Đề cương khóa luận: Nghiên cứu sản xuất sinh khối vi sinh vật để tăng hàm lượng protein cho sắn

Xác định được các điều kiện thích hợp cho nấm men phát triển sinh khối như: tỷ lệ các nhóm vi sinh vật, tỷ lệ giống cấy, độ ẩm, pH, thời gian nuôi cấy,…môi trường nuôi cấy.

PHẦN THỨ NHẤT MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Sắn( khoai mì) loại lương thực quan trọng thứ nông nghiệp giới sau lúa gạo lúa mì Tại châu Phi, châu Á Mỹ Latinh, hàng triệu người sử dụng sắn nguồn lương thực chủ yếu nhằm đảm bảo an ninh lương thực Đồng thời, sắn thức ăn gia súc, nhiên liệu sinh học, hàng hóa xuất quan trọng giới Việt Nam Củ sắn giàu chất bột, lượng, khoáng, vitamin C, hạt bột sắn nhỏ mịn, độ dính cao Tuy nhiên, sắn lại nghèo chất béo nghèo protein Trong đó, thể người động vật thường xuyên đòi hỏi cung cấp chất dinh dưỡng protein có thức ăn để tiến hành trao đổi chất nhằm trì sống, tăng cường sinh trưởng phát triển Trong trình tiêu hóa người động vật, protein phân giải thành khoảng 20 axit amin thành phần, có axit amin khơng thay cần phải có sẵn thức ăn Nếu không nhận axit amin thể bị bệnh chết Chính vậy, để sử dụng sản phẩm làm từ sắn cần bổ sung thêm lượng protein nhằm cung cấp đầy đủ hàm lượng chất dinh dưỡng cho người động vật sản xuất protein đơn bào (từ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi, tảo) hướng nghiên cứu mạnh mẽ để giải vấn đề thiếu hụt protein tốc độ phát triển dân số q nhanh nên nguồn protein đa bào khơng cịn đủ để cung cấp cho nhu cầu ngày tăng người Trong tế bào vi sinh vật, nấm men, nấm sợi, tảo hàm lượng protein tương đối lớn cịn có chất béo, vitamin chất khống Bên cạnh đó, suất vi sinh vật, nấm tảo vượt xa suất trồng vật nuôi công nghiệp nhiều lần Từ thực trạng, nhu cầu sử dụng protein nhu cầu sản xuất protein đơn bào, thực đề tài “Nghiên cứu sản xuất sinh khối vi sinh vật để tăng hàm lượng protein cho sắn” 1.2 Mục đích – yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích Sản xuất sinh khối vi sinh vật để tăng hàm lượng protein cho sắn 1.2.2 Yêu cầu Xác định điều kiện thích hợp cho nấm men phát triển sinh khối như: tỷ lệ nhóm vi sinh vật, tỷ lệ giống cấy, độ ẩm, pH, thời gian nuôi cấy,…môi trường nuôi cấy - - Xác định nhóm vi sinh vật (nấm mốc nấm men) thích hợp để ni sinh khối môi trường sắn lát Xác định tỷ lệ giống cấy nấm mốc nấm men thích hợp Xác định độ ẩm môi trường nuôi cấy (sắn lát) Xác định nguồn Nitơ hàm lượng Nitơ bổ sung Xác định nguồn Photpho thích hợp Xác định độ pH thích hợp Xác định độ dày môi trường nuôi cấy (sắn lát) Xác định thời gian nuôi cấy phù hợp PHẦN THỨ HAI TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung sắn 2.1.1 Nguồn gốc, phân loại, vùng phân bố, lịch sử phát triển (Kỹ thuật trồng sắn;KS Nguyễn đức cường; nhà xuất khoa học tự nhiên công nghệ) 2.1.1.1 Tên gọi, mô tả, phân loại Sắn (Manihot esclenta Crantz, tên khác: khoai mì, cassava, tapioca, yuca, mandioca, manioc,…) lương thực ăn củ hàng năm, sống lâu năm, thuộc họ thầu dầu Euphorbiaceae Cây sắn cao – 3m, đường kính tán 50 – 100cm Lá khía thành nhiều thuỳ, dùng để làm thức ăn chăn nuôi gia súc Rễ ngang phát triển thành củ tích luỹ tinh bột Củ sắn dài 20 - 50cm, luộc chín có màu trắng đục, hàm lượng tinh bột cao Sắn luộc chín có vị dẻo, thơm đặc trưng Sắn có thời gian sinh trưởng thay đổi từ đến 12 tháng, có nơi tới 18 tháng, tùy thuộc giống, vụ trồng, địa bàn trồng mục đích sử dụng Phân loại khoa học (Scientific classification) Giới (kingdom): Plantae Ngành (division): Magnoliophyta Lớp (class): Magnoliopsida Bộ (ordo): Malpighiales Họ (family): Euphorbiaceae Họ phụ (subfamily): Crotonoideae Nhóm (tribe): Manihoteae Chi (genus): Manihot Lồi (species): M esculenta 2.1.1.2 Nguồn gốc Cây sắn có nguồn gốc vùng nhiệt đới châu Mỹ La tinh (Crantz, 1976) trồng cách khoảng 5.000 năm (CIAT, 1993) Trung tâm phát sinh sắn giả thiết vùng đông bắc nước Brazin thuộc lưu vực sông Amazon, nơi có nhiều chủng loại sắn trồng hoang dại (De Candolle 1886; Rogers, 1965) Trung tâm phân hóa phụ Mexico Trung Mỹ vùng ven biển phía bắc Nam Mỹ Bằng chứng nguồn gốc sắn trồng di tích khảo cổ Venezuela niên đại 2.700 năm trước Công nguyên, di vật thể củ sắn ven biển Peru khoảng 2000 năm trước Cơng ngun, lị nướng bánh sắn phức hệ Malabo phía Bắc Colombia niên đại khoảng 1.200 năm trước Công nguyên, hạt tinh bột phân hóa thạch phát Mexico có tuổi từ năm 900 đến năm 200 trước Cơng nguyên (Rogers 1963, 1965) 2.1.1.3 Vùng phân bố Hiện tại, sắn trồng 100 nước vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, tập trung nhiều châu Phi, châu Á Nam Mỹ, nguồn thực phẩm 500 triệu người (CIAT, 1993) Tại Việt Nam, sắn trồng hầu hết tỉnh từ Bắc đến Nam, nhiều vùng Đông Nam Bộ Tây Nguyên 2.1.1.4 Lịch sử phát triển Cây sắn người Bồ Đào Nha đưa đến Congo châu Phi vào kỷ 16 Tài liệu nói tới sắn vùng Barre Thevet viết năm 1558 Ở châu Á, sắn du nhập vào Ấn Độ khoảng kỷ 17 (P.G Rajendran et al, 1995) SriLanka đầu kỹ 18 (W.M.S.M Bandara M Sikurajapathy, 1992) Sau đó, sắn trồng Trung Quốc, Myamar nước châu Á khác cuối kỷ 18, đầu kỷ 19 (Fang Baiping 1992 U Thun Than 1992) Cây sắn đựơc du nhập vào Việt Nam khoảng kỷ 18 (Phạm Văn Biên, Hoàng Kim, 1991) Hiện chưa có tài liệu chắn nơi trồng năm trồng Sắn canh tác phổ biến hầu hết tỉnh