Nghiên cứu khả năng kích thích sinh cytokines của protein tái tổ hợp Interleukin-2 trên tế bào đại thực bào

nterleukin-2 (IL-2) là một cytokine đa chức năng, đóng vai trò điều hòa sự nhân lên, biệt hóa và điều hòa miễn dịch của nhiều loại tế bào và vật chủ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ dòng hóa gene mã hóa cho IL-2 của gà, biểu hiện protein tái tổ hợp IL-2 của gà và đánh giá hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp IL-2 trên tế bào dòng đại thực bào.

Vietnam J Agri Sci 2020, Vol 18, No 6: 434-444 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2020, 18(6): 434-444 www.vnua.edu.vn NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH CYTOKINES CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP INTERLEUKIN-2 TRÊN TẾ BÀO ĐẠI THỰC BÀO Trương Anh Đức1*, Trần Thị Thanh Hà1, Nguyễn Thị Huyền1, Chu Thị Như1, Nguyễn Thị Chinh1, Hoàng Văn Tuấn1, Lý Đức Việt1, Đặng Vũ Hoàng1, Yeong Ho Hong2 Bộ mơn Hóa sinh - Miễn dịch, Viện Thú y Quốc gia Khoa Công nghệ sinh học động vật, Trường Đại học Chung Ang, Anseong, Hàn Quốc * Tác giả liên hệ: truonganhduc84@gmail.com Ngày chấp nhận đăng: 16.06.2020 Ngày nhận bài: 20.11.2019 TÓM TẮT Interleukin-2 (IL-2) cytokine đa chức năng, đóng vai trị điều hịa nhân lên, biệt hóa điều hịa miễn dịch nhiều loại tế bào vật chủ Trong nghiên cứu này, chúng tơi dịng hóa gene mã hóa cho IL-2 gà, biểu protein tái tổ hợp IL-2 gà đánh giá hoạt tính sinh học protein tái tổ hợp IL-2 tế bào dòng đại thực bào Gen mã hóa cho protein IL-2 gà (mã số AF000631 Ngân hàng gen quốc tế) tái tổ hợp tín hiệu Trx-Tag thioredoxin với trình tự nhận biết hai enzyme hạn chế EcoRI đầu 5' HindIII đầu 3', đưa vào véc tơ tách dịng pCR2.1-TA Sau tồn đoạn DNA chuyển vào vị trí EcoRI- HindIII véc tơ biểu pET32a(+) để tiến hành biểu protein tái tổ hợp gen IL-2 vi khuẩn E coli BL21 Kết cho thấy biểu thành công protein tái tổ hợp IL-2 gà hệ thống E coli Protein IL-2 gà tái tổ hợp khơng sản sinh độc tố tế bào, có khả kích thích nhân lên sinh trưởng tế bào dòng đại thực bào gà Protein IL-2 tái tổ hợp gà kích thích tế bào dịng đại thực bảo sản sinh IFNγ, IL-1β IL-6 mRNA Kết nghiên cứu cho thấy protein IL-2 tái tổ hợp gà có hoạt tính sinh học tự nhiên, nhận diện kháng thể kháng IL-2 Từ khóa: Escherichia coli, Interleukin-2, gà, cytokines, protein tái tổ hợp Study on Expression of Chicken Interleukin Recombinant Protein and its Modulate Cytokines Production in Macrophage Cell Line ABSTRACT Interleukin-2 is a multifunctional cytokine, which modulates the proliferation and differentiation of various types of cells and induces cytokines expression In this study, chicken IL-2 will be cloned, expressed and its functional characterization was evaluated in Macrophage (HD11) cell line Genes coding for IL-2 (AF000631 from GenBank) linked with Trx-Tag thioredoxin leader and restriction sequences of EcoRI (5’end), HindIII (3’end) were cloned and then ligated into a cloning