Nghiên cứu bào chế và đánh giá sinh khả dụng nang fenofibrat

LỜI CẢM ƠN 0 CHỮ VIẾT TẮT 0 ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 3

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

PGS.TS Phạm Ngọc BùngTh.s Võ Quốc ánh

Là những ngời thầy đã tận tình hớng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này Chính sự quan tâm chỉ bảo của các thầy là nguồn động viên lớn đối với tôi trong quá trình làm thực nghiệm.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới:

Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học và các thầy cô giáo ờng Đại học Dợc Hà Nội đã dìu dắt tôi trong những năm học vừa qua.

tr-Các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Vật lý- Hóa lý, bộ môn Bào chế, bộ môn Dợc lý, bộ môn Dợc lâm sàng và phòng thí nghiệm trung tâm đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, ngời thân và bạn bè đã luôn ủng hộ và quan tâm để tôi có đợc kết quả nh ngày hôm nay.

Hà Nội, ngày 28 tháng 12 năm 2009Thái Minh Dũng

Tỷ lệ % của fenofibrat so với n– ớc 56

Nồng độ của NaLS trong môi tr– ờng n ớc 56

Tỷ lệ % của hỗn hợp SP so với fenofibrat.– 56

2 Đã xác định đ ợc công thức tối u bào chế vi hạt fenofibrat bằng ph ơng pháp đông tụ từ nhũ t ơng đảm bảo giải phóng d ợc chất nhanh và gần nh hoàn toàn Độ hòa tan của fenofibrat từ vi hạt ở môi tr ờng NaLS 1,5% sau 10 phút là 84,6%, và sau 30 phút là 96,8% 56

3 Đã bào chế đ ợc viên nang fenofibrat hàm l ợng 200mg từ vi hạt fenofibrat có độ hoà tan trong môi tr ờng NaLS 1,5% t ơng đ ơng so với viên đối chiếu: - Sau 10 phút: 78,3% 56

- Sau 30 phút: 94,7% 56

Tài liệu tham khảo 57

Tài liệu tiếng việt 57

1 Bộ môn bào chế (2005), sinh d“ ợc học bào chế Tài liệu sau đại học , tr–” ờng đại học d ợc hà nội, tr 5 33, 111 143.–– 57

2 Bộ môn miễn dịch Sinh lý bệnh học, tr– ờng đại học y hà nội, Sinh lý bệnh học ,“” NXB Y học, tr 87 88.– 57

3 D ợc th quốc gia (2002), NXB Y học, tr 454 455.– 57

4 MIMS VIETNAM 25 (2005), tr 262 263.– 57

5.Nguyễn văn Long (1993), Một số về hệ phân tán rắn và ứng dụng trong kỹ thuật“bào chế các dạng thuốc rắn , tạp chí d” ợc học 6, tr 10 14.– 57

Tài liệu tiếng anh 57

7 Athyros V.G., Papageorgiou A.A., Athyrou V.V (2002), Atorvastatin and micronized fenofibrate alone and in combination in type 2 diabetes with combined hyperlipidemia Clin Ther 24(12):2022-50 57

8 Backes JM, Gibson CA, Ruisinger JF, Moriarty PM (2007), Fibrates: what have we learned in the past 40 years?, Prev Cardiol 10(1):7-8 57

24 Jacobson TA, Zimmerman FH (2006), Fibrates in combination with statins in the management of dyslipidemia, Expert Opin Drug Saf 5(1):145-56 59

38 Tokuno A., Hirano T., Hayashi T (2007), The effects of statin and fibrate on lowering small dense LDL- cholesterol in hyperlipidemic patients with type 2 diabetes, Adv Drug Deliv Rev May 3rd 60

FB

Acid fenofibricSP

Hỗn hợp NaLS và PEG tỷ lệ 1 : 5AUC(Area Under the Curve)

Diện tích dới đờng congCmax

Nồng độ đỉnhTmax

Thời gian đạt nồng độ đỉnht1/2

thời gian bán thảiPEG

Polyethylen glycolPVP

Polyvinyl pyrolidoneSKD

Sinh khả dụng

LDL (Low Density Lipoprotein)

Lipoprotein tû träng thÊp

HDL (Hight Density Lipoprotein)

Lipoprotein tû träng caoVLDL (Very Low Density

Lipoprotein tû träng rÊt thÊpLipoprotein)

HPLC (Hight Potency Liquid

S¾c ký láng hiÖu n¨ng caoChromatoraphy)

Natri lauryl sulfatLM 200

Lipanthyl 200 MNBC

Nang bµo chÕ chøa 200 mg vih¹t

fenofibrate

danh mục sơ đồ, bảng biểu

Độ hoà tan (%) 32

D90 32

Tỷ lệ % của fenofibrat so với n– ớc 56

Nồng độ của NaLS trong môi tr– ờng n ớc 56

Tỷ lệ % của hỗn hợp SP so với fenofibrat.– 56

2 Đã xác định đ ợc công thức tối u bào chế vi hạt fenofibrat bằng ph ơng pháp đông tụ từ nhũ t ơng đảm bảo giải phóng d ợc chất nhanh và gần nh hoàn toàn Độ hòa tan của fenofibrat từ vi hạt ở môi tr ờng NaLS 1,5% sau 10 phút là 84,6%, và sau 30 phút là 96,8% 56

3 Đã bào chế đ ợc viên nang fenofibrat hàm l ợng 200mg từ vi hạt fenofibrat có độ hoà tan trong môi tr ờng NaLS 1,5% t ơng đ ơng so với viên đối chiếu: - Sau 10 phút: 78,3% 56

- Sau 30 phút: 94,7% 56

Tài liệu tham khảo 57

Tài liệu tiếng việt 57

1 Bộ môn bào chế (2005), sinh d“ ợc học bào chế Tài liệu sau đại học , tr–” ờng đại học d ợc hà nội, tr 5 33, 111 143.–– 57

2 Bộ môn miễn dịch Sinh lý bệnh học, tr– ờng đại học y hà nội, Sinh lý bệnh học ,“” NXB Y học, tr 87 88.– 57

3 D ợc th quốc gia (2002), NXB Y học, tr 454 455.– 57

4 MIMS VIETNAM 25 (2005), tr 262 263.– 57

5.Nguyễn văn Long (1993), Một số về hệ phân tán rắn và ứng dụng trong kỹ thuật“bào chế các dạng thuốc rắn , tạp chí d” ợc học 6, tr 10 14.– 57

Tài liệu tiếng anh 57

7 Athyros V.G., Papageorgiou A.A., Athyrou V.V (2002), Atorvastatin and micronized fenofibrate alone and in combination in type 2 diabetes with combined hyperlipidemia Clin Ther 24(12):2022-50 57

8 Backes JM, Gibson CA, Ruisinger JF, Moriarty PM (2007), Fibrates: what have we learned in the past 40 years?, Prev Cardiol 10(1):7-8 57

24 Jacobson TA, Zimmerman FH (2006), Fibrates in combination with statins in the management of dyslipidemia, Expert Opin Drug Saf 5(1):145-56 59

38 Tokuno A., Hirano T., Hayashi T (2007), The effects of statin and fibrate on lowering small dense LDL- cholesterol in hyperlipidemic patients with type 2

diabetes, Adv Drug Deliv Rev May 3rd 60

Bảng 3.1.2 Độ tan của FB .

Bảng 3.1.3 Trạng thái tập hợp của hệ nóng chảy FB – tá dợc 31

Bảng 3.1.4 Bảng kích thớc tiểu phân khi thay đổi chất nhũ hoá

Bảng 3.1.5 Bảng công thức xác định các yếu tố ảnh hởng .

Bảng 3.1.6 Kết quả khảo sát độ hoà tan (%) củaFB từ các mẫu .

Bảng 3.1.7 Các mức và khoảng biến thiên biến độc lập .

Bảng 3.1.8 Các công thức thực nghiệm đợc xây dựng theo mô hình .

Bảng 3.1.9 Giá trị của các biến đầu ra tơng ứng .