Việt Nam từ Bắc đến Nam Diện tích sắn trồng nhiều vùng Đơng Nam Bộ, vùng Tây Nguyên, vùng núi trung du phía bắc, vùng ven biển nam Trung Bộ vùng ven biển bắc Trung Bộ 2.1.2 Tình hình sản xuất chế biến sắn Việt Nam giới 2.1.2.1 Tình hình sản xuất chế biến sắn giới Sắn loại lương thực quan trọng nước nhiệt đới Brazil, Nigeria, Thái Lan, Indonexia, Việt Nam…Củ sắn chứa nhiều tinh bột, nước trồng sắn giới phần lớn sắn sử dụng làm thức ăn người thức ăn chăn nuôi gia súc, lượng nhỏ dử dụng lĩnh vực công nghiệp chế biến Trong năm 2006, sản lượng sắn giới đạt 211,26 triệu sắn củ tươi đến năm 2007 sản lượng sắn giới đạt 226,34 triệu (tăng 15,08 triệu tấn) Khi phân chia sản lượng sắn theo lục địa, tổ chức lương thực giới (FAO) ước tính sản lượng sắn Châu Phi năm 2000 92,7 triệu Khu vực Châu Mỹ la tinh vùng Caribe: theo ước tính sản lượng sắn vùng chiếm 20% sản lượng sắn toàn cầu (năm 2000 sản lượng sắn toàn khu vực đạt 32,1 triệu Brazil nước đóng góp 70% sản lượng tồn khu vực) Nước có sản lượng sắn lớn giới Nigeria 45,72 triệu tấn, Thái Lan với 22,58 triệu tấn, Indonexia 19,92 triệu Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO) xếp sắn lương thực quan trọng nước phát triển sau lúa gạo, ngô lúa mì Tinh bột sắn thành phần quan trọng chế độ ăn tỷ người thuộc nước giới thứ (www TTTA Food market, 2009) Đồng thời, sắn thành phần nguyên liệu quan trọng thức ăn chăn nuôi nhiều nước giới hàng hóa xuất có giá trị để chế biến bột ngọt, bánh kẹo, mì ăn liền, ván ép, bao bì, màng phủ sinh học phụ gia dược phẩm Đặc biệt, sắn ngun liệu cho cơng nghiệp chế biến nhiên liệu sinh học (ethanol) số quốc gia châu Á Từ 2008, sản lượng sản xuất ethanol Trung Quốc đạt triệu tiếp tục tăng lên Trung Quốc trở thành nước nhập nguyên liệu sắn để sản xuất ethanol từ quốc gia lân cận Thái Lan, Việt Nam, Campuchia Indonesia Tại Thái Lan Việt Nam, nhiều nhà máy sản xuất ethanol sử dụng sắn xây dựng giai đoạn từ 2008-2012 Indonesia, Philippine lên kế hoạch sử dụng sắn sản xuất ethanol để pha vào xăng theo tỷ lệ bắt buộc 5% năm 2010 Các nước Lào, Papua New Guinea, đảo quốc Fiji, Nigeria, Colombia Uganda nghiên cứu thử nghiệm cho sản xuất ethanol (TTTA Outlook 2009) Diện tích, suất sản lượng sắn giới có chiều hướng gia tăng từ năm 2000 đến (xem Bảng 1) Năm 2012, sản lượng sắn giới đạt 269,12 triệu củ tươi, tăng 51% so với năm 2000 Diện tích trồng sắn thời gian tăng 20% Nước sản xuất sắn nhiều Nigeria (54 triệu tấn), Thái Lan (29,94 triệu tấn) Indonesia (24,17 triệu tấn) Nước có suất sắn cao Ấn Độ (31,43 tấn/ha), Thái Lan (21,09 tấn/ha), so với suất sắn bình quân giới 12,92 tấn/ha (FAO, 2012) Việt Nam đứng thứ sản lượng sắn giới với 9,74 triệu năm 2012 Bảng Diện tích, suất sản lượng sắn giới từ 2000 – 2012 Năm Diện tích Năng suất (triệu ha) (tấn/ha) 2000 16,86 10,70 2001 17,17 10,73 2002 17,31 10,61 2003 17,59 10,79 2004 18,51 10,94 2005 18,69 10,87 2006 20,50 10,90 2007 18,39 11,94 2008 21,94 12,22 2009 19,32 12,29 2010 19,55 12,43 2011 20,46 12,79 2012 20,82 12,92 Nguồn: Tổng hợp từ FAOSTAT Sản lượng (triệu tấn) 177,89 184,36 183,82 189,99 202,64 203,34 223,20 227,79 233,50 237,43 243,05 261,77 269,12 Viện Nghiên cứu Chính sách lương thực giới (IFPRI), tính tốn nhiều mặt dự báo tình hình sản xuất tiêu thụ sắn tồn cầu với tầm nhìn đến năm 2020 Năm 2020, sản lượng sắn toàn cầu ước đạt 275,10 triệu tấn, sản xuất sắn chủ yếu nước phát triển 274,7 triệu tấn, nước phát triển khoảng 0,40 triệu Mức tiêu thụ sắn nước phát triển dự báo đạt 254,60 triệu so với nước phát triển 20,5 triệu Khối lượng sản phẩm sắn toàn cầu sử dụng làm lương thực thực phẩm dự báo nhu cầu 176,3 triệu thức ăn gia súc 53,4 triệu Tốc độ tăng hàng năm nhu cầu sử dụng sản phẩm sắn làm lương thực, thực phẩm thức ăn gia súc đạt tương ứng 1,98% 0,95% Châu Phi khu vực dẫn đầu sản lượng sắn toàn cầu với dự báo sản lượng năm 2020 đạt 168,6 triệu Trong đó, khối lượng sản phẩm sử dụng làm lương thực thực phẩm 77,2%, làm thức ăn gia súc 4,4% Châu Mỹ La tinh giai đoạn 19932020, ước tốc độ tiêu thụ sản phẩm sắn tăng hàng năm 1,3%, so với châu Phi 2,44% châu Á 0,84 - 0,96% Cây sắn tiếp tục giữ vai trò quan trọng nhiều nước châu Á, đặc biệt nước vùng Đông Nam Á nơi sắn có tổng diện tích đứng thứ ba sau lúa ngô tổng sản lượng đứng thứ ba sau lúa mía 2.1.2.2 Tình hình sản xuất chế biến sắn Việt Nam Ở Việt Nam, sắn lương thực quan trọng đứng hàng thứ ba sau lúa ngô Cây sắn chuyển đổi vai trò từ lương thực, thực phẩm thành cơng nghiệp hàng hóa có lợi cạnh tranh cao Sản xuất sắn nguồn thu nhập quan trọng hộ nơng dân nghèo sắn dễ trồng, kén đất, vốn đầu tư, phù hợp sinh thái điều kiện kinh tế nông hộ Nghiên cứu phát triển sắn theo hướng sử dụng đất nghèo dinh dưỡng, đất khó khăn việc làm có hiệu cao (Hồng Kim Trần Cơng Khanh, 2005), hướng hỗ trợ cho việc thực Đề án “Phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025” Thủ tướng Chính phủ phê duyệt Quyết định số 177/2007/ QĐTT ngày 20 tháng 11 năm 2007 Tại Việt Nam, sắn canh tác phổ biến hầu hết tỉnh vùng sinh thái nông nghiệp Giai đoạn từ năm 2000-2012, tốc độ tăng trưởng diện tích bình qn hàng năm 6% tốc độ tăng trưởng sản lượng bình quân hàng năm đạt 10% Năng suất sắn Việt Nam đứng khoảng thứ 10 số quốc gia suất cao Tuy nhiên, suất bình quân 17 tấn/ha tương