véc tơvector pCR2.1-TA Chicken IL-2 gene was incorporated into pET32a(+) at restriction sites for the expression of the IL-2 gene in E coli BL21 Chicken IL-2 recombinant protein produced in E coli system showed that it did not produce cytotoxicity and enhanced the proliferation of macrophage (HD11) cell line and induced IFNγ, IL-1β and IL-6 mRNA expression These results showed that recombinant chicken IL-2 protein production in E coli system was possessed natural biological properties and was recognized by specific antibodies against IL-2 Keywords: Escherichia coli, Interleukin-2, chicken, cytokines, recombinant protein ĐẶT VẤN Interleukin-2 (IL-2) c sõn xuỗt bi cỏc 434 ọi thực bào, tế bào T lympho (CD4+ T, CD8+ T), tế bào Natural killer (NK) tế bào đuôi gai kích hột (Itoh & cs., 1985; Mamontov & Trương Anh Đức, Trần Thị Thanh Hà, Nguyễn Thị Huyền, Chu Thị Như, Nguyễn Thị Chinh, Hoàng Văn Tuấn, Lý Đức Việt, Đặng Vũ Hoàng, Yeong Ho Hong cs., 2019; Reichert & cs., 1999) IL-2 đòng vai trò miễn dðch tự miễn thể; kích thích sân xuỗt IFN-ó dộn n s bit húa ca cỏc t bào T trợ giúp (T helper) để trở thành tế bào Th1, Th2, Th17 kích thích sân sinh kháng thể chủ động IL-2 phát læn đæu người nëm 1976, cị chức nëng kích thích phân chia tế bào (mitose) T lympho người hỗ trợ cho phát triển T lympho nuụi cỗy phũng thớ nghim (Kawano & Noma, 1996; Lauener & cs., 1995; Morgan & cs., 1976; Toren & cs., 1995) Sự kiện phát IL-2 mà lúc đæu người ta gọi yếu tố phát triển tế bào T lympho (T cell growth factor) tiến bước ngoặt miễn dðch, lỉn đæu tiên mở nghiên cứu cá thể tế bào T vai trị quan hệ với tế bào B, đäi thực bào tế bào NK (Greene & cs., 1986; Rey & cs., 1984) Nhiu nghiờn cu ó chng minh, IL-2 c sõn xuỗt từ tế bào T lympho có kích thích khỏng nguyờn Tuy nhiờn, mt s iu kin nhỗt nh, t bo B v NK cng sõn xuỗt IL-2, nhng lng sõn xuỗt rỗt thỗp Khi T lympho kích thích không sau phát hin thỗy IL2 v ợnh cao l sau 12 gi (Mamontov & cs., 2019; Piscitelli & Minor, 1995) Sự hoät động IL-2 thông qua hệ thống IL-2 receptor complex bao gồm 03 chuỗi: IL-2Rα (CD25), IL-2Rβ (CD122) IL-2R (CD132) điều khiển miễn dðch thông qua số đường miễn dðch (immune signaling pathways) JAK-STAT, PI3K/Akt/mTOR MAPK/ERK, qua đị kích thích tế bào, th sõn sinh dch ch ng, sõn xuỗt cỏc lymphokin nh TNF, TNF, TGF, sõn xuỗt cỏc yu t kích thích phát triển B lympho IL-4, IL-6, yếu tố kích thích sinh máu IL-3, IL-5, GM-CSF (Kampa & Burnside, 2002) Hiện nay, protein tái tổ hợp IL-2 c s dng nh mt loọi thuc lm chỗt dén việc kích thích miễn dðch điều trð ung thư, ung thư tế bào thên, melanoma, bệnh phong, leukemia dòng T lympho làm tëng miễn dðch chủ động thể (McMillan & cs., 1995; Piscitelli & Minor, 1995; Reichert & cs., 1999; Toren & cs., 1995) Trên gà, IL-2 lỉn đỉu tiên dịng hóa xác đðnh chức nëng nëm 1997 (Sundick & GillDixon, 1997), vai trò IL-2 gà tương tự động vêt tëng hột hóa tế bào, kích thích phát triển tế bào lympho T, B kích thích vêt