Nghiên cứu enzyme từ động vật không xương biển có khả năng thủy phân polysaccharide biển

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ENZYME TỪ ĐỘNG VẬT KHÔNG XƯƠNG BIỂN CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN POLYSACCHARIDE BIỂN Giảng viên hướng dẫn: ThS Lê Nhã Uyên TS Huỳnh Hoàng Như Khánh Sinh viên thực hiện: Hoàng Thị Thủy Mã sớ sinh viên: 57137099 Khánh Hồ – 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ̂ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆ̂P NGHIÊN CỨU ENZYME TỪ ĐỘNG VẬT KHÔNG XƯƠNG BIỂN CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN POLYSACCHARIDE BIỂN Giảng viên hướng dẫn: ThS Lê Nhã Uyên TS Huỳnh Hoàng Như Khánh SVTH: Hoàng Thị Thủy MSSV: 57137099 Khánh Hịa, tháng 07 /2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu enzyme từ động vật khơng xương biển có khả thủy phân polysaccharide biển” kết nghiên cứu thân tôi, kết hoàn toàn trung thực Các kết tham khảo trích dẫn tài liệu tham khảo rõ ràng công khai Nha Trang, tháng 07 năm 2019 Sinh viên thực Hoàng Thị Thủy i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực đồ án, em nhận nhiều quan tâm gia đình, thầy cơ, anh chị bạn bè Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc chân thành đến cô Th.s Lê Nhã Uyên TS Huỳnh Hồng Như Khánh tận tình hướng dẫn bảo em để hồn thành đồ án Đồng thời em cảm ơn thầy cô, anh chị Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, Đại học Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi máy móc, phịng, thiết bị để em thực đồ án Em xin cảm ơn thầy, cô hội đồng phản biện dành thời gian để đọc góp ý giúp cho em hồn thiện Do thời gian trình độ cịn hạn chế nên khơng thể tránh khỏi sai sót, em kính mong nhận đóng góp q thầy, q để đồ án hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn Nha Trang, tháng 07 năm 2019 Sinh viên thực Hoàng Thị Thủy ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC VIẾT TẮT ix MỞ ĐẦU 1 Mục tiêu đề tài 2 Nội dung đề tài Đối tượng, phạm vi khảo sát Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan rong biển 1.1.1.Giới thiệu chung rong biển 1.1.2 Phân loại rong biển 1.1.3 Sự phân bố rong 1.1.4 Vai trò ứng dụng rong biển 1.1.5 Giới thiệu rong nâu số thành phần rong nâu 1.2 Tổng quan enzyme 1.2.1 Giới thiệu chung enzyme 1.2.2 Phân loại enzyme 1.2.3 Đặc điểm cấu trúc enzyme 1.2.4 Tính đặc enzyme hiệu 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme iii 1.2.5.1 Nhiệt độ 1.2.5.2 pH 10 1.2.5.3 Nồng độ enzyme 10 1.2.5.4 Nồng độ chất 10 1.2.5.5 Chất hoạt hóa chất kìm hãm .10 1.3 Tổng quan số polysaccharide rong nâu 10 1.3.1 Fucoidan 11 1.3.1.1 Cấu trúc tính chất 11 1.3.1.2 Hoạt tính sinh học ứng dụng 12 1.3.2 Alginate 12 1.3.2.1 Cấu trúc tính chất 12 1.3.2.2 Hoạt tính sinh học ứng dụng 13 1.3.3 Laminaran 14 1.3.3.1 Cấu trúc tính chất 14 1.3.3.2 Hoạt tính sinh học ứng dụng 15 1.4 Tổng quan động vật không xương biển 16 1.4.1 Giới thiệu động vật không xương biển 16 1.4.2 Giới thiệu đối tượng nghiên cứu 17 1.5 Một số enzyme có khả chuyển