đương 50% so với suất sắn Ấn Độ, thấp suất sắn Indonesia 15% thấp Thái Lan 9% Như vậy, diện tích sắn Việt Nam khó có khả gia tăng năm tới cạnh tranh loại khác quy hoạch sử dụng đất triển vọng tăng trưởng sản lượng nhờ gia tăng suất đầu tư hướng công tác chọn tạo giống kỹ thuật canh tác sắn bền vững Diện tích, suất sản lượng sắn Việt Nam qua năm phân theo vùng sinh thái thể qua Bảng Bảng Bảng Diện tích, suất sản lượng sắn Việt Nam giai đoạn 2000 - 2012 Năm Diện tích Năng suất Sản lượng (nghìn ha) (tấn/ha) (triệu tấn) 2000 234,90 8,66 2,03 2001 250,00 8,30 2,07 2002 329,90 12,6 2003 371,70 14,06 2004 370,00 14,49 2005 425,50 15,78 2006 474,80 16,25 2007 496,80 16,07 2008 557,40 16,85 2009 508,80 16,81 2010 496,20 17,17 2011 558,40 17,73 2012 550,60 17,70 Nguồn: Tổng hợp từ Niên giám thống kê 4,15 5,23 5,36 6,72 7,77 7,98 9,30 8,56 8,52 9,89 9,74 Bảng Diện tích, suất, sản lượng sắn Việt Nam năm 2012 phân theo vùng kinh tế TT Vùng sinh thái Diện Năng Sản tích suất lượng (1000 (tấn/ha) (1000 ha) tấn) Đồng sông Hồng 6,7 15,7 105,1 Trung du miền núi phía Bắc 118,0 12,0 1.494,5 Bắc Trung Duyên hải miền 175,0 16,6 3.027,5 Trung Tây Nguyên 149,5 17,0 2.542,0 Đông Nam Bộ 96,5 25,8 2.485,1 Đồng sông Cửu Long 6,5 15,3 99,3 Cả nước 550,6 16,8 9.745,5 Nguồn: Tổng hợp từ Niên giám thống kê Cơ cấu sử dụng sắn Việt nam hàng năm chia thành 03 nhóm gồm: 37% cho sản xuất tinh bột; 33% cho xuất 30% cho sản xuất thức ăn chăn ni Hình 1: Cơ cấu sử dụng sắn Việt Nam 2.1.3 Đặc điểm sắn, thành phần hóa học giá trị củ sắn đời sống 2.1.3.1 Đặc điểm sắn Cây sắn cao – 3m, khía thành nhiều thuỳ, rễ ngang phát triển thành củ tích luỹ tinh bột, thời gian sinh trưởng biến động từ đến 36 tháng, thông thường 10 – 12 tháng, tuỳ thuộc giống, vụ trồng, nơi trồng mục đích sử dụng + Rễ sắn: có rễ rễ củ Rễ mọc từ mắt đốt mô sẹo hom sắn trồng xuống đất, lúc đầu mọc ngang sau cắm sâu xuống đất Đối với sắn mọc từ hạt, rễ cọc cắm thẳng đứng xuống đất Những rễ tập trung nhiều dinh dưỡng gặp điều kiện thuận lợi, loại tượng tầng hoạt động mạnh, hình thành củ Rễ phát triển mô phân sinh thưởng tập trung nhiều dinh dưỡng, nên số lớn rễ dễ phát triển thành rễ củ Những rễ khơng hình thành củ chủ yếu hút nước chất dinh dưỡng để nuôi Trong điều kiện khô hạn, đa số rễ phải đâm sâu xuống đất để làm nhiệm vụ hút nước nên hình thành rễ củ + Thân sắn: cao khoảng – 3m, có phân nhánh không phân nhánh tuỳ thuộc giống Sắn thông thường có đường kính gốc thân biến động từ – 6cm Màu sắc thân biến động tuỳ giống: màu xanh xám, màu xám đậm, màu xám nhạt, màu vàng, màu nâu Thân sắn có sẹo lá, dấu vết rụng để lại thân Chiều dài lóng tính từ vết sẹo đến vết sẹo khác thằng hàng Tập tính phân cành, màu sắc thân, sẹo chiều dài lóng đặc tính để nhận diện giống + Lá sắn: sắn thuộc loại đơn phân thuỳ sâu, có gân rõ mặt sau Số thuỳ sắn biến động từ -9 Lá mọc so le, xếp thân theo đường xoắn ốc Lá non sắn thường có màu xanh tím Lá già màu xanh thẫm, mặt màu xanh nhạt Phiến có biểu bì, mặt có tầng cutin rõ, tiếp mơ dậu, mơ xốp màng biểu bì Mặt có nhiều khí khổng, sắn có nhiều lơng tơ + Hoa, quả: Hoa sắn hoa đơn tính, có hoa đực hoa chùm hoa Hoa khơng nhiều mọc phía cụm hoa nở trước Hoa đực nhỏ mọc phía bên Tập tính hoa sắn phụ thuộc giống điều kiện sinh thái nơi đất trồng, tất giống sắn có hoa Quả sắn loại nang, màu nâu nhạt đến đỏ tía, đường kính khoảng 1.0 – 1.5cm Quả có cánh chia làm ngăn, ngăn có hạt Bảng 4: Thành phần chất cấu tạo phận sắn Các chất Rễ tổng số Vỏ củ Thân cành Lá cấu tạo Chất khô(% 36 30 40 30 15 chất tươi) Gluxit (% 89 75 91 46 41 chất khô) Lipit 0.5 Protit 2.5 10 25 Celulose 4.5 12 23 20 Tro 2.5 10 Canxi 0.1 0.2 0.1 0.3 14 Photpho 0.1 0.1 0.1 0.3 0.5 Fe 0.003 0.002 0.001 0.03 Natri 0.006 0.02 Kali Vitamin 30 A(mg/100g chất khô) Vitamin 0.1 B1(mg…nt) Vitamin B2 0.1 (nt) Acid 80 500 ascorbic 2.1.3.2 Thành phần hóa học cấu tạo củ sắn • Cấu tạo Củ sắn thường thuôn dài đầu, có kích thước tùy thuộc vào chất đất điều kiện trồng mà dao động khoảng: dài 0,1 – 1,1m, đường kính – 8cm Củ thường có phần gồm: vỏ gỗ, vỏ cùi, thịt củ lõi Vỏ gỗ: chiếm 0,5 – 3% khối lượng củ, có màu trắng, vàng nâu Vỏ gỗ cấu tạo từ cellulose hemicellulose, khơng có tinh bột Nó có tác dụng bảo vệ củ khỏi bị ảnh hưởng học hóa học ngoại cảnh Vỏ cùi (vỏ thịt): dày vỏ gỗ nhiều, chiếm khoảng 20% trọng lượng củ Cấu tạo gồm lớp tế bào thành dày, thành tế bào cấu tạo từ xenluloza, bên tế bào hạt tinh bột, hợp chất chứa Nitơ dịch bào (mủ) – dịch bào có tannin, sắc tố, độc tố, enzyme… Vì vỏ cùi có nhiều tinh bột (5 – 8%) nên chế biến tách tổn thất, khơng tách khó khăn chế biến nhiều chất thành phẩn mủ ảnh hưởng đến màu sắc tinh bột Thịt sắn: thành phần chủ yếu củ sắn, bao gồm tế bào nhu mơ có thành mỏng Thành phần tế bào nhu mô cenlulose pentosan vỏ tế bào, hạt tinh bột nguyên sinh chất bên tế bào, gluxit hoà tan nhiều chất vi lượng khác Những tế bào lớp thịt sắn chứa nhiều tinh bột, sâu vào hàm lượng tinh bột giảm dần Kích thước hạt tinh bột sắn khoảng 15 – 18µm Ngồi lớp tế bào nhu mơ cịn có chứa tế bào thành cứng không chứa tinh bột, cấu tạo từ xenluloza nên cứng gỗ – gọi xơ Loại tế bào nhiều đầu cuống, sắn lưu niên củ biến dạng qua trình phát triển Sắn lưu năm có lớp xơ, sắn lưu năm có hai lớp xơ Theo lượng lớp xơ mà biết