Bảng 3.1.10 Bảng hệ số của phơng trình hồi quy

Bảng 3.1.11 Các điều kiện của bài toán tối u .

Bảng 3.1.12 Độ hoà tan (%) của FB từ các mẫu ở môi trờng NaLS 1,5% .

Bảng 3.1.13 Độ hoà tan (%) của FB từ các mẫu ở môi trờng NaLS 1%

Bảng 3.1.14 Hàm lợng (%) của FB từ các mẫu thử độ ổn định 43

Bảng 3.1.15 Độ hoà tan (%) của FB từ các mẫu ở môi trờng NaLS 1,5% .

Bảng 3.1.16 Độ hòa tan của FB từ các mẫu trong môi trờng NaLS 1% .

Bảng 3.2.1 Nồng độ FA tơng ứng với các diện tích píc

Bảng 3.2.2 Độ lặp lại của phơng pháp định lợng .

Bảng 3.2.3 Độ đúng của phơng pháp định lợng .

Bảng 3.2.4 Hiệu suất chiết FA từ huyết tơng .

Bảng 3.3.1 Nồng độ FA trong huyết tơng của từng cá thể khi uống NBC và LM 200

Bảng 3.3.2 Giá trị AUC0-24, AUC0-∞, Cmax,Tmax, t 1/2hấp thu FA từ các cá thể .

Bảng 3.3.3 Khoảng tin cậy ở mức 90% của tỷ lệ các thông số dợc động học

ĐặT VấN Đề

Tăng lipid máu là bệnh rối loạn chuyển hoá, và là một trong những nguyên nhân gây ra các biến chứng nghiêm trọng nh: Xơ vữa động mạch, đái tháo đ-ờng, gan nhiễm mỡ Nguyên nhân gây tăng lipid máu có liên quan đến chế độ ăn, thói quen sinh hoạt, luyện tập, và có xu hớng ngày càng tăng trong xã hội phát triển.

Fenofibrat là dẫn chất mới nhất thuộc nhóm acid fibric, đợc đa vào sử dụng năm 1990 và đợc FDA chấp nhận dùng cho điều trị chứng tăng lipid máu vào năm 1998 Fenofibrat có nhiều u điểm vợt trội so với các dẫn chất cùng nhóm, tần suất và cờng độ tác dụng phụ thấp, có thể phối hợp với các thuốc thuộc nhóm statin trong điều trị chứng tăng lipid[13], [39], [7] Hiện nay fenofibrate là một trong những thuốc hạ lipid máu đợc kê đơn nhiều nhất.

Tuy nhiên sinh khả dụng của fenofibrat thờng rất thấp và không ổn định do độ hoà tan kém Những tác dụng phụ hay gặp của Fenofibrate tuy không nghiêm trọng nhng gây khó chịu cho bệnh nhân với tần suất tơng đối cao, có thể lên tới 5,5% Đây cũng là nguyên nhân chủ yếu phải ngừng thuốc của bệnh nhân Việc giảm liều dùng của thuốc sẽ làm giảm sự biến động của sinh khả dụng và nồng độ thuốc trong máu, nhờ đó có thể giảm đợc các tác dụng không mong muốn của thuốc.

Trên thế giới, nhiều tác giả đã công bố kết quả nghiên cứu về các giải pháp bào chế làm tăng độ hòa tan của dợc chất fenofibrat nhằm mục đích tăng sinh khả dụng và giảm tác dụng phụ của thuốc Kết quả nghiên cứu sinh khả dụng fenofibrate của các dạng bào chế khác nhau cho thấy độ hòa tan có ảnh hởng quyết định đến sinh khả dụng và liều dùng của thuốc Khi độ hòa tan của fenofibrat tăng, liều dùng đợc giảm từ 300mg/ngày xuống còn 200mg/ngày, và 160mg/ngày.

Hiện nay, ở Việt nam chúng tôi cha thấy có công trình nghiên cứu nào về kỹ thuật bào chế và sinh khả dụng của fenofibrat đợc công bố Vì vậy chúng tôi

thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá sinh khả dụng nang fenofibrat” với hai mục tiêu sau:

-Lựa chọn đợc biện pháp tăng khả năng hòa tan fenofibrat, từ đó bào chế đợc nang fenofibrat 200mg có độ hòa tan tơng đơng nang Lipanthyl 200M của Pháp.

-Đánh giá và so sánh đợc sinh khả dụng in vivo của nang bào chế đợc và thuốc đối chiếu là nang Lipanthyl 200M trên chó thí nghiệm.

Chơng I

tổng quan

1.1 Độ tan và các yếu tố ảnh hởng đến độ hoà tan của dợc chất

Độ tan của một chất trong dung môi đợc định nghĩa là số ml dung môi cần thiết để hoà tan 1g chất đó thành dung dịch bão hoà.

Có nhiều yếu tố ảnh hởng đến độ hoà tan của dợc chất, trong đó có những yếu tố thuộc về bản thân dợc chất [1].

- Dạng kết tinh hay dạng vô định hình: trạng thái vật lý có ảnh hởng đến

độ tan và độ bền của dợc chất Dạng kết tinh có cấu trúc mạng lới tinh thể tơng đối bền vững do đó khó hòa tan hơn dạng vô định hình Cùng một liều dợc chất, nhng dạng vô định hình do dễ hòa tan hơn nên có khả năng tạo ra SKD cao hơn dạng kết tinh Tuy nhiên dạng kết tinh lại có độ bền hơn dạng vô định hình.

- Hiện tợng đa hình: dợc chất có thể kết tinh ở nhiều dạng tinh thể khác

nhau tùy theo điều kiện kết tinh Các dạng kết tinh khác nhau có đặc tính hoà tan khác nhau Thờng thì dạng kết tinh không bền dễ tan hơn dạng bền, do đó khi chế thành dạng bào chế, sẽ có SKD cao hơn Tuy nhiên, trong quá trình bảo quản, dạng không bền có thể chuyển thành dạng bền làm giảm SKD của thuốc.

- Hiện tợng hydrat hoá: tuỳ điều kiện kết tinh, dợc chất có thể tồn tại ở

dạng khan hoặc dạng tinh thể ngậm nớc Thông thờng dạng khan có độ hoà tan tốt hơn dạng ngậm nớc, cho nên sẽ đợc hấp thu nhanh hơn Trong quá trình sản suất và bảo quản có thể làm cho dạng này chuyển sang dạng khác dẫn đến thay đổi SKD của thuốc.

-Kích thớc tiểu phân:

Kích thớc tiểu phân có ảnh hởng lớn đến tốc độ hoà tan của dợc chất, đặc biệt là dợc chất ít tan Quá trình hoà tan của dợc chất đợc Noyes và Withney l-ợng hoá bằng phơng trình: [1]

v = K.A.(Cs-Ct).v: tốc độ hoà tan.

K: hằng số tốc độ hòa tan.

A: diện tích bề mặt tiếp xúc của dợc chất với môi trờng hòa tan.Cs: độ tan bão hoà của dợc chất.

Ct: nồng độ chất tan trong dung dịch ở thời điểm t.

Từ phơng trình trên cho ta thấy, tốc độ hòa tan của dợc chất phụ thuộc vào bề mặt tiếp xúc giữa chất tan và môi trờng hòa tan Để tăng tốc độ hoà tan của dợc chất trong dung môi nhất định chúng ta có thể có thể tăng A bằng cách giảm kích thớc tiểu phân Phơng pháp giảm kích thớc tiểu phân ít thay đổi về đặc tính lý hoá và ít ảnh hởng đến độ bền của dợc chất Hiện nay, nhiều dợc chất đã đợc dùng dới dạng bột siêu mịn nh: các corticoid, FB, griseofulvin

1.2 Biện pháp làm tăng độ hoà tan của dợc chất ít tan

1.2.1 Thay đổi kích thớc tiểu phân và dạng thù hình của dợc chất

Kích thớc tiểu phân:

Kích thớc tiểu phân có ảnh hởng rất lớn đến tốc độ hoà tan cũng nh độ tan của dợc chất ít tan Tốc độ hoà tan của một chất có liên quan tới cấu trúc hoá học và tỉ lệ thuận với diện tích bề mặt của chất tan [1] Muốn tăng diện tích bề mặt của chất tan thì phải giảm kích thớc tiểu phân.