chủ sân sinh kháng thể chủ động chống läi tác nhân gây bệnh bệnh Newcastle cúm gia cæm (Susta & cs., 2015; Szatraj & cs., 2014) Trong nghiên cứu này, chúng tơi dịng hóa gene mã hóa cho IL-2 gà, biểu protein tái tổ hợp IL-2 gà bìng hệ thống E coli, đồng thời kiểm tra tính độc khâ nëng kích thích sân sinh số cytokines protein IL-2 tái tổ hợp tế bào dñng đäi thực bào (HD11) gà PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Plasmid pCR2.1-TA hãng Invitrogen sõn xuỗt c s dng lm vộc t tỏch dủng tế bào E coli TOP 10 (Invitrogen, Hoa Kỳ) Plasmid pET32a(+) hóng Novagen sõn xuỗt c s dng làm véc tơ biểu protein tế bào E coli BL21 (DE3) (Invitrogen, Hoa Kỳ) - Enzyme hän chế EcoRI, HindIII, DNA marker, protein thang chuèn, T4-DNA ligase, Trizol tỏch chit RNA, mụi trng nuụi cỗy t bo DMEM IPTG hãng Invitrogen (Hoa Kỳ) - Kít tách chiết protein B-PER bacterial protein extraction, cột síc khí Ni-NTA resin, mng thốm tớch SnakeSkinTM dialysis tubing, c chỗt phỏt triển mỉu Western Lightning PlusECL, tổng hợp cDNA bìng Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit hãng Thermo Science (Hoa K) - Cỏc húa chỗt, sinh phốm khỏc: khỏng th His-Taq gín HPR (Abcam, Hoa Kỳ), SYBR® Green Master Mix (Roche, Hoa Kỳ), QIAQuick gel extraction kit (QIAgen, Đức) 435 Nghiên cứu khả kích thích sinh cytokines protein tái tổ hợp Interleukin-2 tế bào đại thực bào Tế bào dñng đäi thực bào HD11 kháng thể đơn dñng kháng IL-2 (Mouse Anti-Chicken IL-2) gà c cung cỗp bi GS Yeong Ho Hong, ọi hc Chung-Ang, Hàn Quốc 2.2 Tách RNA tổng số sinh tổng hợp cDNA Méu mô lách gà bâo quân -80C c lỗy ra, nghin Nit lúng cho mn, ng nhỗt ri hũa vo dung dch Trizol (Invitrogen, Hoa Kỳ) Tách chiết RNA tinh khiết RNA theo hướng dộn ca nh sõn xuỗt Tng hp cDNA s dng 2µg RNA tổng số sử dụng kit cDNA synthesis hãng Thermo Scientific, Hoa Kỳ, theo hướng dén nh sõn xuỗt 2.3 To dũng gen IL-2 Nhõn gen kỹ thuật PCR: sử dụng 2X Dream Taq Polymeraze (Thermo Scientific, Hoa Kỳ), với cặp mồi thiết kế dựa theo trình tự gen IL-2 kích thước 429bp (Bâng 1) đëng kí Ngån hàng Dữ liệu Gen quốc tế NCBI với số đëng kí AF000631 Chu trình nhiệt kỹ thuêt PCR: hỗn hợp biến tính 94C phút, 35 chu kì gồm 94C: 30 giây, 56C: 30 giây, 72C: 30 giây 72C 10 phút Sân phèm PCR sau đò chäy điện di thäch 1,5% agarose Sân phèm PCR nhân gen IL-2 gà cò kích thước không 429bp tinh säch bìng QIAQuick gel extraction kit (QIAgen, Đức), theo hướng dén nhà sân xuỗt Sõn phốm PCR sau tinh sọch c s dụng cho phân ứng nối ghép gen Phân ứng nối ghép gen vào véc tơ tách dòng pCR 2.1-TA: Sân phèm PCR gín vào véc tơ tách dịng pCR 2.1-TA (Invitrogen, Hoa Kỳ) sau đò biến näp vào tế bào khâ biến E coli (dòng TOP10) hãng Invitrogen (Hoa Kỳ) với mục đích chọn lọc dòng tế bào mang véc tơ tách dòng pCR2.1-TA gín thêm sân phèm PCR Véc tơ tái tổ hợp tách chiết theo phương pháp Truong & cs (2016) sử dụng làm nguyên liệu để đọc trình tự Trình tự DNA tiến hành xác đðnh máy đọc 436 trình tự tự động theo hướng dộn ca nh sõn xuỗt (Gentis, Vit Nam) 2.4 Biu gen IL-2 gà hệ thống E Coli Gen IL-2 gà véc tơ täo dòng pCR2.1 c lỗy bỡng cỏch x lý plasmid pCR-2.1 bỡng hai enzyme hän chế EcoRI HindIII, đoän DNA dài khoõng 429bp cha gen IL-2 ca g c thu lỗy sau chäy điện di sân phèm cít gel agarose tinh säch bìng kit Qiaquick Gel Extraction Đoän gen thu được nối với véc tơ pET32a(+) xử lý trước đị bìng enzyme hän chế Véc tơ tái tổ hợp pET32a(+) chứa gen mã hóa cho protein lai theriodoxin với IL-2 (Trx-rchIL2) đối chứng véc tơ pET32a(+) chỵ chứa theriodoxin (Trx) biến näp vào tế bào E coli BL21 (DE3) v nuụi cỗy mụi trng LB cú b sung Amp (nồng độ cuối 100 ìg/ml) 37C Khi giỏ tr OD600 ca dch nuụi cỗy ọt 0,5; IPTG c b sung vo dch nuụi cỗy t bo với nồng độ cuối 1mM Các méu tế bào thu sau 12 sau câm ứng bìng IPTG (Invitrogen) theo phương pháp Truong & cs (2016) 2.5 Tinh khiết IL-2 protein tái tổ hợp Thu vi khn bìng cách ly tâm 3,500 vịng/phút 30 phút 4C Phá vỡ màng tế bào thu protein tổng số bìng cách sử dụng kit B-PER bacterial protein extraction reagent (Thermo Scientific) Tinh khiết protein tái tổ hợp bìng cách sử dụng cột síc khí Ni-NTA resin (Thermo Scientific) theo hng dộn ca nh sõn xuỗt Loọi bú độc tố endotoxin bìng cách sử dụng khâ nëng cån bìng điện tích thơng qua lỉn rửa bìng dung dðch rửa cò độ pH khác mơ tâ trước đị (Truong & cs., 2016) Protein tái tổ hợp đặc bìng cách sử dụng màng lọc có kích cỡ lỗ màng lọc 3kDa (EMD Millipore) Protein tái tổ hợp thu được đổi dung dðch đệm bìng PBS, pH7.2 sử dụng SnakeSkinTM dialysis tubing (Thermo Scientific) 4C qua đêm Nồng độ protein IL-2 Trương Anh Đức, Trần Thị Thanh Hà, Nguyễn Thị Huyền, Chu Thị Như, Nguyễn Thị Chinh, Hoàng Văn Tuấn, Lý Đức Việt, Đặng Vũ Hoàng, Yeong Ho Hong tái tổ hợp đo tính tốn bìng phương pháp Bradford 2.6 Kiểm tra tính đặc hiệu IL-2 phương pháp Western Blot Protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh khiết xử lý bìng đệm pha méu có 1% SDS biến tính 10 phút, chäy diện di SDSPAGE Các bëng protein quan sát sau nhuộm Coomassie blue Sau điện di gel 12,5% polyacrylamide, bëng protein chuyển sang màng PVDF Các vð trí khơng có protein màng phủ sữa loäi béo qua đêm Tiếp theo màng phủ kháng thể HisTaq gín HPR (Abcam, Hoa Kỳ) kháng thể đơn dñng IL-2 (Mouse Anti-Chicken IL-2) cuối Goat anti-Mouse IgG (H + L), HRP (Abcam, Hoa Kỳ) Phân ng hin mu vi c chỗt Western Lightning Plus-ECL (Thermo Scientific) 2.7 Đánh giá tính độc protein tái tổ hợp IL-2 tế bào dịng HD11 Tế bào dđng ọi thc bo (HD11) c cung cỗp bi GS Yeong Ho Hong, Đäi học ChungAng, Hàn Quốc Tế bào nuôi môi trường Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Invitrogen) có bổ sung thêm kháng sinh 100 IU/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin 10% huyết bào thai bê säch vụ trựng (FBS, Invitrogen) v nuụi cỗy iu kin 5% CO2 41°C Protein tái tổ hợp gây nhim trờn t no HD11 mờt nuụi cỗy 1,0 × 106 tế bào/giếng đïa tế bào giếng nồng độ 25, 50 100 ng/ml, tế bào