sắn lưu năm Lõi: phần trung tâm, dọc suốt từ cuống tới chuôi củ, chiếm 0,3 - 1% khối lượng toàn củ Càng sát cuống, lõi lớn nhỏ dần phía chi củ Lõi cấu tạo chủ yếu từ cenlulose vào hemicenlulose Sắn có lõi lớn nhiều xơ ảnh hưởng đến hiệu suất suất nghiền chế biến Ngồi cịn có phận khác: cuống, rễ Các phần cấu tạo chủ yếu xenluloza sắn cuống dài nhiều rễ tỷ lệ tinh bột thấp chế biến khó khăn • Thành phần hố học Thành phần hóa học củ sắn dao động khoảng rộng tuỳ thuộc vào loại giống, điều kiện phát triển thời gian thu hoạch Bảng 5: Thành phần hóa học sắn Thành phần Hàm lượng(%) Tỷ lệ chất khô (%) 30 – 40 Tinh bột (%) 27 – 36 Đạm tổng số (%FW) 0.5 – 2.0 Đường tổng số (%FW) 0.5 – 2.5 Chất khoáng (%FW) 0.5 – 1.5 Chất béo (%FW) 0.5 60% Về tính chất protein nấm men gần giống protein nguồn gốc động vật Protein nấm men chứa khoảng 20 axit amin không thay (bảng 5) Thành phần axit amin nấm men cân đối so với lúa mì hạt ngũ cốc khác, chút so với sữa, bột cá, bột xương thịt sản phẩm động vật nói chung Sự thay đổi thành phần axit amin thời gian nuôi cấy nghiên cứu cho thấy thành phần axit amin thay đổi ởmột giai đoạn phát triển: giai đoạn tiềm phát Sau phát triển, tổng hàm lượng axit amin protein tăng lên 17% so với thời điểm ban đầu Sau tổng hợp axit amin giảm xuống giữ mức độtrên 40% Đến cuối, tế bào già, chất dự trữ, trước hết glucogen tiêu hao nhiều nên giảm trọng lượng, tỉ lệ axit amin so với trọng lượng chung tế bào tăng lên gần 50% (tăng không thực chất) Các giống nấm men dùng làm thực phẩm cho người thức ăn gia súc là: Endomyces vernalis, Hansenula anomala, Hansenula suaveolens, Saccharomyces cerevisiae, Candida arbores, Candida tropicalis, Mycotorula lipolytica, Mycotorula japonica, Torulopis utilis, Torulopis utilis var, major, Torulopsis utilis var thermophilis, Monilia candia, Oidium lactic Các tiêu chuẩn để lựa chọn giống nấm men để sản xuất protein từ nguồn hydrocacon: + Có khả đồng hố nhiều nguồn cacbon khác nhau, loại pentoza (xiloza, arabinoza) axit hữu + Có thểphát triển tốt mơi trường có nồng độ chất khử cao + Có khả phát triển nhanh, có sức đề kháng cao nồng độ CO2 + Sản lượng cao, sinh khối chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị (hàm lượng protein cao, có nhiều axit amin khơng thay thế, vitamin ) + Kích thước tế bào tương đối lớn để dễ tách li tâm + Chịu đựng nhiệt độ tương đối cao, làm biến đổi pH mơi trường - Trong sản xuất nấm men thường dùng chủng thuộc ba giống Saccharmyces, Candida Torulopsis Khả chuyển hoá ba giống cao đa dạng, quy trình cơng nghệ tương đối đơn giản • Sản xuất sinh khối vi sinh vật nấm mốc Nấm mốc vi sinh vật chân hạch, thể tản, tế bào khơng có diệp lục tố, sống dị dưỡng (hoại sinh, kí sinh, cộng sinh), vách tế bào cấu tạo chủ yếu chitin, có hay khơng có celluloz số thành phần khác có hàm lượng thấp Hầu hết loại nấm mốc không cần ánh sáng trình sinh trưởng Nấm mốc cấu tạo từ ba phần tế bào sống: thành tế bào, nguyên sinh chất nhân Nhiệt độ tối thiểu cần cho phát triển nấm mốc 2oC – 5oC, tối hảo 22oC – 27oC nhiệt độ tối đa mà chúng chịu đựng 35 oC – 40oC Nói chung nấm mốc phát triển tốt mơi trường acid (pH=6), tối hảo – 6,5 số loài phát triển pH < số phát triển pH > Một số nấm cộng sinh với tảo hình thành địa y; nấm kí sinh người, động vật, thực vật; nấm sống hoại sinh mùn chất hữu ứng dụng nấm mốc: quy trình chế biến thực phẩm có liên quan đến men cần đến có mặt vi sinh vật có nấm mốc Nấm mốc giúp tổng hợp loại kháng sinh (penicillin), acid hữu (acid oxalic, citric,…), vitamin (nhóm B),… ngồi nấm giữ vai trò quan trọng việc phân giả chất hữu trả lại độ màu mỡ cho đất trồng Nấm yếu tố quan trọng trình làm tương, rượu, nước chấm Trong sản xuất sinh khối từ tinh bột, nấm mốc đóng vai trò chủ yếu thuỷ phân tinh bột thành đường kết hợp bổ sung nấm men để tạo lượng sinh khối tối ưu 2.2.2.2.Giới thiệu chung chủng vi sinh vật sử dụng √ saccharomyces cerevisiae + Đặc điểm hình thái: tế bào có dạng hình trứng, bầu dục Kớch thc bỡnh (3-6) ì (5-12) àm, sinh sn hình thức chồi khơng theo quy luật, xuất một, đôi chuỗi Khuẩn lạc có màu trắng nhạt, rìa trịn, lồi lên, bề mặt sáng lấp lánh, đường kính – 2mm vào ngày thứ + Tính chất ni cấy: Phát triển tối ưu 33 – 35 oC môi trường chứa 10 – 30% glucose Nhiệt độ tối thiểu 4oC 10% glucose 13oC 50% glucose, nhiệt độ tối đa 38 – 39oC (Jemini and Schmidt-Lorenz,1987, trích từ Lê Nguyễn Bảo Trân, 2005) Có khả phát triển pH = 1,6 HCl, pH = 1,7 H3PO4 pH = 1,8 - acid hữu cơ, có sức chịu đựng lớn acid benzoic 100mg/kg pH = 2,5 – acid sorbic 200mg/kg pH = + Tính chất hố sinh: Có khả lên men đường glucose, galactose, maltose, saccharose, safinose dexin đơn giản, khơng lên men lactose, manitol, khơng đồng hố nitrat, khơng phân giải tinh bột Là lồi nấm men hay sử dụng làm men bánh mì, lên men rượu, bia sử dụng làm probiotic phục vụ cho chăn nuôi gia súc nuôi trồng thuỷ sản nhờ có khả chịu acid dày muối mật tốt, đề kháng tự nhiên với kháng sinh √ Candida tropicalis + Đặc điểm hình thái: Tế bào nấm men có dạng hình ovan hình trịn, lớn, kích thước trung bình nấm men thường l (5-10) ì (4-8) àm, phn ln cỏc t bo kết thành nhánh, đứng riêng rẽ Hệ sợi giả phát triển tốt từ sợi giả kéo dài, phân nhánh thành chuỗi, không tạo bào tử túi, tế bào già tích tụ nhiều hạt