hóa polysaccharide biển 19 1.5.1 Fucoidanase 19 1.5.2 Alginate lyase 20 1.5.3 Laminaranase 20 1.6 Tình hình nghiên cứu enzyme chuyển hóa polysaccharide biển 21 1.6.1 Tình hình nghiên cứu enzyme chuyển hóa polysaccharide biển giới 21 iv 1.6.2 Tình hình nghiên cứu enzyme chuyển hóa polysaccharide biển nước 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24 2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.1.2 Cơ chất 25 2.1.3 Hóa chất 25 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 26 2.2 Quy trình nghiên cứu tổng quát 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Nghiên cứu tách chiết sàng lọc động vật không xương biển có khả sinh enzyme thủy phân polysaccharide biển 28 2.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 29 2.3.2.1 Phương pháp Nelson 29 2.3.2.2 Phương pháp sàng lọc đĩa thạch 30 2.3.3 Phương pháp tinh enzyme 30 2.3.3.1 Phương pháp tinh sơ enzyme tuyển chọn 30 2.3.3.2 Phương pháp tủa muối (NH2)2SO4 31 2.3.3.3 Phương pháp thẩm tách 31 2.3.3.4 Phương pháp sắc ký 32 2.3.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein 33 2.3.5 Phương pháp xác định đặc tính xúc tác enzyme 33 2.3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 33 2.3.5.2 Ảnh hưởng pH 33 2.3.5.3 Ảnh hưởng thời gian phản ứng 34 v 2.3.5.4 Ảnh hưởng nồng độ NaCl 34 2.3.5.5 Ảnh hưởng ion kim loại II 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết sàng lọc động vật khơng xương biển sinh enzyme có khả chuyển hóa polysaccharide tách chiết từ rong biển 36 3.1.1 Các mẫu động vật không xương biển thu nhận vùng biển Nha Trang……………………………………………………………………….36 3.1.2 Kết sàng lọc khả sinh enzyme chuyển hố plysaccharide rong nâu từ mẫu động vật khơng xương biển thu 39 3.2 Kết nghiên cứu điều kiện thu nhận tinh sơ enzym tuyển chọn ……………………………………………………………………….…42 3.2.1 Kết sau chạy qua cột G25 42 3.2.2 Kết sau chạy qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose 44 3.2.3 Kết hoạt tính enzyme qua giai đoạn tinh …………… 45 3.3.Kết xác định điều kiện xúc tác enzyme tuyển chọn 46 3.3.1 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme 46 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme 47 3.3.3 Ảnh hưởng thời gian phản ứng 48 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến hoạt tính enzyme 50 3.3.5 Ảnh hưởng ion kim loại II đến hoạt tính enzyme 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ …… … 53 Kết luận 53 Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 59 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc fucoidan 11 Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo gốc M G alginate 13 Hình 1.3 Cấu trúc laminaran 15 Hình 1.4 Hàu 17 Hình 2.1 Hàu Crassostrea ariakensis 24 Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 27 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình tách chiết sàng lọc động vật khơng xương biển có khả sinh enzyme thủy phân polysaccharide biển 29 Hình 3.1 Hoạt tính chuyển hóa polysaccharide rong nâu động vật không xương biển 41 Hình 3.2 Mối quan hệ hàm lượng protein hoạt tính laminaranase phân đoạn sau qua cột G25 43 Hình 3.3 Mối quan hệ hàm lượng protein hoạt tính laminaranase phân đoạn sau qua cột DEAE-cellulose 44 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hoạt động laminaranase từ hàu Crassostrea ariakensis 46 Hình 3.5 Sơ đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động laminaranase từ loài hàu Crassostrea ariakensis 47 Hình 3.6 Sơ đồ ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính laminaranase từ loài hàu Crassostrea ariakensis 49 Hình 3.7 Sơ đồ ảnh hưởng nồng độ NaCl phản ứng đến hoạt tính laminaranase từ loài hàu Crassostrea ariakensis 50 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bảng hóa chất bản…………………………………………………25 Bảng 3.1 Danh sách mẫu động vật không xương biển nghiên cứu 36 Bảng 3.2 Kết sàng lọc khả sinh enzyme chuyển hóa polysaccharide rong nâu từ mẫu động vật không xương 40 Bảng 3.3 Tổng hợp kết tinh laminaranase từ gan, tụy hàu Crassostrea ariakensis 45 Bảng 3.4 Ảnh hưởng ion kim loại II lên hoạt tính laminaranase chiết từ hàu Crassostrea ariakensis 50 viii 27 Huynh Hoang Nhu Khanh, Bui Minh Ly, Le Quang Huan, Cao Thi Thuy Hang, Pham Duc Thinh, Ngo Thi Duy Ngoc, Phan Thi Hoai Trinh, Vo Thi Dieu Trang, Le Thi Hoa (2015) Using the colorimetric method and electrophoresis method in study of fucoidanase from marine invertebrates The Analytica Vietnam Conference: 263-269 28 Ludmylla Cunha, Ana Grenha(2016),“Sulfated Seaweed Polysaccharides as Multifunctional Materials in Drug Delivery Applications” Marine drugs 29 Mizumoto K., I Sugawara, W Ito, T Kodama, M Hayami, and S Mori (1988), Sulfated homopolysaccharides with immunomodulating activities are more potent anti-HTLV-III agents than sulfated heteropolysaccharides, Jpn, J.Exp Med., 58, 145-153 30 Paola Laurienzo (2010) Marine Polysaccharides in Pharmaceutical Applications: An Overview Marine Drungs 2010; 8(9): 2435–2465 31 Powell, J.H., Meeuse, B.J.D., (1964), “Econ Botany”, 18, pp.164 32 Qurrat-ul-Ain, Sharma S, Khuller GK, Garg SK (2003) Alginate-based oral drug delivery system for tuberculosis: Pharmacokinetics and therapeutic effects J Antimicrob Chemother 51:931–938 33 Thinh P D., Menshova R V., Ermakova S P., Anastyuk S D., Ly B M., Zvyagintseva T.N (2013), “ Structural characteristics and anticancer activity of fucoidan from the Brown alga Sargassum mcclurei”, 11, pp.1456-1476 34 Tangarone.B, J.C.Royer, J.P.Nakas (1989), “Purification and characterization of an endo-(1,3)-β-D-glucanase from Trichoderma longibrachiatum”, Applied and environmental Microbiology, vol 55, no 1, pp 177-184 57 Tài liệu internet 35 Động vật thân mềm Wikimedia (https://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90%E1%BB%99ng_v%E1%BA%AD t_th%C3%A2n_m%E1%BB%81m truy cập ngày 16/06/2019) 36 Hàu cửa sông Wikimedia (https://vi.wikipedia.org/wiki/H%C3%A0u_c%E1%BB%ADa_s%C3%B4 ng truy cập ngày 25/06/2019) 37 Hàu Wikimedia (https://vi.wikipedia.org/wiki/H%C3%A0u truy cập ngày 25/06/2019) 38 Nuôi