Các biện pháp làm giảm kích thớc tiểu phân: - Nghiền:

Nghiền cơ học: có u điểm là đơn giản, năng suất cao Tuy nhiên bột thu ợc lại có độ mịn không cao và ma sát sinh ra trong quá trình nghiền lớn dễ làm hỏng dợc chất.

đ-Nghiền keo: cho bột mịn Tuy nhiên thiết bị đắt, không sẵn có, năng suất thấp, ảnh hởng đến độ bền của dợc chất do phải tiếp xúc với nớc.

Nghiền khí động học: cho bột có độ mịn cao, đảm bảo ít thay đổi về tính chất lý hoá của dợc chất Tuy nhiên thiết bị đòi hỏi hiện đại và tốn kém.

- Thay đổi dung môi (kết tinh lại) - Thay đổi điều kiện kết tinh.

Chất mang trong hệ phân tán rắn:

Các chất mang thờng dùng trong hệ phân tán thờng là các polymer thân ớc nh các PEG, PVP, PVA, các dẫn chất của cellulose nh methylcellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose

n-Phơng pháp này làm tăng đáng kể độ tan và tốc độ hoà tan của dợc chất ít tan trong nớc, tăng độ ổn định của dợc chất từ đó làm tăng SKD của chúng.

1.2.3 Dùng các chất diện hoạt

Dợc chất ít tan thờng có bề măt sơ nớc, khó thấm nớc Vì vậy khi xây dựng quy trình bào chế cho các dợc chất ít tan cần có các biện pháp cải thiện tính thấm của dợc chất, làm bề mặt dợc chất có khả năng thấm nớc tốt hơn Có nhiều biện pháp để tăng tính thấm của dợc chất nh: dùng chất diện hoạt, thêm tá dợc độn thân nớc, … [1] Trong đó phơng pháp dùng chất diện hoạt là một phơng pháp hay dùng.

Khi dùng ở nồng độ thấp chất diện hoạt phân tán trên bề mặt dợc chất,

làm giảm sức căng bề mặt của dợc chất và dung môi giúp dợc chất dễ hoà tan hơn Nếu nồng độ tăng lên đến ngỡng tạo micell, các phân tử hoặc tiểu phân chất tan đợc phân tán, hấp thu vào trong cấu trúc micell hoặc vào giữa các lớp micell, các phân tử chất tan sẽ không tham gia vào cân bằng của dung dịch ở trạng thái bão hoà, do vậy có thể tăng độ tan.

Sự có mặt của chất diện hoạt ở một nồng độ nhất định làm giảm tốc độ tháo rỗng của dạ dày và tăng hấp thu của dợc chất [1].

1.2.4 Các biện pháp khác:

Ngoài ra để làm tăng khả năng hoà tan của dợc chất ngời ta cũng có thể thay thế dạng base hay dạng acid ít tan bằng dạng muối tơng ứng, sử dụng tá d-ợc đệm,

Tuy nhiên để làm tăng độ hoà tan của dợc chất chúng ta không chỉ dùng đơn lẻ một phơng pháp mà nên phối hợp nhiều phơng pháp.

1.3 Tổng quan về bệnh tăng lipid máu

1.3.1 Một số nguyên nhân gây tăng lipid máu [2]

- Tăng lipid máu sinh lý

Gặp sau bữa ăn, triglycerid tăng sớm và cao nhất, sau đó là phospholipid, cuối cùng là cholesterol Lipid tăng sau khi ăn thờng ở dạng hạt nhỏ làm huyết tơng đục.

Tăng lipid máu do huy động: khi tốc độ huy động cao hơn bình thờng, hầu hết các trờng hợp có vai trò của hormon.

Mô Mỡ

Ăn Lipid máu Vận chuyển ở máu

Tổng hợp từ glucid Tiêu thụ ( ở tế bào) (gan, mô mỡ)

Tạo thể ceton chu trình Kreb (tại gan) (các tế bào)

Cân bằng lipid

Trong trờng hợp u năng một số tuyến (yên, giáp, thợng thận, hoặc khi tiêm adrenalin, corticoid ) đều có tăng lipid máu vì chúng hoạt hoá enzym lipase ở mô mỡ.

Tăng huy động còn gặp khi nguồn năng lợng glucose tỏ ra không đảm bảo nhu cầu: khi đói, trong sốt , bệnh tiểu đờng

Do giảm sử dụng và chuyển hoá: cũng làm tăng lipid huyết Gặp trong một số bệnh gan: viêm gan cấp, vàng da tắc mật, ngộ độc rợu

- Tăng lipid máu do gia đình: do một gen trội.

1.3.2 Hậu quả

Tăng lipid máu ngắn hạn không gây hậu quả gì nghiêm trọng nhng nếu tăng kéo dài có thể gây ra một số hậu quả nh: xơ vữa động mạch, huyết khối tắc mạch, tai biến mạch máu não [2].

1.3.3 Phơng pháp điều trị chứng tăng lipid máu

- Điều chỉnh bằng chế độ ăn ít chất béo trong vòng 2- 3 tháng.- Tăng cờng hoạt động thể dục: làm tăng HLD-cholesterol.

- Dùng thuốc: khi 2 phơng pháp trên không có hiệu quả Dùng thuốc thờng kết hợp với chế độ ăn Các thuốc dùng để điều trị chứng tăng lipid máu gồm có: + Các dẫn chất của acid fenofibric.

+ Các dẫn chất của statin.

+ Resin (cholestypamin, colestipol), acid Nicotinic (Niacin).

Thông qua việc hoạt hoá PPARII (Peroxisome Proliferator Activated Receptor type II), FA làm tăng phân huỷ lipid và loại trừ các tiểu phân giàu triglycerid khỏi huyết tơng nhờ hoạt hoá lipoprotein lipase và giảm sản xuất apoprotein CIII, tăng tổng hợp apoprotein AI và AII Từ đó làm giảm đợc các thành phần gây xơ vữa động mạch dẫn nh: làm giảm LDL (chủ yếu LDL nhỏ nặng), giảm VLDL và tăng HDL Trong các thử nghiệm lâm sàng, FB làm giảm cholesterol toàn phần 20-25%, giảm trigliceride 40-55% và tăng HDL 10-30% [3], [4], [27].

FB đợc điều trị tăng lipid huyết tuýp IIa, IIb, III, IV, V cùng với một chế độ ăn hạn chế về lipid [3] Quá trình điều trị FB phải liên tục Tác dụng điều trị của FB tăng lên khi phối hợp với những chất ức chế HMG-Co Reductase (nh các dẫn chất của statin), hay phối hợp với ezetimibe [26].

Ngoài ra FB còn có những tác dụng khác nh: Làm chậm sự tiến triển của chứng xơ vữa động mạch ở bệnh nhân đái tháo đờng tuýp II [26] Có thể làm tăng creatinin và homocystein nhng nó không có liên hệ với việc tăng nguy cơ với những triệu chứng lâm sàng của bệnh suy thận [12]

- Điều trị tăng lipoprotein máu thứ phát nếu tình trạng này tồn tại dai dẳng dù đã điều trị bệnh lý nguyên phát (rối loạn lipid máu trong đái tháo đờng) [3],

- Fenofibrat Domesco (100 mg).Liều dùng:

- Ngời lớn: nên đi kèm với chế độ ăn kiêng Uống 1 viên Lipanthyl 200M/ngày (trong bữa ăn chính) hoặc 1 viên Lipanthyl Supra 160 mg/ngày hoặc 3 viên 100 mg/ngày.

- Trẻ em > 10 tuổi: Có thể điều trị kết hợp với chế độ ăn đợc kiểm soát chặt chẽ 3 tháng Liều tối đa khuyên dùng là 5mg/kg/ngày.

