thường biểu diễn qua hệ số đối xứng 6.2 Dạng không đối xứng Gồm dạng: TAILING (kéo đuôi) LEADING (FRONTING – ngược lại với tailing) - Khi nộng độ chất phân tích q lớn (thường xảy TAILING) - Có hấp phụ chất phân tích mạnh pha tĩnh (cả 2) - Thời gian lưu thay đổi tùy lượng mẫu tiêm Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tách pic - Bản chất mẫu: Mẫu có chứa thành phần phức tạp, việc phá mẫu chưa hồn tồn ảnh hưởng đến q trình tách pic Page 32/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ - Bản chất pha tĩnh: Khi mẫu có chứa nhiều chất liên kết với pha tĩnh với lực giống giẫn đến việc chồng pic dính pic, phải tiến hành thay đổi pha tĩnh - Nhiệt độ lò cột: Nhiệt độ lò cột ảnh hướng lớn đến trình tách pic, nhiệt độ cao thơi gian xuất pic nhanh (thời gian lưu ngắn) Các kỹ thuật lấy mẫu 8.1 Lấy mẫu headspace Khi mẫu lỏng mẫu rắn để lọ đậy kín tạo thành cân cấu tử dễ bay mẫu khoảng không gian phía vật chất Trong phương pháp headspace tĩnh, mẫu nhỏ lấy phía mẫu kim tiêm sắc ký chúng tiêm trực tiếp vào cột sắc ký khí Kỹ thuật nhanh đơn giản mẫu khơng kèm theo nhiễu dễ để thực Khuyết điểm lớn kỹ thuật nồng độ mẫu thấp, chẳng hạn với chất cần phân tích bay phương pháp khơng nhạy Trường hợp cải tiến cách dùng phương pháp headspace động, ví dụ kỹ thuật bẫy lọc (pruge and trap) 8.2 Bẫy lọc Trong hệ thống bẫy lọc, dịng khí trơ dùng để đẩy cấu tử khỏi mẫu lỏng Các cấu tử bẫy làm giàu bẫy hấp phụ, nước qua bẫy khơng bị ảnh hưởng Sau đó, bẫy giải hấp nhiệt cấu tử mang vào cột dịng khí mang Vì nước loại bỏ tồn q trình này, mẫu làm giàu kỹ thuật cho phép phát mức phần tỷ (ppb) cấu tử dễ bay mẫu nước 8.3 Giải hấp nhiệt Trong kỹ thuật này, vết chất nhiễm bẩn khơng khí bẫy ống hấp phụ Sau ống giải hấp nhiệt vào dịng khí mang heli qua cột Để tập trung mẫu, thường dùng bẫy lạnh thể tích thấp trước phân tích sắc ký khí, tức giải hấp giai đoạn Bởi bẫy khơng hấp phụ khí vĩnh cửu (ví dụ nitơ, oxy, ) mẫu ban đầu, phương pháp bị ảnh hưởng trực tiếp nồng độ chất cần phân tích có khả áp dụng để phát nồng độ vết chất nhiễm bẩn khơng khí 8.4 Nhiệt phân Nhiều phân tử lớn, đặc biệt polymer, khơng thể phân tích trực tiếp sắc ký khí độ bốc chúng thấp Trong phương pháp nhiệt phân, lượng nhiệt dùng để phân hủy vật liệu thành các mảnh đơn giản hơn, trọng lượng phân tử thấp để Page 33/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ chúng phân tích sắc ký khí Một số nguồn nhiệt khác sử dụng “ribbon-type”, “điểm curie” “bộ nhiệt phân la-de” Kỹ thuật không phù hợp việc định danh xác định thành phần ban đầu polymer mà cung cấp thông tin rõ ràng độ bền nhiệt trình phân hủy nhiệt liên quan tới vật liệu Yêu cầu kỹ thuật Người phân tích nên tuân theo sổ tay hướng dẫn nhà sản xuất để quen thuộc với đặc tính buồng tiêm Phân tích chuẩn kiểm tra bất thường mũi bị biến dạng để biết buồng tiêm hoạt động ổn định hay khơng xác • Mũi bị chẻ biến dạng dấu hiệu cho biết lượng mẫu tiêm lớn Lúc nên chọn chế độ chia dịng phù hợp giảm thể tích tiêm mẫu • Nhiệt độ buồng tiêm q thấp làm cho mũi kéo • Nhiệt độ buồng tiêm cao làm biến đổi cấu tử phân tích • Mũi bành rộng đầu sắc ký đồ dấu hiệu chất tan không tập trung chặt thành dải kỹ thuật tiêm lấy mẫu Kiểm tra tham số kèm với kỹ thuật tối ưu cài đặt xác • Nhiễm bẩn buồng tiêm tạo ảnh hưởng mạnh – mũi tạp sắc đồ Làm thay liner (ống thủy tinh sylan hóa khơng cịn tâm hoạt tính) buồng tiêm thường xun Page 