hàu Việt Nam: Câu chuyện thành công hợp tác Quốc tế Nông nghiệp Giáo dục thời đại (04/2018) (https://giaoducthoidai.vn/thoisu/nuoi-hau-o-viet-nam-cau-chuyen-thanh-cong-ve-hop-tac-quoc-te-trongnong-nghiep-3922930.html truy cập 25/06/2019) 39 Substrate Concentration (Introduction to Enzymes) (http://www.worthington-biochem.com/introbiochem/substrateConc.html truy cập ngày 14/06/2019) 40 Effect of pH (Introduction to Enzymes) (http://www.worthingtonbiochem.com/introbiochem/effectspH.html truy cập ngày 14/06/2019) 41 Hình ảnh tải lên Alfonso Mucci, trang researchGate.net (https://www.researchgate.net/figure/The-structure-of-fucoidan-abranched-polysaccharide-sulfate-ester-with-l-fucosebuilding_fig4_9078147 truy cập ngày 27/06/2019) 42 Hình ảnh đăng Zhi-Yong Li, trang researchGeta.net (https://www.researchgate.net/figure/Structure-oflaminaran_fig5_294287292 truy cập ngày 27/06/2019) 58 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết xác định protein hoạt tính laminaranase phân đoạn sau mẫu qua cột G25 Phân đoạn qua Hàm lượng protein Hoạt tính laminaranase cột G25 ΔOD 595 ΔOD 750 0 0,023 0,071 0,008 0,071 0,261 0,27 2,92 3,72 10 11 3,99 2,96 12 2,96 13 3,73 2,86 14 3,73 2,86 15 3,24 1,772 16 1,59 1,772 17 0,31 0,226 18 0,2 0,226 19 0,19 0,218 20 0,17 0,218 59 Phụ lục 2: Kết xác định protein hoạt tính laminaranase phân đoạn sau mẫu qua cột DEAE-cellulose Phân đoạn 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 Hoạt tính laminaranase ΔOD 750 0 0,164 0,254 0,164 0,104 0,037 0,054 0,098 0 0,956 2,33 2,04 1,292 0,717 0,499 0,29 0,156 0 0 60 Hàm lượng protein ΔOD 595 0 0,134 1,531 0,951 0,263 0,114 0,075 0,006 0,054 0,018 0,054 0,224 0,673 0,622 0,391 0,217 0,233 0,296 0,226 0,163 0,177 0,151 Phụ lục 3: Kết khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt tính laminaranase mẫu hàu M7 pH 5,4 10 Đối chứng enzyme 0,037 0,041 0,034 0,039 0,064 0,073 0,077 0,11 0,045 Đối chứng chất 0,041 0,151 0,045 0,028 0,161 0,202 0,33 0,426 0,111 Lần đo 0,687 0.975 1,145 1,439 0,793 0,579 0,335 0,323 0,050 Lần đo 0,605 1,092 1,032 1,377 0,71 0,507 0,436 0,422 0,118 Lần đo 0,572 1,077 1,018 1,402 0,834 0,518 0,42 0,426 0,082 Trung bình 0,621 1,048 1,065 1,406 0,779 0,535 0,397 0,390 0,083 ∆OD 750 0,543 0,856 0,986 1,339 0,554 0,260 0,000 0,000 0,000 Độ lệch chuẩn 0,048 0,052 0,057 0,025 0,060 0,032 0,044 0,048 0,028 Phụ lục 4: Kết khảo sát nhiệt độ tối ưu laminaranase chiết từ loài hàu M7 Nhiệt độ 4oC 25oC 30oC 37oC 40oC 50oC 60oC Đối Đối chứng chứng enzyme chất 0,033 0,141 0,025 0,036 0,027 0,048 0,034 0,049 0,037 0,022 0,029 0,241 0,034 0,052 Lần đo 0,197 0,732 0,961 1,453 0,918 0,431 0,031 Lần đo 0,245 0,812 1,079 1,398 0,829 0,385 0,02 61 Lần đo 0,144 0,715 1,016 1,372 0,899 0,357 0,044 Trung bình 0,195 0,753 1,019 1,408 0,882 0,391 0,032 ΔOD 750 0,021 0,692 0,944 1,325 0,823 0,121 0,00 Độ lệch chuẩn 0,041 0,042 0,048 0,034 0,038 0,031 0,010 Phụ lục 5: Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hoạt tính laminaranase từ lồi hàu M7 