chất béo + Tính chất ni cấy: Qua ngày đêm 36oC nước malt (4oBe) tạo thành cặn không nhiều qua tháng tạo thành màng dày nhăn nheo Khuẩn lạc mọc thạch malt hình trịn, màu kem trắng Rìa khuẩn lạc bị cắt theo hình cưa có tưa (hiếm phằng nhẵn) Men loại dị hình thái: chủng có mọc thành khuẩn lạc dạng R (nhăn nheo) hay dạng S (nhẵn) + Tính chất hố sinh: Lên men tốt dịch đường glucose, galactose, sacarose, maltose, treharose, rafinose, melixitose, inulin, sucxinic, citric Không hấp thu sovbiose, xentobiose, lactose, milibiose, dulxit, inozit acid xalysalic Cần số vitamin làm chất sinh trưởng: acid pantotenic, paraminbenzoic, tiamin, … + Đặc tính cơng nghệ: Hiệu suất thu hồi nấm men Candida tropicalis đạt khoảng 38 – 46% môi trường nuôi cấy Tốc đọ sinh trưởng riêng 0.15 – 0.2/h cho thêm vào môi trường cao men (0.5%), suất tăng 48 – 50% tốc độ sinh trưởng 0.25 – 0.28/h Nhiệt độ ni cấy thích hợp 36 – 37oC, pH = 4.2 – 4.5 √ Endomycosis fibuligenes + Đặc điểm: Endomycopsis fibuligenes loài nấm men giàu enzyme amylase, glucoamylase Do chúng vừa có khả đường hóa, vừa có khả rượu hóa Trong q trình chuyển hố tinh bột thành đường, phát triển nấm men endomycopsis, tinh bột chuyển thành đường Các loài nấm men, nấm mốc trình phát triển tạo nhiều enzyme amylase glucoamylase Các enzyme hoạt đọng thuận lợi giai đoạn đầu kéo dài suốt giai đoạn Điểm quan trọng cần đề cập đến enzyme thường chịu điền khiển sản phẩm cuối glucose Bình thường glucose ức chế phản ứng thuỷ phân tinh bột, loài nấm mốc Mucor rouxi, rhizopus delma, lồi nấm men endomycopsis vừa có khả tổng hợp amylase glucoamylse, vừa có khả chuyển hố đường thành rượu Kết lượng đường glucose tạo thành chuyển hoá thành rượu phần phục vụ cho sinh trưởng lồi sinh vật Do đó, khối dịch lên men thường khơng xảy chế kìm hãm ngược lại glucose √ Aspergillus oryzae + Đặc điểm hình thái: Bào tử nấm mốc Aspergillus oryzae có mà vàng hoa cau, sinh trưởng nấm mốc A oryzae hệ sợi bao gồm sợi mảnh, chiều ngang – µm, phân nhánh nhiều có vách ngăn, chia sợi thành nhiều bao tế bào Từ sợi nằm ngang hình thành sợi đứng thẳng gọi cuống đính bào tử, có quan sinh sản vơ tính Cuống đính bào tử A oryzae thường dài – mm nên nhìn thấy mắt thường Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi bọng Từ bọng phân chia thành tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi tế bào hình chai Đầu tế bào hình thành chai phân chia thành bào tử đính vào nhau, nên gọi đính bào tử Đính bào tử A oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau + Tính chất ni cấy: Nấm mốc A oryzae có khả sinh trưởng phát triển dễ dàng nhiều chất khác Độ ẩm tốt cho hình thành enzyme nấm mốc A oryzae 55 – 60%, độ ẩm thích hợp cho hình thành bào tử 45% Nhiệt độ thích hợp cho phát triển hình thành enzyme 28 – 32 oC, pH thích hợp cho A oryzae mơi trường acid yếu khoảng 5.5 – 6.5 + Oryzae có khả tiết môi trường enzyme thuỷ phân xenlulase, pectinase, xylanase hemixenlulase sống môi trường có nguồn chất tương ứng PHẦN THỨ BA ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu, thời gian địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Sản phẩm sắn lát trồng chủ yếu Sơn La - Nấm men Candida tropicalis, Endomycopsis fibuligenes, nấm mốc Aspergillus oryzae mua Viện Công Nghiệp Thực Phẩm 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu - Thiết bị: kính vi điện tử, tủ cấy vô trùng, tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp, chiết Kjelhal - Dụng cụ: cốc thủy tinh( 100ml, 200ml, 500ml), ống đong 250ml, ống nghiệm, buồng đếm hồng cầu, bình tam giác (100ml, 250ml, 500ml), bình định mức (100ml, 250ml), pipet (1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml), pipetman, đũa thủy tinh, thìa nhựa, đĩa petri, cối sứ, nồi nhơm, bếp gas du lịch, cân phân tích, cân kĩ thuật… - Hóa chất: H2SO4 0.1N, H2SO4 đậm đặc, HCLO4, H3BO3 2.5%, HCl 5%, HCl 15%, NaOH 2.5N, NaOH 20%, NaOH 30%, CH3(COO)2Pb 10%, Na2HPO4 bão hoà, K3Fe(CN)6 1%,, thuốc thử Tashiro, metyl da cam, xanh metylen, phenolphtalein, dung dịch tinh bột 1%, dung dịch glucose 0,5%, KH 2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, ure, đường saccharose, đường glucose, pepton, agar 3.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu: mơn quản lí chất lượng an tồn thực phẩm, khoa Cơng Nghệ Thực Phẩm, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam - Thời gian nghiên cứu: 1/2016 – 6/2016 3.2 Nội dung nghiên cứu - Xác định nhóm vi sinh vật (nấm mốc nấm men) thích hợp để ni sinh khối mơi trường sắn lát - Xác định tỉ lệ giống cấy nấm mốc nấm men thích hợp - Nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm môi trường nuôi cấy đến phát triển sinh khối vi sinh vật môi trường sắn lát - Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn Nitơ hàm lượng Nitơ bổ sung đến phát triển sinh khối vi sinh vật - Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn Photpho đến phát triển sinh khối vi sinh vật - Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến phát triển sinh khối vi sinh vật - Nghiên cứu ảnh hưởng độ thống khí (độ dày) đến phát triển sinh khối vi sinh vật - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến phát triển sinh khối vi sinh vật 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm Để xác định ảnh hưởng yếu tố