1.5 Một số nghiên cứu về fenofibrat

1.5.1 Các đặc tính của fenofibrat

Các dẫn chất của acid fibric là một nhóm thuốc quan trọng và đợc sử dụng rộng rãi trong điều trị tăng lipid máu từ những năm 1960 [8] Thuộc nhóm dẫn chất này có clorfibrat đợc dùng rộng rãi từ những năm 1970, gemfibrozil đợc giới thiệu vào những năm 1980 đợc xem là một bớc tiến mới trong điều trị lipid máu Tuy nhiên, do tác dụng phụ gặp phải với một tần suất tơng đối cao đặc biệt là sự nghi ngờ về ảnh hởng trên thận và sự tơng tác dợc động học với nhóm statin làm giảm phạm vi sử dụng của các hoạt chất này [12].

FB là hoạt chất mới nhất thuộc nhóm acid fibric FB ra đời vào năm 1975, đợc đa vào sử dụng những năm 1990 đã và đợc FDA chấp nhận năm1998 FB có nhiều u điểm hơn hẳn các dẫn chất khác về tần suất và cờng độ của các tác dụng phụ gặp phải, đặc biệt không có tơng tác dợc động học với các dẫn chất thuộc nhóm statin [12], [24], [38], [9] Vì vậy có thể phối hợp FB và các dẫn

chất thuộc nhóm statin để tăng hiệu quả điều trị [13], [39], [7]

Ngoài tác dụng làm giảm triglycerid, LDL-C(cholesteron xấu), cholesterol toàn phần (TC) và apolipoprotein B, fenofibrat còn tăng đáng kể HDL-C (cholesteron tốt) và apolipoprotein A [21], [31], [35], [38] FB còn có tác dụng rất tốt trong việc điều trị và phòng ngừa các biến chứng tim mạch đối với các bệnh nhân đái tháo đờng tuýp II [8], [26] Vì các lợi điểm vợt trội, hiện nay FB đợc dùng rất phổ biến và là một trong những thuốc hạ mỡ máu đợc kê đơn nhiều nhất.

FB là dạng tiền thuốc, có khả năng hấp thu tốt Khi vào cơ thể, dới tác dụng xúc tác của các enzym esterase, FB bị phân hủy ngay lập tức để tạo thành FA là dạng có hoạt tính nhng khả năng hấp thu rất thấp Trong huyết tơng của ngời sau khi uống FB hầu nh không tìm đợc vết của FB.[36]

Hiện nay, FB là một thuốc đợc dùng rộng rãi và phổ biến để điều trị chứng tăng lipid Tuy nhiên, FB có độ tan thấp, tốc độ hoà tan chậm, sự hấp thu phụ thuộc nhiều vào cá thể, chế độ ăn và tình trạng tháo rỗng của dạ dày Nồng độ tối đa của FA trong máu có thể dao động từ 0,5 đến 10 àg/ml [23] Sự dao động lớn của nồng độ thuốc trong máu không những làm hiệu quả điều trị không ổn định mà còn gây tăng tần suất xuất hiện và cờng độ các tác dụng phụ của thuốc Những tác dụng phụ hay gặp của FB tuy không nghiêm trọng nhng gây khó chịu cho bệnh nhân với tần suất tơng đối cao, có thể lên tới 5,5% Đây cũng là nguyên nhân chủ yếu phải ngừng thuốc của bệnh nhân, mặc dù đáp ứng điều trị của thuốc rất tốt.

Tăng sinh khả dụng bằng cách tăng độ hoà tan của fenofibrat là đề tài đợc nhiều ngời quan tâm Kết quả của nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh đợc rằng nếu tăng độ hòa tan của FB có thể làm tăng sinh khả dụng, giảm đợc liều dùng nhờ đó giảm đợc sự giao động nồng độ thuốc trong máu và giảm tác dụng phụ của thuốc.

1.5.2 Các nghiên cứu tăng độ hòa tan và sinh khả dụng của fenofibrat

Tuy đã ra đời trong khoảng thời gian dài nhng việc nghiên cứu tác dụng điều trị, các chỉ định mới cũng nh công nghệ bào chế để tăng sinh khả dụng của FB, cho đến nay, vẫn đợc nhiều nhà khoa học quan tâm.

Năm 1994, tác giả Kercj., Scric s và cộng sự [25] đã nghiên cứu bào chế fenofibrat dạng vi hạt bằng phơng pháp phun CO2 siêu tới hạn Kết quả cho thấy biện pháp này làm tăng đáng kể độ hoà tan của FB và đã tìm đợc tá dợc đồng kết tủa với FB cho kết quả hoà tan là tốt nhất Cũng trong năm này, Munoz A.[29] và cộng sự giảm kích thớc tiểu phân của FB bằng cách tạo vi hạt sau khi trộn với NaLS để cải thiện độ thấm ớt của FB Tạo vi hạt FB bằng cách va đập FB trong một buồng chứa kín có nhiều rãnh chắn Các hạt tiểu phân lớn vỡ ra vì va đập, các tiểu phân thu đợc đều có kích thớc dới 50àm Các kết quả thử nghiệm cho thấy FB dạng này có khả năng hấp thu cao hơn, giảm liều FB dùng hàng ngày, kiểm soát tốt hơn lợng FB đợc hấp thu Do đó kiểm soát đợc nồng độ FA trong máu, và nâng cao hiệu quả điều trị cũng nh giảm đợc các tác dụng không mong muốn.

Năm 1998 tác giả Guay D.R [18] khi thử so sánh tác dụng hạ mỡ máu từ nang thờng và nang bào chế bằng vi hạt FB đã cho kết quả dạng nang chứa vi hạt FB có sinh khả dụng cao hơn, tác dụng điều trị hạ mỡ máu tốt hơn Nang FB 300mg bào chế từ bột nguyên liệu thông thờng và nang FB 200mg bào chế từ vi hạt FB tơng đơng về sinh khả dụng và tác dụng điều trị Nh vậy, sử dụng dạng vi hạt FB để bào chế nang thuốc đã làm giảm liều điều trị từ 300mg xuống còn 200mg.

Để cải thiện khả năng hoà tan và nâng cao sinh khả dụng của FB, đã có các nghiên cứu bào chế theo phơng pháp khác nhau.

Các tác giả Vogt M., Kunath K., Dressman JB [41] đã thực hiện nghiên cứu biện pháp làm tăng độ hoà tan của FB bằng phơng pháp tạo vi hạt, nghiền có phối hợp chất diện hoạt và phun sấy Bằng phơng pháp phân tích nhiệt vi sai và nhiễu xạ tia X, các tác giả đã xác định đợc có sự chuyển từ dạng kết tinh

sang dạng vô định hình của FB khi áp dụng phơng pháp phun sấy Cả 3 phơng pháp đều tăng đáng kể độ hòa tan của FB so với nguyên liệu ban đầu Vogt M và cộng sự tiến hành khảo sát độ hòa tan của các chế phẩm FB 100mg dạng tiêu chuẩn trên thị trờng, kết quả cho thấy có độ hòa tan tơng đơng với nguyên liệu thô hoặc dạng vi hạt Phơng pháp nghiền phối hợp và phun sấy cho kết quả độ hòa tan của FB cao hơn rất nhiều Các tác giả đã kết luận phơng pháp nghiền có phối hợp chất diện hoạt và phun sấy là hai phơng pháp hiệu quả để bào chế FB giải phóng nhanh và hoà tan tốt Một số tác giả đã đăng ký bản quyền tại Mỹ về phơng pháp làm tăng độ hoà tan của fenofibrat bằng phun sấy [16], đồng tạo vi hạt với chất diện hoạt [10], [15], dùng chất mang cyclodextrin [17], phun hỗn dịch vi hạt FB lên hạt trơ [34].