Đối Thời Đối chứng gian chứng ủ(phút) enzyme chất 0,033 0,109 0,019 0,095 10 0,021 0,057 15 0,037 0,101 20 0,036 0,092 30 0,021 0,076 40 0,026 0,084 50 0,017 0,109 60 0,028 0,058 120 0,037 0,114 180 0,033 0,084 240 0,037 0,088 300 0,031 0,073 Lần đo 0,039 0,824 0,983 1,163 1,278 1,428 1,522 1,568 1,406 1,528 1,48 1,434 1,468 Lần đo 0,056 0,707 0,979 1,204 1,311 1,508 1,505 1,488 1,501 1,459 1,517 1,495 1,363 62 Lần đo 0,032 0,784 0,907 1,251 1,399 1,34 1,378 1,439 1,423 1,521 1,435 1,413 1,47 Trung bình 0,042 0,772 0,956 1,206 1,309 1,425 1,468 1,498 1,443 1,503 1,477 1,447 1,434 ΔOD 750 0,000 0,658 0,878 1,068 1,181 1,328 1,368 1,376 1,357 1,352 1,360 1,322 1,330 Độ lệch chuẩn 0,010 0,049 0,035 0,036 0,025 0,069 0,064 0,053 0,041 0,031 0,034 0,035 0,050 Phụ lục 6: Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến hoạt tính laminaranase từ loài hàu M7 Đối Đối chứng Nồng chứng độ enzyme chất 0,066 0,031 50 0,063 0,029 100 0,04 0,027 150 0,045 0,028 200 0,025 0,037 250 0,037 0,031 300 0,029 0,021 Lần đo 0,908 0,901 0,951 0,963 1,009 0,972 0,948 Lần đo 0,896 0,93 0,926 0,972 0,964 0,97 0,935 Lần đo 0,901 0,919 0,947 0,976 0,914 0,966 0,943 Trung bình 0,902 0,917 0,941 0,970 0,962 0,969 0,942 ΔOD 750 0,805 0,825 0,874 0,897 0,900 0,901 0,892 Độ lệch chuẩn 0,005 0,012 0,011 0,005 0,039 0,002 0,005 Phụ lục 7:Ảnh hưởng ion kim loại II lên hoạt tính laminaranase từ Hàu M7 Đối chứng CaCl2 MgCl2 CuSO4 BaSO4 FeSO4 MnSO4 Đối chứng Enzyme Đối chứng chất Lần đo Lần đo Lần đo Trung bình ΔOD750 Độ lệch chuẩn (%) 0,026 0,024 0,026 0,023 0,035 0,026 0,026 0,087 0,773 0,779 0,737 0,084 0,895 0,906 0,881 0,089 0,921 0,915 0,926 0,079 0,180 0,156 0,251 0,057 0,702 0,738 0,670 0,101 0,685 0,599 0,643 0,027 0,460 0,398 0,387 0,763 0,650 0,894 0,786 0,921 0,806 0,196 0,094 0,703 0,611 0,642 0,515 0,415 0,362 0,019 0,010 0,004 0,040 0,028 0,035 0,032 63 Phụ lục 8: Chuẩn bị đệm có pH=3; 4; 5; 5,4;6 ; 7; 8: 1- Pha đệm acetate 0,2M (pH=3, pH=4 pH=5) - Pha dung dịch CH3COOH 0,2M: Lấy 2,31ml CH3COOH, định mức nước cất đến 200ml - Pha dung dịch CH3COONa 0,2M: Cân 3,28g CH3COOH hòa tan nước cất đến 200ml + Pha đệm acetate 0,2M pH 3, cách dùng dung dịch CH3COONa để điều chỉnh pH CH3COOH 2- Pha đệm succinate 0,2M (pH=5,4): - Cân 11,8g succinic acid, thêm nước cất đến 400ml khuấy tan Điều chỉnh pH=NaOH 1M (sử dụng khoảng 82ml NaOH), thêm nước cất đến 500ml 3- Pha đệm Tris HCl 0,2M có pH= 6;7;8 - Cân 4,84g Tris (hydroxymethyl) aminomethane, thêm nước cất đến 200ml Điều chỉnh pH đệm pH 6;7;8 HCl Phụ lục 8: Chuẩn bị thuốc thử Nelson: 1- Nelson A (pha 500ml) - Na2CO3: 12,5g - KNaC4H4O6.4H2O: 16g - NaHCO3: 10g - Na2SO4: 10g - Thêm nước cất đủ: 500ml 2- Nelson B (pha 100ml) - CuSO4.5H2O: 15% - Thêm nước cất đủ 100ml - Nhỏ giọt H2SO4 3- Nelson C - Dung dịch 1: NH4Mo7O24.4H2O: 16,5g thêm nước cất đủ 300ml 64 - Dung dịch 2: Na2HASO4: 4,7g, thêm nước cất đủ 25ml Thêm 42ml H2SO4 dung dịch khó tan - Trộn dung dịch dung dịch thêm nước cất đến đủ 500ml Ủ 37oC ngày Phụ lục 9: Pha