công nghệ đến phát triển sinh khối vi sinh vật tiến hành thí nghiệm đơn yếu tố ứng với thơng số cơng nghệ Khi chọn giá trị thích hợp yếu tố cơng nghệ cần tìm, ta giữ nguyên giá trị chọn tiếp tục khảo sát ảnh hưởng yếu tố cịn lại Mơi trường nuôi cấy ban đầu: 100g sắn lát 100g nước hấp 121 0C 40 phút (có độ ẩm tương ứng khoảng 55%), bổ sung 0.2g KH 2PO4; nhiệt độ nuôi cấy 30oC, trải thành lớp mỏng độ dày 2cm với 1% giống nấm mốc (5×106 tế bào nấm mốc/ml), 5% dịch nấm men (5×106 tế bào nấm men/ml), thời gian nuôi cấy 120h Tiến hành Chuẩn bị giống nấm mốc, dịch nấm men chứa 5×106 tế bào nấm men/ml Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Lấy 100g sắn 100g nước hòa 0,2g KH2PO4 hấp 121°C 40 phút Để nguội bớt trộn Bổ sung nấm mốc để thủy phân tinh bột môi trường nuôi cấy Theo dõi phát triển nồng độ đường đến nồng độ 15- 18 % thích hợp cho nấm men phát triển, bổ sung dịch nấm men vào Ni tiếp nhiệt độ phịng thời gian 120h Các cơng thức thí nghiệm + Thí nghiệm 1: Xác định nhóm vi sinh vật (nấm mốc nấm men) thích hợp để ni sinh khối mơi trường sắn lát CT 1.1: Aspergillus oryzae + Candida tropicalis CT 1.2: Endomycopsis fibuligenes + Candida tropicalis CT 1.3: Aspergillus oryzae + Sacharomyces cerevisiae CT 1.4: Endomycopsis fibuligenes + Sacharomyces cerevisiae + Thí nghiệm 2: Xác định tỷ lệ nấm mốc nấm men CT 2.1: 1% nấm mốc + 3% nấm men (so với khối lượng sắn) CT 2.2: 2% nấm mốc + 3% nấm men (so với khối lượng sắn) CT 2.3: 1% nấm mốc + 5% nấm men (so với khối lượng sắn) CT 2.4: 2% nấm mốc + 5% nấm men (so với khối lượng sắn) Thí nghiệm thí nghiệm tiến hành điều kiện ni cấy Ở thí nghiệm theo dõi tiêu: hoạt lực enzyme amylase; hàm lượng đường; hàm lượng tinh bột; mật độ tế bào nấm men Từ thí nghiệm 1, theo dõi tiêu để chọn cặp vi sinh vật phù hợp sau tiến hành xác định tỉ lệ thí nghiệm Sau chọn tỉ lệ cặp nấm men nấm mốc phù hợp, ta tiếp tục tiến hành thí nghiệm + Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm môi trường nuôi cấy đến phát triển sinh khối vi sinh vật môi trường sắn lát CT 3.1: nuôi cấy độ ẩm 50% CT 3.2: nuôi cấy độ ẩm 55% CT 3.3: nuôi cấy độ ẩm 60% CT 3.4: nuôi cấy độ ẩm 65% + Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn Nitơ hàm lượng Nitơ bổ sung đến phát triển sinh khối vi sinh vật môi trường sắn lát Tùy loại vi sinh vật chọn TN1, bố trí TN Asp.oryzae: cần bồ sung Nitơ, nguồn Nitơ bổ sung NH4NO3 CT 4.1: Bổ sung 2g/l CT 4.2: Bổ sung 2.4g/l CT 4.3: Bổ sung 2.8g/l CT 4.4: Bổ sung 3.2g/l CT 4.5: Không bổ sung Endomucopsis fibuligenes: không cần bổ sung Nitơ Candida tropicalis: không cần bổ sung Nitơ Sacharomyces cerevisiae: cần bổ sung Nitơ CT 4.1: Bổ sung 7g/l CT 4.2: Bổ sung 7.5g/l CT 4.3: Bổ sung 8g/l CT 4.4: Bổ sung 8.5g/l CT 4.5: Không bổ sung Nitơ + Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng nguồn Photpho đến phát triển sinh khối vi sinh vật môi trường sắn lát - CT 5.1: Bổ sung 0,5g KH2PO4 vào 100g sắn lát CT 5.2: Bổ sung 1g KH2PO4 vào 100g sắn lát CT 5.3: Bổ sung 1,5g KH2PO4 vào 100g sắn lát CT 5.4: Bổ sung 2g KH2PO4 vào 100g sắn lát + Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng pH đến phát triển sinh khối vi sinh vật môi trường sắn lát Asp.oryzae CT 6.1: pH CT 6.2: pH 5.5 CT 6.3: pH CT 6.4: pH 6.5 Endomycopis fibuligera CT 6.1: pH CT 6.2: pH 4.5 CT 6.3: pH CT 6.4: pH 5.5 Candida tropicalis - CT 6.1: pH 4.5 CT 6.2: pH CT 6.3: pH 5.5 CT 6.4: pH Sac.cerevisiae CT 6.1: pH 4.5 CT 6.2: pH CT 6.3: pH 5.5 CT 6.4: pH + Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng độ dày mơi trường nuôi cấy đến phát triển sinh khối vi sinh vật môi trường sắn lát CT 7.1: Môi trường ni cấy có độ dày 1cm CT 7.2: Mơi trường ni cấy có độ dày 2cm CT 7.3: Mơi trường ni cấy có độ dày 3cm CT 7.4: Mơi trường ni cấy có độ dày 4cm + Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến phát triển sinh khối vi sinh vật môi trường sắn lát CT 8.1: nuôi cấy 24h CT 8.2: nuôi cấy 48h CT 8.3: nuôi cấy 72h CT 8.4: nuôi cấy 84h CT 8.5: nuôi cấy 96h CT 8.6: nuôi cấy 108h CT 8.7: nuôi cấy 120h CT 8.8: nuôi cấy 144h Từ thí nghiệm tới thí nghiệm 8, thí nghiệm theo dõi tiêu sau: hoạt lực amylase, lượng CO2 thoát ra, mật độ tế bào nấm men, hàm lượng đường dư, hàm lượng protein sắn, hàm lượng tinh bột 3.3.2 Phương pháp phân tích tiêu 3.3.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng tinh bột Nguyên tắc: Thủy phân tinh bột thành đường dung dịch HCl 10% điều kiện đun sôi bình cách thủy thời gian Dung dịch sau thủy phân làm nguội trung hòa NaOH với thị methy da cam Hàm lượng đường sau thủy phân xác định phương pháp lên màu với Ferrycyanuare Kết lượng đường khử dung dịch sau thủy phân trừ lượng đường khử dung dịch trước thủy phân lượng đường hình thành từ trình thủy phân tinh bột Hiệu số nhân với hệ số chuyển đổi đường khử thành tinh bột 0.9 ta có hàm lượng tinh bột mẫu nguyên liệu ban đầu Dụng cụ: bình định mức (100ml, 250ml), bình tam giác (250ml), cốc thủy tinh (100ml, 250ml), phễu thủy tinh, ống đong (100ml), ống sinh hàn, nồi cách thủy, bếp điện, cân phân tích, nhiệt kế Hóa chất: HCl đặc, dung dịch Ferrycyanuare 1%, dung dịch glucose 0.5%, dung dịch hydroxy natri 20% (5N), dung dịch hydroxy natri 10% (2.5N), methy da cam, CH3(COO)2Pb 10%, Na2HPO4 bão hòa, methylene blue Tiến hành Chuẩn bị mẫu