Trong thời gian gần đây, bằng kỹ thuật vi bao, dạng bào chế viên nén 160mg FB đã đợc giới thiệu và sử dụng rộng rãi Trong nang cứng FB 200M, các vi hạt FB đợc tạo hạt với những tá dợc thân nớc có khả năng giải phóng nhanh, tuy nhiên sự tiếp xúc với môi trờng của các vi hạt vẫn bị hạn chế Bằng kỹ thuật vi bao, các vi hạt đợc tiếp xúc ngay với môi trờng hòa tan, diện tích tiếp xúc lớn và có khả năng giải phóng dợc chất tức thì Bằng công nghệ này, độ hòa tan và sinh khả dụng của FB tăng lên khoảng 25%, nhờ đó liều dùng có thể giảm từ 200mg xuống còn 160 mg.

Các tác giả Sharpe M., Ormrod D., Javis B [35] đã đánh giá và so sánh hiệu quả hạ mỡ máu của nang chứa vi hạt FB 200mg và viên nén áp dụng kỹ thuật vi bao 160mg Kết quả cho thấy hai dạng này tơng đơng sinh học và tơng đơng hiệu quả điều trị Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Guivarc’ch PH., Vachon MG., Fordyce D [20] và Najib J [31] cũng khẳng định hai dạng nang vi hạt FB 200mg và viên nén áp dụng kỹ thuật vi bao 160mg tơng đơng điều trị Ưu điểm của dạng vi bao FB là đã giảm đợc liều dùng so với dạng nang thuốc chứa vi hạt FB, nhờ đó giảm đợc sự biến thiên nồng độ thuốc trong máu nên giảm đợc tần suất và cờng độ của các tác dụng không mong muốn gặp phải

Tuy nhiên, sự hấp thu của dạng vi bao và dạng nang chứa vi hạt vẫn phụ thuộc vào tình trạng tháo rỗng của dạ dày.

Bằng kỹ thuật tạo hệ phân phối các dợc chất không tan dạng vi P), viên nén FB 160mg có SKD không phụ thuộc vào tình trạng tháo rỗng của dạ dày Các tác giả Guivarc’ch PH., Vachon MG., Fordyce D [20] và Najib j [31] đã nghiên cứu ảnh hởng của thức ăn đến sinh khả dụng của viên bào chế từ vi cầu FB, kết quả cho thấy hai nhóm uống thuốc khi đói và khi no có các thông số dợc động học tơng đơng nhau.

cầu(IDD-Để giảm liều dùng của FB và loại bỏ sự phụ thuộc vào tình trạng tháo rỗng của dạ dày (không phụ thuộc sự có mặt của thức ăn) các nghiên cứu bào chế FB dới dạng nano đã đợc công bố.

Sauron R và cộng sự tiến hành đánh giá tơng đơng sinh học của các thuốc dạng nano 145mg với cỡ hạt <400 nm, nang FB 200mg bột vi hạt và dạng viên nén 160mg bột vi bao, thử nghiệm đợc tiến hành trên ngời tình nguyện Kết quả cho thấy dạng nano 145mg với cỡ hạt <400 nm là tơng đơng sinh khả dụng với dạng nang FB 200mg bột vi hạt và dạng viên nén 160 mg bột vi bao, đồng thời nó không phụ thuộc vào thức ăn [33].

Một nghiên cứu mới đây của Hanafy A và cộng sự [22], năm 2007, cũng chỉ ra rằng dạng hỗn dịch nano DissoCubes với cỡ hạt khoảng 338nm và dạng hạt nano lipid rắn (solid lipid nanoparticles) cỡ hạt < 58 nm là tơng dơng sinh khả dụng Cả hai dạng này đều có sinh khả dụng cao hơn dạng hỗn dịch vi hạt có kích thớc hạt < 5 àm.

Tuy nhiên, hiện nay trên thị trờng cha thấy đa vào sử dụng các chế phẩm bào chế chứa FB dạng nano và dạng siêu vi cầu, các chế phẩm bào chế không phụ thuộc vào chế độ ăn và thức ăn.

1.5.2.Các phơng pháp định lợng FB trong huyết tơng

Các nghiên cứu tơng đơng sinh học của hoạt chất FB đã đợc tiến hành từ rất lâu Năm 1993, Guichard J.P đã thực hiện so sánh sinh khả dụng của FB

dạng vi hạt Lipanthyl 67M và FB dạng tiêu chuẩn Lipanthyl 100 [19] Năm 2004, Guivarc’h P.H tiến hành nghiên cứu về sinh khả dụng của các dạng bào chế FB về sự phụ thuộc vào thức ăn [20] Gần đây (vào năm 2006 và năm 2007), Sauron R.[33] và Hanafy A [22] nghiên cứu sinh khả dụng của fenofibrate bào chế dới dạng nano so với các dạng vi bao và dạng vi hạt Các thử nghiệm này thờng đợc đợc tiến hành trên ngời, chỉ có Hanafy A thử nghiệm trên chuột.

Các tác giả này dùng phơng pháp HPLC có chất chuẩn nội với detector UV để định lợng FA trong huyết tơng Tùy thuộc vào điều kiện của cột và máy chạy sắc ký, mà pha động đợc điều chỉnh phù hợp:

- Pha động là acetonitril và nớc acid (1% acid acetic) tỷ lệ 1:1 Detector UV bớc sóng 292 nm Tốc độ dòng 0,5 ml/phút Thời gian lu của FA là 9 phút và IS là 7,5 phút Gới hạn định lợng 0,03 mg/L.[33]

- Pha động là acetonitril và nớc tỷ lệ 1:1, pH 2,3 Detector UV bớc sóng 286 nm Tốc độ dòng 1ml/phút Thời gian lu của FA là 16 phút và IS là 24 phút Gới hạn định lợng 0,05 mg/L.[19]

- Pha động là acetonitril và acid phosphoric 0,02M (55: 45), pH 3,07 Detector UV bớc sóng 287 nm Tốc độ dòng 1,2 ml/phút.[21]

Thời điểm lấy mẫu thờng là 0,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24, 48, 72, 96, 120 giờ Sau đó ly tâm và bảo quản ở tủ lạnh sâu – 200C.

- Các thông số dợc động học đợc đánh giá là Cmax, Tmax, AUC∞, t1/2

Để tự động hóa các khâu trong xử lý mẫu và sắc ký Năm 2000, Streel S [37] đã thực hiện nghiên cứu định lợng FA trong huyết tơng ngời dùng phơng pháp chiết pha rắn tự động kết hợp với HPLC Phơng pháp đợc áp dụng thành công trong so sánh sinh khả dụng của viên nang Lidose TM và dạng vi hạt FB Cột Nuleosil RP – 8, thể tích tiêm mẫu 100àl, pha động methanol và acid phosphoric 0,04 M tỷ lệ 60: 40, detecter 288 nm đợc sử dụng Chất chuẩn nội cũng đợc dùng, phơng pháp cho phép định lợng FA từ nồng độ 0,25 mg/ml.

1.6 Phơng pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo của thuốc

Phơng pháp nghiên cứu sinh khả dụng và thử tơng đơng sinh học đợc cơ quan quản lý thực phẩm, thuốc và mỹ phẩm Mỹ đa ra năm 1938 nhằm yêu cầu các nhà nghiên cứu phải cung cấp những thông tin về độ an toàn và tác dụng của một hoặc nhiều hoạt chất trong chế phẩm thuốc trớc khi đợc bán ra thị tr-ờng Vài thập niên trớc Cục quản lý thực phẩm và thuốc của Mỹ đã cho phép thay thế một chế phẩm đã và đang sử dụng bằng một chế phẩm mới mà không đòi hỏi phải lặp lại các nghiên cứu về hiệu quả và độ an toàn trên lâm sàng vì các nghiên cứu thờng tốn nhiều thời gian và tiền bạc Lý do căn bản là việc đa ra những thông số đặc trng của sinh khả dụng, dợc động học và kết quả thống kê trong những nghiên cứu của thuốc thử nghiệm có thể thay đổi theo thực tế điều trị so với thuốc cũ, do đó mà không cần thử nghiệm lâm sàng [32].