thuốc thử Bradford: Cân 0,05g Coomassie Brilliant Blue Lấy 25ml Ethanol, 50ml Acid Phụ lục 10: Dựng đường chuẩn D-glucose: - Cân 5mg D-glucose cho vào 5ml nước cất khuấy tan, ta dung dịch mẹ nồng độ 1mg/ml (stock) - Pha loãng với nước cất nồng độ 0; 20; 40; 60; 80; 100; 150; 200 μg/ml (mỗi ống 10ml) Bảng P1 Bảng pha loãng nồng độ: μg/ml 20 40 60 80 100 150 200 Stock (ml) H2O (ml) 10 0,2 9,8 0,4 9,6 0,6 9,4 0,8 9,2 1,5 8,5 Ở nồng độ hút 300μl dịch thêm 300μl Nelson A+B mix, đem đun cách thủy 10 phút để nguội thêm 300μl Nelson C Thêm 9ml nước cất, đo OD bước sóng 750nm ta có kết Bảng P2 65 Bảng P2 Kết đo OD750 Nồng độ 20 40 60 80 100 150 200 Lần 0,026 0,183 0,277 0,433 0,523 0,568 0,846 1,093 Lần 0,022 0,186 0,275 0,458 0,525 0,594 0,829 1,013 Lần 0,027 0,183 0,277 0,436 0,521 0,597 0,728 1,008 Trung bình 0,025 0,184 0,276 0,442 0,523 0,586 0,801 1,038 ΔOD750 0,025 0,159 0,251 0,417 0,498 0,561 0,776 1,013 Độ lệch chuẩn 0,003 0,002 0,001 0,014 0,002 0,016 0,064 0,048 Từ Bảng P2 có đường chuẩn D-glucose Hình P1: Đồ thị biểu diễn đường chuẩn D-glucose Phụ lục 11: Dựng đường chuẩn albumin - Cân 5mg albumin cho vào 5ml nước cất khuấy tan, ta dung dịch mẹ nồng độ 1mg/ml (stock) - Pha loãng với nước cất nồng độ 0; 20; 40; 60; 80; 100; 150; 200 250 μg/ml (mỗi ống 10ml) 66 Bảng P3 Bảng pha loãng nồng độ: μg/ml 20 40 60 80 100 150 200 Stock (ml) H2O (ml) 10 0,2 9,8 0,4 9,6 0,6 9,4 0,8 9,2 1,5 8,5 Ở nồng độ hút 1ml dịch vào 2ml thuốc thử Bradford mix đều, để nhiệt độ phịng 10 phút Đo OD bước sóng 595nm ta có kết Bảng P4 Bảng P4 Kết đo OD595 Nồng độ Đo lần Đo lần Đo lần 20 40 60 80 100 150 200 250 0,628 0,69 0,725 0,738 0,758 0,786 0,855 0,946 1,03 0,63 0,684 0,73 0,74 0,759 0,789 0,851 0,95 1,025 0,63 0,692 0,725 0,738 0,754 0,786 0,855 0,943 1,028 67 Trung bình 0,629 0,689 0,727 0,739 0,757 0,787 0,854 0,946 1,028 ΔOD595 0,629 0,059 0,097 0,109 0,128 0,158 0,224 0,317 0,398 Độ lệch chuẩn 0,115 0,416 0,289 0,115 0,265 0,173 0,231 0,351 0,252 Từ bảng P4 ta có đường chuẩn albumin: Hình P2: Đồ thị biểu diễn đường chuẩn albumin 68 Một sớ hình ảnh q trình thực đề tài: Hình hoạt tính thủy phân polysaccharide biển động vật không xương biển chất fucoidan Hình máy đo quang phổ spectro UV-2505 69 Hình máy ly tâm tớc độ cao Hình kiểm tra protein phân đoạn enzyme thu sau sắc ký cột 70 Hình ảnh thẩm tách enzyme qua màng Hình ảnh đo hoạt tính enzyme phương pháp Nelson 71 ... nghiên cứu enzyme chuyển hóa polysaccharide có nhiều cơng trình thành cơng Trong nghiên cứu phân bố enzyme thủy phân fucoidan động vật không xương biển động vật không xương biển Việt Nam có khả. .. hay động vật không xương sống biển dễ dàng Với lý nêu trên, thực đề tài: ? ?Nghiên cứu enzyme từ động vật khơng xương biển có khả thủy phân polysaccharide biển? ?? Mục tiêu đề tài Tìm kiếm lồi động vật. .. biển phân bố rộng rãi động vật không xương biển [5],[7] Vì vậy, việc nghiên cứu enzyme từ sinh vật biển nói chung động vật khơng xương biển nói riêng theo định hướng phân cắt polysaccharide có