thử xác định hàm lượng đường khử ban đầu mẫu: cân cho vào cối sứ xác 5.01g bột trộn với 30ml nước cất, chuyển tồn hỗn hợp vào bình tam giác 100ml Sau kết tủa protein tạp chất dung dịch axetat chì 10% (2 – 5ml) CHCl 5%, sau loại bỏ lượng axetat chì dư bằng dung dịch Na2HPO4 bão hòa (3 – 5ml) thêm với lượng vừa đủ để kết tủa hoàn tồn axetat chì dư Để n hỗn hợp 10 phút, chuyển vào bình định mức 100ml, tráng kỹ, thêm nước cất tới vạch định mức đem lọc Nước lọc mang chuẩn độ dung dịch Ferrycyanuare 1% thí nghiệm: lấy 2g bột sắn chuyển vào bình tam giác sau cho thêm 1000ml dung dịch HCl 5% (tráng lại nhiều lần) đậy nắp lại Lắc nhẹ đặt vào nồi đun cách thủy cho đun sơi khoảng Tiếp đó, làm nguội cho thêm – giọt methy da cam NaOH 20% (xuất màu vàng) Cho toàn dịch thủy phân vào bình định mức 250ml nước cất sau lắc kỹ đem lọc Dung dịch thu sau lọc đem chuẩn độ dung dịch Ferrycyanuare 1% Tiến hành chuẩn độ: cho vào bình nón 10ml dung dịch K 3Fe(CN)6 1% 2.5 dung dịch NaOH 2.5N, thêm vào giọt methylen blue Đun sôi chuẩn độ bếp dung dịch đường khử dịch đường sau thủy phân từ burette, cho giọt, lắc mạnh (dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng) Sau lần chuẩn độ thứ nhất, tiến hành lần chuẩn độ thứ hai Lần sau đun sôi dung dịch Ferrycyanuare, xả nhanh lượng đường, để lại 1ml để chuẩn độ tiếp tìm xác điểm cuối Kết tính tốn sử dụng từ lần chuẩn độ thứ hai trở (lặp lại thí nghiệm lần) Xác định lượng đường glucose chuẩn 0.5% tiêu tốn để phản ứng hết với 10ml dung dịch K3Fe(CN)6 1%: chuẩn độ tương tự dung dịch đường khử thay dung dịch đường khử burette dung dịch đường glucose chuẩn 0.5% (lặp lại thí nghiệm lần) Kết Thể tích dung dịch glucose 0.5% dùng cho chuẩn độ (Vg) Vgtb = (Vg1 + Vg2 + Vg3)/3 (ml) Thể tích dung dịch đường khử dùng chuẩn độ (VK) VKtb = (VK1 + VK2 + VK3)/3 (ml) Thể tích dung dịch đường sau thủy phân dùng chuẩn độ (VTP) VTPtb = (VTP1 + VTP2 + VTP3)/3 (ml) Hàm lượng đường khử nguyên liệu XK = (0.5/100)*Vg*(V/VK)*(100/m) Hàm lượng đường khử dịch thủy phân XTP = (0.5/100)*Vg*(V/VTP)*(100/m) Trong XK lượng đường khử ban đầu (g/100g) Vg thể tích dung dịch glucose 0.5% dùng cho chuẩn độ (ml) VK thể tích dung dịch đường khử dùng chuẩn độ (ml) VTP thể tích dung dịch đường sau thủy phân dùng chuẩn độ (ml) V thể tích bình định mức đường khử (ml) m khối lượng mẫu thí nghiệm (g) Hàm lượng tinh bột mẫu X = (XTP – XK)*0.9 Trong đó: X lượng tinh bọt có mẫu ban đầu 0.9 hệ số chuyển hóa glucose thành tinh bột 3.3.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng Nguyên tắc Khi cho Ferrycyanure K3Fe(CN)6 phản ứng với đường khử, sản phẩm thu Ferrocyanure Dựa vào phản ứng ta suy lượng đường khử có dung dịch cần xác định Việc chuẩn độ tiến hành mơi trường kiềm NaOH, đun nóng với thị xanhmetylen Phương trình phản ứng: CH2OH(CHOH)4CHO + K3Fe(CN)6 + 2NaOH → CH2OH(CHOH)4COONa + NaK3Fe(CN)6 +H2O Tiến hành Định lượng đường tổng: Cân xác 25g nguyên liệu, nghiền nhuyễn cối sức nhiều lần với nước cất nóng Để nguội cho vào bình tam giác 250 định mức đến vạch 250ml Lọc dịch lấy 100ml vào bình định mức.thêm vào 10ml HCl 15% đun 70 – 80oC vòng 30 phút Để nguội trung hồ NaOH 2.5N (có cho thêm giọt phenolphtalein làm thị) Định mức lên 250ml Đây dịch dùng để chuẩn độ Lấy 20ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% thêm 5ml NaOH 2.5N vài giọt xanhmetylen, lắc đun sôi – phút Dùng dung dịch đường chuẩn bị để chuẩn độ bếp Điểm dừng chuẩn độ xác định màu xanhmetylen chuyển sang màu vàng rơm Tính kết quả: Lượng đường tổng tính theo cơng thức: Đ= x = (a.k/v).100 (g/l) Trong đó: a: 0,0215 k: 25 (hệ số pha loãng) v: số ml dung dịch đường chuẩn 3.3.2.3 Phương pháp xác định lượng CO2 thoát phương pháp cân bình Trong trình hố hấp hiếu khí, nấm men oxy hóa hồn tồn đường thành CO2 nước: C6H12O6 → 3CO2 + 6H2O Lượng CO2 tạo thành ngồi làm khối lượng bình lên men giảm đi, dựa vào thay đổi khối lượng bình lên men thời điểm khác để xác định khối lượng CO2 tạo thành Cách tiến hành: Cân khối lượng bình thí nghiệm (bổ sung nấm men), bình đối chứng (khơng bổ sung nấm men) cân kĩ thuật Cân thời điểm ngày, ngày, ngày, ngày, ngày Tính kết Khối lượng CO2 tính theo cơng thức: M=a–b Trong đó: a khối lượng bình thí nghiệm (g) b khối lượng bình đối chứng (g) 3.3.2.4 Phương pháp xác định mật độ tế bào (phương pháp định lượng trực tiếp) Mật độ vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn nấm men xác định trực tiếp kính hiển vi nhờ buồng đếm hồng cầu Nguyên tắc cấu tạo phịng đếm: phiến kính dày hình chữ nhật (2 – 3mm), chia thành khoảng, khoảng chia thành khoảng nhỏ Trên mối khoảng có kẻ lưới đếm gồm nhiều ô vuông Mỗi ô vuông lại chia thành 16 vng nhỏ, nhỏ có diện tích 1/400 mm 2, chiều dày 1/10mm Như vậy, thể tích mọt vng nhỏ 1/4000 mm hay 1/4000.000 ml Phịng đếm có kính dày để đậy Cách tiến hành: + Pha loàng mẫu cần đếm cho số lượng tế bào nấm men ô nhỏ không vượt 10 tế bào/ô không nhỏ 2,5 tế bào/ô + Lắc ống nghiệm pha loãng mẫu + Nhỏ giọt dung dịch mẫu vào phòng đếm đậy lại kính, ý khơng để tạo bọt khí + Di chuyển nhẹ nhàng phòng đếm để dung dịch mẫu tràn đầy khoang + Đặt phòng đếm lên bàn kính hiển vi, để yên - phút, sau tiến hành đếm số lượng tế bào ô lớn chéo 20 ô vuông nhỏ sau lấy trị số trung bình Tính số lượng tế bào theo cơng thức: N = (a.1000.10n)/(h.s) Trong đó: N số lượng tế bào 1g mẫu a số lượng tế bào trung bình vng lưới đếm h chiều sâu khung đếm s diện tích vng n độ pha loãng 3.3.