34/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ CHƯƠNG – XỬ LÝ DỮ LIỆU Khả xử lý liệu thiết bị đại cách mạng hóa với phát triển mạnh chuyên sâu và/hoặc kết mạng hệ thống máy tính (PCs) Hiện nay, hệ thống thực hiện, xử lý báo cáo liệu cách tự động theo cài đặt người phân tích, lưu giữ phương pháp GC bảng tập tin tiêm mẫu tự động Sơ đồ hình 24 cho thấy bước trình xử lý liệu: Hình 24 - Sơ đồ hệ thống xử lý liệu Tín hiệu tương tự từ đầu dị chuyển thành tín hiệu số biến đổi AD tín hiệu số tương đương sắc đồ lưu tập tin liệu thơ Người phân tích nhập thơng tin cho đợt phân tích kích thước mẫu; hệ số pha lỗng; nồng độ chuẩn tham số xử lý liệu vào máy tính Phần mềm xử lý nhận danh mũi cấu tử xác định diện tích chiều cao mũi Thông tin từ mẫu chuẩn dùng để tính nồng độ chất cần phân tích kết báo cáo định dạng phù hợp Ví dụ (hình 21) cho thấy tầm quan trọng việc dùng tham số xử lý liệu phù hợp nhất: Page 35/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ Hình 25- Các phương pháp tính tích phân diện tích Trong sắc đồ hình 21, phần diện tích tơ đậm mũi chất cần phân tích phần diện tích không tô đậm nhiễu Rõ ràng phương pháp lấy tích phân khác cho diện tích mũi khác nồng độ chất cần phân tích khác mẫu Tuy nhiên, phần mềm xử lý tinh vi, diện tích mũi phóng to lên ln dựa vào giả định tốn học phép tính gần mà đưa sai số vào kết cuối Người phân tích cần phải làm quen với việc sử dụng phần mềm xử lý liệu phần cứng để đảm bảo kết tính xác báo cáo đáp ứng yêu cầu phòng thử nghiệm khách hàng Với phần mềm cập nhật nhất, có nhật ký liệu theo dõi tham số dụng cụ quan trọng đợt phân tích ghi lại thay đổi mà người phân tích đưa vào phương pháp Nếu phần mềm khơng có nhật ký này, người phân tích nên lưu lại thơng tin vào sổ cơng tác nhật ký thiết bị Các chuẩn hiệu chuẩn thiết bị, sắc đồ, liệu trung gian báo cáo cuối nên in để lưu lại thông tin lưu giữ điện tử Khuyến nghị • Các phép tính dựa diện tích mũi thường xác cách tính theo chiều cao cho phép thay đổi thời gian lưu hình dạng mũi • Người phân tích nên cố gắng để có độ phân giải sắc ký tốt không nên ỷ lại vào phần mềm xử lý liệu để xác định diện tích mũi cấu tử khơng tách rời • Kiểm tra phép tính để xác định nồng độ chất cần phân tích mẫu cách dùng máy tính bỏ túi bảng tính máy tính (ví dụ excell) Page 36/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ • Kiểm tra xem kết từ phần mềm xử lý liệu có phù hợp với giá trị trước không (tức không bị khác biệt) Dùng tập tin liệu kết đạt liệu QC làm rõ ràng mục đích • Ghi lại thay đổi tham số xử lý liệu lưu trữ phiên ban đầu phần mềm Page 37/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ CHƯƠNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG SẮC KÝ KHÍ Phân tích định tính Một pic nhận diện cách so sánh phổ chúng với thư viện phổ lưu máy tính Có nghĩa nhận diện thời gian lưu chất mẫu biết trước ( mẫu chuẩn) cột có độ phân cực khác Nếu chất cần dị tìm trùng với chất có mẫu chuẩn pic chất mẫu thêm có diện tích hay chiều cao tăng lên so với chưa thêm chất chưa biết vào Sự nhận diện mang tính chất thăm dò thực cột, khẳng định thực vài cột loại pha tĩnh khác Cần ý có chất khác thời gian lưu giống gần Vì cần thực nhiều pha tĩnh khác sử dụng detecter khối phổ hồng ngoại để xác định Hình 26: phân tích định tính cách so sánh thời gian lưu với mẫu chuẩn Phân tích định lượng Các phương pháp tính tốn định lượng Page 38/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ 2.1 Phương pháp chuẩn hóa diện tích Đây phương pháp tính thành phần phần trăm mẫu cách đo diện tích pic sắc ký đồ Đem diện tích pic chất cần quan tâm A chia cho tổng diện tích pic %A = Khi phân tích thành phần có điểm sơi đồng đẳng, phương pháp dùng để tính tỷ lệ phần trăm khối lượng Phương pháp tất cấu tử rửa giải đáp ứng detecter cấu tử giống Nếu điều kiện thỏa mãn phương pháp nhanh hiệu 2.2 Phương pháp tính theo hệ số hiệu chỉnh Detecter đáp ứng khác chất khác Vì cần phải tính hệ số hiệu chỉnh Nhờ hệ số tính thành phần phần trăm cấu tử mẫu %A = Cách xác định hệ số hiệu chỉnh - Tiêm dung dịch chuẩn biết nồng độ cấu tử A,B,C vào GC - Sắc kí đồ thu dược có pic phân giải hồn tồn diện tích thu tương ứng SA,SB,SC tương ứng với khối lượng mẫu mA, mB, mC - Chọn pic làm chuẩn Ví dụ A có tỷ lệ SA/mA gán giá trị FA = - Từ tỷ lệ SB/mB, SC/mC suy FB, FC 2.3 Phương pháp lập đường chuẩn - Lập đường chuẩn riêng rẽ cấu tử hỗn hợp cách tiêm thể tích loạt dung dịch hỗn hợp chất chuẩn có nồng độ khác Như loạt nồng độ chất chuẩn phân tích nồng độ chúng xác định Một đường chuẩn lập cho cấu tử với trục nồng độ trục diện tích tương ứng để kiểm tra tuyến tính đáp ứng detetor Tiêm thể tích mẫu có cấu tử cần phân tích chạy sắc kí điệu kiện chạy chuẩn Từ diện tích thu cấu tử cần phân tích đường chuẩn vừa thiết lập suy nồng độ chúng 2.4 Phương pháp dùng nội chuẩn - Phương pháp gọi phương pháp chuẩn hóa hay gián tiếp - Để định lượng cấu tử X ta cần chọn chất chuẩn S cho: Page 39/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ Nếu trộn X với S ta thu đỉnh riêng biệt sắc ký đồ Pic X S gần Sau ta phải pha hỗn hợp có tỷ lệ trọng lượng X S biết trước, chạy sắc ký, đo diện tích pic, lập tỷ số diện tích tương ứng cuối lập đường chuẩn tương đối SC/SS: Là tỷ lệ diện tích cặp cấu tử cần xác định X chất chuẩn nội WC/WS :Là tỷ lệ trọng lượng cặp cấu tử cần xác định X chất chuẩn nội -Khi phân tích mẫu thật Ta cho lượng chất nội chuẩn S vào mẫu tiến hành sắc ký hỗn hợp Từ tỷ lệ diện tích đo được, đường chuẩn tương đối vừa dựng ta có tỷ lệ trọng lượng Với trọng lượng chuẩn S thêm vào biết ta tính trọng lượng chất X - Ưu điểm phương pháp này: Không cần biết đên đáp ứng detector Khơng cần trì nghiêm ngặt điều kiện tiến hành sắc ký thay đổi loại trừ theo cách tính tỷ số Page 40/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ Tài liệu tham khảo Dược điển việt nam V https://www.slideshare.net/nguyenson719/dai-cuong-vegc?next_slideshow=1 https://issuu.com/daykemquynhon/docs/cktskthhpthdnsvhth 4.https://www.academia.edu/11327956/Ch%C6%B0%C6%A1ng_1_C%C6%A0_S%E1%BB %9E_L%C3%8D_THUY%E1%BA%BET_CHUNG_V%E1%BB%80_T%C3%81CH_S %E1%BA%AEC_K%C3%9D_1.1._Gi%E1%BB%9Bi_thi%E1%BB%87u_ph %C6%B0%C6%A1ng_ph%C3%A1p https://www.slideshare.net/trannhattan12/sac-ki Page 41/41 ... Phương pháp lập đường chuẩn 39 2.4 Phương pháp dùng nội chuẩn 39 Page 2/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ CHƯƠNG LÝ THUYẾT CƠ BẢN Định nghĩa: Sắc ký khí loại sắc. .. động) thường khí trơ Heli khí khơng hoạt động Nitơ, Hydro, argon Page 5/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ Hình Bình khí nén máy sinh khí Nguồn cấp khí:  Bình khí nén: khí Ni tơ (pha... Các phương pháp tính tốn định lượng Page 38/41 ♣♣♣TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ♣♣♣ 2.1 Phương pháp chuẩn hóa diện tích Đây phương pháp tính thành phần phần trăm mẫu cách đo diện tích pic sắc