1.6.1 Sinh khả dụng và các yếu tố ảnh hởng

Sinh khả dụng (F) là đại lợng chỉ tốc độ và mức độ hấp thu dợc chất từ một chế phẩm bào chế vào tuần hoàn chung và đa đến nơi tác dụng

Sinh khả dụng tuyệt đối: là tỷ lệ giữa AUC của dạng thuốc dùng ngoài ờng tĩnh mạch (uống, tiêm dới da ) với AUC của dạng tiêm tĩnh mạch của cùng một loại thuốc, cùng một liều thuốc:

F= AUC uống tiêm dới da /AUC tiêm TMF luôn luôn nhỏ hơn 1.

Sinh khả dụng tơng đối: là tỷ lệ so sánh giữa 2 giá trị AUC của cùng một thuốc, cùng đa qua đờng uống nhng của 2 dạng khác nhau (viên nén, viên sủi) hoặc của 2 hãng thuốc (chế phẩm thử và chế phẩm đối chiếu):

F’ = AUCthuốc thử/AUCthuốc đối chiếuF’ có thể lớn hơn 1.

Về mặt ý nghĩa, sinh khả dụng là đại lợng đặc trng cho mức độ và tốc độ hấp thu của một hoạt chất vào trong hệ tuần hoàn Sinh khả dụng là một đại l-ợng quan trọng để đánh giá sơ bộ chất lợng của một chế phẩm và là cơ sở để thử

tơng đơng sinh học trên ngời tình nguyện.

Các đại lợng đặc trng dùng để đánh giá sinh khả dụng in vivo đó là AUC, Cmax, tmax, t1/2.

* Có rất nhiều yếu tố ảnh hởng đến sinh khả dụng của thuốc khi dùng theo đờng uống [1]:

- Các yếu tố dợc học:

+ Độ tan và tốc độ hòa tan dợc chất từ dạng thuốc.

+ Các yếu tố ảnh hởng đến hấp thu thuốc: hệ số phân bố dầu nớc sự ion hóa của dợc chất.

1.6.2 Phơng pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo của thuốc

Trớc khi tiến hành đánh giá sinh khả dụng in vivo chúng ta phải tiến hành thử nghiệm hòa tan in vitro SKD của các dạng thuốc rắn dùng theo đờng uống bị giới hạn trớc hết bởi tốc độ và mức độ hòa tan của dợc chất từ dạng thuốc

- Thuốc đối chứng: nên sử dụng các loại thuốc đã có tài liệu chứng minh về SKD và tơng đơng sinh học, đảm bảo độ an toàn và hiệu lực điều trị trong nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng tuyệt đối thì thuốc dùng để đối chứng phải là thuốc tiêm tĩnh mạch Trong nghiên cứu đánh giá SKD tơng đối thì có thể lựa chọn các thuốc đã đợc sử dụng lâu dài, rộng rãi trong và ngoài nớc [1], [32].

- Thuốc thử: cần phải chuẩn bị đầy đủ các dữ liệu về trắc nghiệm hòa tan, độ ổn định

- Đối tợng thử thuốc: động vật và ngời tình nguyện.

Mô hình động vật đợc dùng để đánh giá SKD trong các trờng hợp: thuốc

đang nghiên cứu đợc thử nghiệm trên động vật trớc khi thử trên ngời Thuốc không đợc tiêm tĩnh mạch cho ngời khi đánh giá SKD tuyệt đối do có nhiều phản ứng không mong muốn hoặc độc tính cao Thuốc do nồng độ trong máu thấp, khó định lợng, dùng động vật thử có thể tăng liều, khi đó nồng độ thuốc trong máu đủ lớn để định lợng bằng phơng pháp thích hợp Tuy vậy giữa ngời và động vật có sự khác nhau lớn về chuyển hóa thuốc trong cơ thể, chuyển hóa thuốc ở ngời diễn ra chậm hơn ở động vật [1].

Các động vật hay đợc sử dụng để đánh giá SKD là chó, thỏ, khỉ, chuột Chó thờng đợc sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu thuốc dùng đờng uống [1], [32].

Khi lựa chọn động vật thí nghiệm cần chọn con khỏe mạnh, tơng đối đồng đều về cân nặng và giới tính Súc vật đợc lựa chọn làm thí nghiệm phải đợc theo dõi và không đợc đa vào cơ thể bất kỳ một loại thuốc nào trong vòng 2 tuần trớc khi thí nghiệm [1], [32]

- Thiết kế thí nghiệm: khi so sánh 2 chế phẩm, thiết kế thí nghiệm theo kiểu chéo đôi, hai giai đoạn Mẫu thí nghiệm đợc chia làm 2 nhóm: nhóm 1 uống thuốc thử trớc, sau đó uống thuốc đối chứng Nhóm 2 uống thuốc đối chứng trớc, sau đó uống thuốc thử Khoảng cách giữa 2 lần uống thuốc phải đảm bảo đủ thời gian để thải trừ hết ra khỏi cơ thể, thờng là gấp 10 lần thời gian bán thải của thuốc.

- Thời điểm lấy mẫu: tùy trờng hợp và mục đích, dịch sinh học có thể là máu, nớc tiểu hoặc nớc bọt.

Dịch sinh học là máu đợc dùng trong trờng hợp dợc chất có đáp ứng sinh học phụ thuộc vào nồng độ dợc chất trong máu Lấy mẫu trắng trớc thời điểm cho uống thuốc Các mẫu tiếp theo nên lấy vào các thời điểm ở giai đoạn hấp thu, phân bố, thải trừ Thông thờng lấy 4 mẫu trớc thời điểm đạt giá trị Cmax và lấy nhiều hơn 6 mẫu ở các thời điểm tiếp theo Tổng số mẫu nên lấy là ≥ 11 mẫu Thời điểm lấy mẫu phải kéo dài ít nhất gấp 3 – 5 lần t1/2 thải trừ hoặc khi nồng độ thuốc trong huyết tơng < 1/10 – 1/20 của Cmax Mẫu máu sau khi lấy

phải đợc bảo quản lạnh ở nhiệt độ thấp cho đến khi định lợng.

- Liều lợng đa thuốc: liều thử phải tơng tự nh liều đa thuốc chuẩn Trong trờng hợp có sự khác biệt về liều phải chú thích để đa vào tính toán kết quả.

- Cách tính kết quả: lập bảng và mã hóa các mẫu thu đợc Xử lý mẫu và tiến hành định lợng Các giá trị thu đợc: t1/2 thải trừ, Cmax, Tmax, AUC0-∞, AUC0-tn (tn là thời điểm lấy mẫu cuối).

Sinh khả dụng F trong trờng hợp uống liều đơn đợc tính nh sau:F = (AUC0-tn)thử / (AUC0-tn)đối chiếu x 100%.

Hoặc F = (AUC0-∞)thử / (AUC0-∞)đối chiếu x 100%.

Cách kết luận về tơng đơng sinh khả dụng in vivo và tơng đơng sinh học theo quy định của FDA:

Nếu 80% ≤ F ≤125 % với độ tin cậy 90% thì kết luận hai thuốc tơng đơng về sinh khả dụng in vivo.

Nếu 80% ≤ F ≤125 % với độ tin cậy 90% và 70% ≤ Cmax ≤ 143 % thì kết luận hai thuốc tơng đơng sinh học.

Chơng 2

Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

2.1 Đối tợng và nguyên vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu tá dợc

Nguyên liệu, tá dợcNơi sản xuấtTiêu chuẩn

Sodium starch glycolat Đài Loan USP 24

Vỏ nang cứng gelatin (số 0) Neounicap - Thái Lan Nhà sản xuất

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 Cột sắc ký Agilent XDB – C18

Spectrex Laser Particle Counter (Model PC-2200, Spectrex Cop., USA)Máy đồng nhất hoá bằng siêu âm Sartorius.