sau gây nhiễm nuôi điều kiện 5% CO2 41°C Thu tế bào sau gây nhiễm sau 6, 12, 24 48 để đánh giá độc tính tế bào bìng MTT Cell Proliferation Assay Kit (Abcam, USA) theo hng dộn ca nh sõn xuỗt 2.8 Đánh hoạt tính protein tái tổ hợp IL-2 tế bào dòng HD11 Protein tái tổ hợp gây nhiễm trờn t no HD11 mờt nuụi cỗy 1,0 × 106 tế bào/giếng đïa tế bào giếng nồng độ 25, 50 100 ng/ml, tế bào sau gây nhiễm nuôi điều kiện 5% CO2 41°C Nồng độ protein IL-2 tái tổ hợp lựa chọn dựa thí nghiệm trước đåy chỳng tụi (pilot experiment) ó cho thỗy khõ nởng kớch hột số yếu tố kích thích miễn dðch JAK1/2, STAT1/3, ERK1/2 tế bào dñng đäi thực bào tế bào dòng T lympho Thu tế bào sau gây nhiễm sau 6, 12, 24 48 để đánh giá khâ nëng kích thích sân sinh cytokine gene bìng phương pháp qRT-PCR 2.9 Phương pháp quantitative real-time PCR (qRT-PCR) xác định biểu cytokine gen Thu thêp tế bào HD11 sau gây nhiễm, tế bào rửa qua PBS länh læn, tách chiết RNA tổng số bìng TRIzol (Invitrogen) theo hướng dén nhà sõn xuỗt Tng hp cDNA, tng s 2àg RNA c lội bó DNA bìng cách thêm vào 1,0 đơn vð (unit) DNase I v 1,0àL of 10 ì reaction buffer (Thermo Scientific), sau đò ủ 30 phút 37°C Để dừng hột động DNase I, bổ sung 1,0µL of 50mM EDTA vào dung dðch đun 65°C 10 phút Sử dụng sân phèm để tổng hợp cDNA bìng Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific), theo hng dộn ca nh sõn xuỗt ỏnh giá mức độ biểu cytokines, thiết kế mồi cho phân ứng qRT-PCR sử dụng phæn mềm Lasergene (DNASTAR, Hoa Kỳ) (Bâng 1), thực phân ứng qRT-PCR bìng cách sử dụng × Power SYBR® Green Master Mix (Roche, Hoa Kỳ), theo hướng dén ca nh sõn xuỗt Gene GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) trờn g sử dụng gene đối chứng tiêu chuèn để tính tốn mức độ biểu gene thơng qua quỏ trỡnh tiờu chuốn húa chỗt lng RNA Mc độ biểu gene tính tốn bìng phương pháp 2−Ct thông qua mức độ biểu gene đối chứng GAPDH 437 Nghiên cứu khả kích thích sinh cytokines protein tái tổ hợp interleukin-2 tế bào đại thực bào Bâng Các cặp mồi phân ứng nhân gen realtime PCR Gen GAPDH IL-2 cloning IFN- IL-6 IL-1β Trình tự cặp mồi (5′-3′) F: mồi xuôi; R: mồi ngược Mã số truy cập Genbank Tham khảo F TGCTGCCCAGAACATCATCC NM_204305 Truong & cs., 2016 R ACGGCAGGTCAGGTCAACAA F CGGAATTCATGATGTGCAAAGTACTGATCTT AF033563 Nghiên cứu R CCAAGCTTTTTGCAGATATCTCACAAAG HQ739082 Truong & cs., 2016 JQ897539 Truong & cs., 2016 NM_204524 Truong & cs., 2016 F/R F AGCTGACGACGGTGGACCTATTATT R GGCTTTGCGCTGGATTC F CAAGGTGACGGAGGAGGAC R TGGCGAGGAGGGATTTCT F TCGGGTTGGTTGGTGATG R TGGGCATCAAGGGCTACA Hình (A) Sân phẩm PCR nhân gen IL-2, DNA chuẩn 100bp; Đường chạy 1, 2: Sân phẩm PCR (B) Kết quâ cắt kiểm tra DNA plasmid enzyme EcoR I Hind III M: DNA chuẩn 100bp; Đường chạy 1, plasmid chứa gene IL-2 sau xử lý EcoR I Hind III 2.9 Xử lý số liệu Số liệu phân tích bìng phương pháp One-way ANOVA Các giá trð trung bình so sánh khác biệt bìng phương pháp Tukey’s multiple comparison test Sai khác cò ý nghïa xác đðnh với P