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng protein (phương pháp định lượng ni tơ tổng số - phương pháp Kjeldhal) Nguyên tắc:Trong phân tử protein, hàm lượng nitơ chiếm tỉ lệ 15 – 18% khối lượng phân tử Do xác định hàm lượng % nitơ nguyên liệu, tùy theo loại protein mà ta nhân với hệ số khác % protein = % N protein x 6.25 Các hợp chất nitơ có chứa nitơ tác dụng nhiệt độ cao H 2SO4 đậm đặc bị vơ hóa Trong trình hợp chất hữu bị phân giải oxi hóa tạo thành CO2, SO2 nước Các hợp chất có chứa nitơ → CO2 + H2O + NH3 +SO2 Nitơ giải phóng lượng amoniac NH3 kết hợp với H2SO4 đặc tạo (NH4)SO4 NH3 + H2SO4 → (NH4)SO4 Dùng kiềm để phân giải muối này, amoniac bay (NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH4OH + Na2SO4 Thu nhận NH3 axit boric nồng độ xác định 2.5% H 2SO4 0.1N Sau chuẩn độ hệ chuẩn độ tương ứng H3BO3 – H2SO4 H2SO4 – NaOH Hóa chất: H2SO4 đặc, hốn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 với tỉ lệ 3:1 HClO4, NaOH 30%, H2SO4 0.1N, NaOH 0.01N, H3BO3 2.5%, cồn 96o, thuốc thử hỗn hợp Taxiro (xanh metylen 0.1% đỏ metylen 0.1% ethanol với tỷ lệ 1:2) Cách pha thị Tasiro: Hoà 0.05g metyl xanh vào 5ml nước cất, cho 100ml cồn vào hoà thêm 0.1g metyl đỏ Hoà tan cho vào lọ tối màu Hỗn hợp có giới hạn biến đổi màu pH 5,2 – 5,6 Mơi trường axit có màu tím, mơi trường kiềm có màu xanh lục Dụng cụ: pipet (1ml, 5ml, 10ml, 20ml), bình định mức 100ml, bình tam giác ( 100ml, 250ml), cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, lọ đựng hóa chất Thiết bị: chiết Kjeldhal Tiến hành Giai đoạn 1: Vơ hóa mẫu nghiên cứu Xử lý mẫu: dùng mẫu tươi mẫu khơ Trừng hợp dùng mẫu trước công phá nên cho 1ml cồn ethylic để dịch công phá không sủi bọt Mẫu sấy khô xác định độ ẩm, tán nhỏ, rây mịn Tùy theo hàm lượng protein mẫu nhiều hay mà chọn cách lấy mẫu cho thích hợp Mẫu khơ giàu protein lấy 0.2g mẫu, mẫu protein lấy 0.5g Những mẫu dạng nước dùng pipet hút khoảng – 5ml, mẫu đóng hộp hút 10 – 20ml cho vào bình Kjelhdal Cơng phá Cho mẫu vào bình Kjelhdal, thêm vài giọt nước cất lượng H 2SO4 đậm đặc đậy kín bình để qua đêm để tránh khí độc SO 2, CO2 ngồi gây nhiễm môi trường.Cho 1ml HClO4 vào đun bếp điện, đun dịch Pha loãng vơ hóa Để nguội bình Kjelhdal sau chuyển sang bình định mức 100ml Giai đoạn 2: cất amoniac Cho khoảng 20ml H3BO3 2.5% vào bình hứng – bình tam giác 250ml, thêm vài giọt thị Tasiro, dung dịch có màu tím đỏ Đặt bình hứng cho đầu ống sinh hàn ngập dung dịch axid boric Cho 25ml dung dịch mẫu pha lỗng vào bình Kjelhdal, thêm vài giọt thị Tasiro, dung dịch chuyển thành màu hồng, trung hòa lượng axit dư NaOH 30% dung dịch chuyển sang màu xanh lắp vào tiến hành cất Tiến hành chuẩn độ bình hứng acid H2SO4 0.1N Song song bình thí nghiệm, tiến hành làm bình đối chứng Cách làm tương tự bình thí nghiệm khác khơng có mẫu Tính kết Hàm lượng nitơ tổng số có nguyên liệu là: %Nts = (a.0.0142.V.100)/(v.c) Trong đó: chứng a lượng H2SO4 0.1N dùng để chuẩn độ sau trừ bình đối V số ml dung dịch mẫu pha loãng (100ml) v số ml dung dịch mẫu đem cất amoniac(25ml) c khối lượng mẫu đem cân phân tích 0.0142: số mg ni tơ tương đương với 1ml H2SO4 0.1N Sau tính đượng ni tơ tổng số, đem kết nhân với hệ số tương ứng cho hàm lượng protein nguyên liệu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Giáo trình Vi sinh vật đại cương, T.S Nguyễn Thị Thanh Thủy, khoa công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội Bài giảng môn học công nghệ sản xuất protein, axit amin axit hữu cơ, PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh, môn công nghệ thực phẩm – sinh học, trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng Tài liệu tiếng Anh Robert Noyes , Protein food supplement, Noyes Development corporation, Park Ridge, New Jerbey, USA (1969) Richard I Matelles and Steven, Single - Cell Protein, R Tanneebaum Editors, Cambrige, Massachusettes and London, England (1978) Fermentation Methods for Protein Enrichment of Cassava and Corn with Candida tropicalis Tài liệu internet http://cayluongthuc.blogspot.com/2008/01/v-tr-kinh-t-ca-cy-sn.html http://s1.downloadmienphi.net/file/downloadfile8/204/1338245.pdf http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-san-xuat-sinh-khoi-vi-sinh-vat-giau-proteincho-gia-suc-52934/ https://cuongstore.wordpress.com/2013/06/15/men-ruou/ Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2016 Người hướng dẫn ThS Lê Minh Nguyệt Người thực Nguyễn Thị Linh ... sinh vật sử dụng sản xuất sinh khối 2.2.2.1 Sản xuất sinh khối từ nấm men, nấm mốc • Giới thiệu chung sản xuất sinh khối nấm men: Trong nguồn protein sản xuất đường vi sinh vật, nấm men nghiên cứu. .. triển sinh khối vi sinh vật - Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến phát triển sinh khối vi sinh vật - Nghiên cứu ảnh hưởng độ thống khí (độ dày) đến phát triển sinh khối vi sinh vật - Nghiên cứu ảnh hưởng... triển sinh khối vi sinh vật môi trường sắn lát - Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn Nitơ hàm lượng Nitơ bổ sung đến phát triển sinh khối vi sinh vật - Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn Photpho đến phát triển sinh