Máy lắc Vortex MixerTủ lạnh nhiệt độ < -400CĐầu lọc 0,45 àm - MerckMáy khuấy từ IKA

Cân phân tích Mettler AB.204Cân kỹ thuật Sartorius

Thiết bị thử độ hoà tan ERWEKAMáy đo quang U1800 - HITACHIMáy ly tâm HERMLE

Kính hiển vi Olympus

Dụng cụ thuỷ tinh: cốc, ống đong, bình định mức

Máy đo pH Mettler toledo

2.1.3 Động vật thí nghiệm

Động vật thí nghiệm là chó đực khỏe mạnh, cân nặng khoảng 10 – 11 kg,

đợc nuôi trong điều kiện ăn uống đầy đủ, không cho ăn thức ăn lạ

Hoà tan NaLS có trong công thức vào trong 50g nớc cất Đun nóng đến nhiệt độ khoảng 90-1000C (2).

Cho từ từ hỗn hợp (1) vào hỗn hợp (2) đồng thời khuấy bằng máy khuấy từ với tốc 650 vòng/phút và đồng nhất hoá nhũ tơng bằng siêu âm trong vòng khoảng 10 phút

Ngừng cấp nhiệt, tiếp tục khuấy và siêu âm hỗn hợp đến nhiệt độ phòng.Ly tâm hỗn dịch thu đợc với tốc độ 4500 vòng/phút trong vòng 10 phút Loại bỏ dịch trong, tách phần lắng của đáy cho vào đĩa petry và sấy ở nhiệt độ 500C trong vòng 24h.

Phân tán bột nhão vào nớc tạo thành hỗn dịch.

Lọc hỗn dịch qua bông thuỷ tinh, lấy phần dịch lọc Ly tâm hỗn dịch mịn với tốc độ 4500 vòng/ phút trong 10 phút.

Tách lấy phần rắn cho vào đĩa petry và sấy ở nhiệt độ 500C trong 24h.

2.2.2 Phơng pháp xác định kích thớc tiểu phân

Phân tán mẫu trong dung dịch NaLS 1% Pha loãng mẫu đến nồng độ phù hợp (khoảng 800 – 1000 tiểu phân/ml).

Phân bố kích thớc tiểu phân đợc phân tích trên hệ thống Spectrex Laser Particle Counter (Model PC-2200, Spectrex Cop., USA).

- Pha dung dịch chuẩn làm việc:

Hút chính xác 10ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100ml, thêm môi trờng hoà tan đến vạch Lắc đồng nhất.

Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn tại λ = 291nm có giá trị là AT.* Thử độ hoà tan: đợc tiến hành trên máy thử độ hoà tan ERWEKA.

- Các thông số của thử độ hoà tan:

Môi trờng hoà tan: natri lauryl sulffat 1,5% hoặc 1%.Nhiệt độ thử hoà tan: 370C 0,5.±

Thể tích môi trờng hoà tan: 900ml.Tốc độ cánh khuấy: 90 vòng/phút ± 4%.- Tiến hành:

+ Đong chính xác 900ml môi trờng hoà tan vào các cốc thử.+ Khởi động máy và chờ đến khi các thông số ổn định.

+ Lần lợt cho các mẫu vào cốc hòa tan, các mẫu cho cách nhau 30s.+ Lấy mẫu: sau các thời điểm 5, 10, 15, 20, 30, và 45 phút hút chính xác 5ml dịch hoà tan từ các cốc Lọc qua giấy lọc, bỏ 2ml dịch lọc đầu

Hút chính xác 1,25ml dung dịch của mẫu vào bình định mức dung tích 25ml Bổ sung bằng môi trờng hoà tan cho đến vạch.

Đo độ hấp thụ ở bớc sóng λ = 291nm.- Tính kết quả:

Nồng độ fenofibrat cha hiệu chỉnh ở lần hút thứ n:

AT: độ hấp thụ của dung dịch chuẩn.

Nồng độ của fenofibrat trong mẫu thử ở lần hút thứ n là:

ì90

Trong đó: m: hàm lợng dợc chất trong mẫu (mg).

2.2.4 Phơng pháp thử độ tan

- Thực hiện trong bình nón dung tích 100ml có gắn thêm xốp cách nhiệt ở thành bình Cho vào bình nón khoảng 60ml môi trờng cần thử độ tan của FB Thêm một lợng d FB và que khuấy từ ủ ấm ở 370C trong 30 phút Đậy kín bình nón bằng nút cao su có gắn nhiệt kế đo đợc nhiệt độ của dung dịch trong bình nón Điều chỉnh nhiệt độ của máy khuấy từ sao cho nhiệt độ trong bình đợc duy trì ở 37,00C ± 1,00C (đặt nhiệt độ ở mức 37,80C) Khuấy và duy trì nhiệt độ liên tục trong 24 giờ.

- Duy trì nhiệt độ, để lắng trong 30 phút Lấy phần dịch trong ở trên, lọc qua màng lọc 0,45àm Bỏ khoảng 2ml dịch lọc đầu Pha loãng đến nồng độ thích hợp bằng môi trờng (để độ hấp thu ở 291nm khoảng từ 0,2 đến 0,7) Đo độ hấp thụ ở bớc sóng 291nm, so sánh với độ hấp thụ của dung dịch chuẩn để

xác định nồng độ.

2.2.5 Phơng pháp phân tích ảnh hởng của biến độc lập vào biến phụ thuộc và lựa chọn công thức tối u

- Các kết quả hoà tan đợc xử lý thống kê và lấy giá trị trung bình.

- Biến phụ thuộc (biến đầu ra): biến đầu ra đợc lựa chọn là độ hoà tan ở thời điểm 10, 30 phút và kích thớc tiểu phân.

- Biến độc lập (biến đầu vào): là tỷ lệ % của FB so với nớc, tỷ lệ % của NaLS trong môi trờng nớc và tỷ lệ của hỗn hợp SP so với FB.

- Làm thí nghiệm thăm dò với các giá trị khác nhau của biến đầu vào để xác định khoảng biến thiên của biến độc lập.

- Thiết kế công thức thực nghiệm theo mô hình hợp tử tại tâm.

- Phơng trình hồi quy đợc tính toán nhờ phần mềm modde 5.0 dựa trên kết quả thực nghiệm của các biến đầu vào và các biến đầu ra.

- Đánh giá ảnh hởng của biến đầu vào đến các biến đầu ra bằng phân tích mặt đáp và các đờng đồng mức.

- Tìm công thức tối u bằng cách giải bài toán tối u dựa trên các điều kiện: giải phóng nhanh, hoàn toàn dợc chất và kích thớc tiểu phân là nhỏ nhất với sự trợ giúp của phần mềm modde 5.0.

2.2.6 Phơng pháp đánh giá độ ổn định của mẫu

Mẫu thử nghiệm đợc đóng gói 2 lần vào túi PE hàn kín.

Đánh giá độ ổn định của mẫu viên nang bào chế ở mục 2.2.1.1 ở điều kiện thực và điều kiện lão hóa cấp tốc.

+ Điều kiện thực: 200C-300C, độ ẩm 60-85%.

+ Điều kiện lão hóa cấp tốc: 400C ± 20C, độ ẩm 75% ± 5%.

Sau các khoảng thời gian (1, 3, 6 tháng với điều kiện thờng và 1, 2, 4, 6 tháng với điều kiện lão hóa cấp tốc) đánh giá lại các tiêu chí về hàm lợng và độ hòa tan của các viên nang

2.2.7 Phơng pháp bào chế viên nang chứa 200mg vi hạt FB

Công thức cho một viên nang fenofibrat 200mg:Vi hạt fenofibrat : 210mg.

* Điều kiện định lợng FA trong huyết tơng bằng HPLC

Qua tham khảo tài liệu và tiến hành các thử nghiệm thăm dò trên hệ thống HPLC nh: thay đổi tỷ lệ pha động, thể tích tiêm mẫu, chúng tôi lựa chọn ra điều kiện sắc ký thích hợp nhất để định lợng FA trong huyết tơng.

2.2.8.2 Thẩm định phơng pháp định lợng FA trong huyết tơng

Tính chọn lọc của phơng pháp: để xác định tính chọn lọc của phơng pháp, chúng tôi so sánh thời gian lu, hình dạng píc của FA giữa mẫu trắng và mẫu đánh giá.

Xây dựng đờng chuẩn: pha các dung dịch FA trong huyết tơng có nồng độ từ 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 àg Các mẫu đợc đem chiết và định lợng bằng HPLC theo điều kiện đã xác định đợc qua nghiên cứu Đờng chuẩn đợc xây dựng dựa trên mối tơng quan giữa diện tích píc và nồng độ của FA trong huyết tơng.

Xác định tính chính xác: tính chính xác đợc xác định bằng cách pha 5 mẫu huyết tơng có cùng nồng độ FA là 4,0àg Chiết và phân tích bằng HPLC theo điều kiện đã nghiên cứu đợc Tính chính xác đợc xác định dựa vào hệ số biến thiên tại nồng độ khảo sát.

Khảo sát tính đúng: tính đúng của phơng pháp đợc xác định bằng phơng pháp thêm, dựa trên các mẫu huyết tơng đã có nồng độ FA xác định Thêm vào đó một lợng FA chính xác đã hòa tan trong methanol Chiết và phân tích bằng HPLC theo điều kiện đã nghiên cứu đợc (tiến hành 5 lần trên mẫu định lợng) Độ đúng của phơng pháp đợc đánh giá dựa trên tỉ lệ phần trăm của FA tìm lại đ-ợc so với lợng FA đã thêm vào.

Khảo sát độ ổn định: pha các mẫu huyết tơng có nồng FA xác định, bảo quản mẫu trong tủ lạnh –400C Độ ổn định đợc xác định bằng cách so sánh nồng độ của các mẫu trớc và sau quá trình bảo quản.

Hiệu suất chiết FA từ huyết tơng: pha 5 mẫu FA trong huyết tơng và 5 mẫu FA trong pha động có cùng nồng độ là 0,1; 0,5; 1,0; 4,0; 8,0 àg Xử lý các mẫu và tiến hành chạy sắc ký song song các mẫu trên theo điều kiện đã nghiên cứu đợc So sánh diện tích píc thu đợc của các mẫu FA trong pha động và mẫu FA trong huyết tơng Tỷ lệ FA tìm lại đợc tính theo công thức:

% FA tìm lại = (Spíc FA trong huyết tơng/ Spíc FA trong pha động) x 100%

2.2.9 Phơng pháp đánh giá sinh khả dụng của FA theo đờng uống

2.2.9.1 Bố trí thí nghiệm

Chọn 6 chó đực khỏe mạnh, cân nặng đồng nhất và không dùng bất kỳ loại thuốc nào trong vòng 2 tuần trớc thí nghiệm Thí nghiệm đợc tiến hành bằng

phơng pháp thử liều đơn, chéo đôi, ngẫu nhiên, hai giai đoạn, mỗi giai đoạn cách nhau 7 ngày.

Cho chó uống thuốc: chó đợc ăn uống đầy đủ, vào buổi sáng trớc khi cho chó uống thuốc, cho chó ăn, sau đó uống thuốc ngay Đa thuốc vào sâu trong cổ họng, tránh để chó nhai làm vỡ viên, bơm khoảng 50ml nớc để chó nuốt viên thuốc Giữ chó ở t thế thẳng đứng khoảng 5 phút để tránh viên thuốc nằm lâu tại thực quản.

2.2.9.2 Lấy và bảo quản mẫu huyết tơng

Mẫu máu đợc lấy từ tĩnh mạch cổ chó tại các thời điểm nhất định phù hợp Mỗi lần lấy khoảng 3ml máu vào các ống nghiệm đã tráng heparin 20 UI/ml để chống đông máu.

Mẫu máu đợc bảo quản lạnh khoảng 15 phút Ly tâm tách huyết tơng, hút lấy 1ml huyết tơng, bảo quản trong tủ lạnh sâu ở nhiệt độ -400C nếu không định lợng ngay.

Phơng pháp chiết tách dợc chất trong huyết tơng: rã đông huyết tơng bằng cách ngâm trong nớc ở nhiệt độ thờng Chiết FA và tủa protein bằng acetonitril với tỷ lệ phù hợp, lắc khoảng 10 phút bằng máy lắc cơ học Ly tâm với tốc độ 4500 vòng/ phút trong 15 phút, lấy phần dịch trong, lọc qua màng 4,5àm thu đ-ợc mẫu để định lợng.

Định lợng FA trong mẫu bằng HPLC.

Từ kết quả diện tích píc so sánh với diện tích píc của mẫu chuẩn để tính ợc nồng độ của FA trong huyết tơng Các thông số dợc động học Tmax, Cmax, AUC0-24, AUC0-∞ đợc tính toán dựa trên Kinetica 4.4.1 Phân tích thống kê để kết luận sự tơng đơng về sinh khả dụng in vivo.

đ-Chơng 3

Kết quả thực nghiệm và nhận xét

3.1 Thử nghiệm in vitro

3.1.1 Xây dựng đờng chuẩn

Quét phổ hấp thụ của NaLS 1%, phổ hấp thụ của fenofibrat trong dung dịch NaLS 1% và phổ hấp thụ của dung dịch PEG trong trong khoảng bớc sóng từ 200 – 400nm Kết quả đợc trình bày ở phụ lục 1 Từ phổ thu đợc của FB cho thấy: tại λ = 291nm độ hấp thụ là cao nhất Do vậy, chọn λ = 291nm là bớc sóng để đo độ hấp thụ của FB.

Pha các dung dịch FB có nồng độ chính xác khoảng 1,5; 3,0; 6,0; 9,0 và

12,0 àg/ml Đo độ hấp thụ ở bớc sóng 291nm Xác định tơng quan hồi quy giữa nồng độ và độ hấp thụ Kết quả đợc trình bày ở bảng 3.1.1 và hình 3.1.1.

Bảng 3.1.1 Liên quan giữa độ hấp thụ (D) và nồng độ fenofibrat(C)

Lần 1 C (àg/ml)0.001.503.036.059.0912.10D0.00000.05260.11270.23970.3623 0.4818Lần 2 C (àg/ml)0.001.043.086.159.2312.30

D0.00000.05950.13000.25160.3716 0.5007Lần 3 C (àg/ml)0.001.482.955.908.8511.80

D0.00000.06300.12370.23460.3606 0.4716

R2 = 0,9992

Hình 3.1.1 Đồ thị biểu diễn đờng chuẩn fenofibrat

Nhận xét: hình 3.1.1 cho thấy có sự tơng quan chặt chẽ giữa nồng độ FB

NaLS 1,0% 285,4 1,2843 pH 4,5 0,93 0,0042

CS : Nồng độ bão hòa (mg/L) CD: Nồng độ lý thuyết (mg/L)

Kết quả cho thấy độ tan của FB trong môi trờng nớc cất và các môi trờng pH khác nhau rất thấp, pH hầu nh không ảnh hởng đến độ tan của FB Khi có mặt của chất diện hoạt độ tan của FB tăng lên rõ rệt Nồng độ chất diện hoạt càng cao thì độ tan của FB càng lớn Từ các kết quả thu đợc có thể thấy rằng, để đánh giá độ hòa tan của FB phải dùng dung dịch NaLS với nồng độ lớn hơn 0,75% (khi đó tỷ lệ CS/CD =1) Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng môi trờng NaLS 1% và 1,5% để đánh giá độ hòa tan của FB.

3.1.3 Lựa chọn chất mang

Để lựa chọn chất mang phù hợp, chúng tôi đã thử khả năng hòa tan vào nhau ở trạng thái nóng chảy của dợc chất và chất mang Trong điều kiện không có oxy, tiến hành đun chảy hỗn hợp dợc chất và tá dợc với các tỷ lệ khác nhau ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của cả hai chất Kết quả thu đợc trình bày ở bảng 3.1.3.

Bảng 3.1.3 Trạng thái tập hợp của hệ nóng chảy FB tá d– ợc