Giới thiệu chung về cảm biến sinh học, cảm biến GOx, cảm biến ADN; Polyme dẫn, Polypyrrole cacbonnanotube. Trình bày về tổng hợp điện lực và phương pháp nghiên cứu. Nêu kết quả và thảo luận.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -VŨ THỊ HỒNG ÂN CẢM BIẾN SINH HỌC TRÊN CƠ SỞ COMPOSITE POLYPYRROLE VÀ ỐNG NANOCACBON ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH GOx VÀ ADN LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA LÝ – HÓA LÝ THUYẾT HÀ NỘI - 2008 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -VŨ THỊ HỒNG ÂN CẢM BIẾN SINH HỌC TRÊN CƠ SỞ COMPOSITE POLYPYRROLE VÀ ỐNG NANOCACBON ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH GOx VÀ ADN CHUYÊN NGÀNH: 62443101 LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA LÝ - HÓA LÝ THUYẾT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN ĐẠI LÂM HÀ NỘI - 2008 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin chân thành cảm ơn TS Trần Đại Lâm, người trực tiếp hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Để giúp tơi hồn thành tốt nghiên cứu mình, thầy tạo điều kiện bảo tơi tận tình tơi gặp khó khăn cơng việc Những kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm nghiên cứu khoa học mà học từ thầy đường nghiên cứu Thành công luận văn ngày hôm nhờ giúp đỡ tận tình TS.Trương Thị Ngọc Liên, người tạo nhiều điều kiện thuận lợi, giúp đỡ máy móc, dụng cụ, hố chất bảo, bổ sung kiến thức cho suốt trình tiến hành nghiên cứu Cơ thành viên khác nhóm nghiên cứu tơi từ thí nghiệm đầu tiên, buổi semina khoa học nội nhóm mang lại kiến thức thiết thực cho Tôi xin cảm ơn bạn đồng nghiệp Bộ mơn Hóa Phân tích giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình động viên, khích lệ, chia sẻ ln bên tơi tơi gặp khó khăn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nôi, ngày tháng 11 năm 2008 Tác giả Vũ Thị Hồng Ân BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT GOx Glucose Oxidaza ADN Axit Desoxyribo Nucleic Py monomepyrrole PPy polypyrrole CNT Carbon nanotube: ống nano carbon QCM Quartz Crytal Microbalane: Vi cân tinh thể thạch anh DPV Diffirential Pulse Voltammetry: Cực phổ xung vi phân SWV Square Wave Voltammetry: Cực phổ sóng vng CV Cyclic Voltammetry: Qt vịng EIS Electrochemical Impedance Spectroscopy: Phổ tổng trở điện hóa PPy_CNT_Gox PPy pha tạp CNT có gắn enzyme glucose PPy_ADN dị PPy có gắn ADN dị PPy_CNT_ADN dị PPy pha tạp CNT có gắn ADN dò DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Cấu trúc hoá học độ dẫn số loại polymer dẫn thông dụng Bảng 4.1 Tần số dao động linh kiện QCM giá trị nồng độ DNA đích xác định Bảng 4.2 Giá trị Rct nhận sau mơ nồng độ DNA đích xác định DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1 Mơ hình cảm biến sinh học C Clark Hình Sơ đồ cấu tạo cảm biến sinh học thơng thường Hình Một số phần tử sử dụng làm đầu thu sinh học Hình Các dạng bắt giữ đầu thu sinh học phương pháp vật lý gắn kết hố học Hình Sơ đồ phận chuyển đổi sử dụng tinh thể áp điện Hình Mơ hình cantiler biosensor phát DNA Hình Sơ đồ cảm biến Gox Hình Cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN Hình Độ dẫn vật liệu polymer dẫn so với vật liệu khác Hình 2 Polyme dẫn điện tử Hình Polyme trao đổi ion Hình Polyme oxy hố khử Hình Cơng thức cấu tạo pyrole Hình 2.6 Cơng thức cấu tạo phân tử polypyrrole Hình Polaron, bipolaron hình thành dải lượng tương ứng Hình Cơ chế phản ứng trùng hợp polypyrrole Hình Cấu trúc (a) SWNT (b) MWNT Hình 10 CNT nguyên chất CNT gắn với cấu tử sinh học Hình Chức hóa CNT hỗn hợp HNO3: H2SO4 (1:3) Hình Sơ đồ hệ điện hóa ba điện cực sử dụng tổng hợp màng PPy pha tạp không pha tạp ứng dụng xác định chuyển gen đậu tương Hình 3 Mơ tả cấu trúc tinh thể α-Quartz không gian (a) mặt phẳng (b) Hình Cơ chế sinh tượng áp điện tinh thể αHình Mô tả mode dao động trượt theo bề dày linh kiện QCM Hình Mơ tả số mode dao động trượt bề dày, mode trượt bề măt mode co giãn Hình Cấu trúc QCM Planar Hình Biểu diễn vector Fresnel mặt phẳng phức Hình Tập điểm M vẽ nên đường phổ tổng trở đặc trưng cho hệ khảo sát Hình 10 Mạch điện tương đương Randles Hình 11 Mạch tương đương cho tổng trở polymer Hình 12 Mạch tương đương cho tổng trở polymer dẫn Hình Ảnh hiển vi điện tử quét trường phát xạ FESEM điện cực Gox sở màng composit polypyrrole pha tạp ống nanơ cácbon Hình Ảnh hiển vi điênh tử quét SEM màng PPy gắn DNA dò Hình Ảnh hiển vi điện tử quét SEM màng PPy_CNTs gắn DNA dị Hình 4 Đặc trưng đáp ứng dòng theo thời gian cảm biến GOx với thay đổi nồng độ glucose dung dịch Cảm biến hoạt động điện áp 0,7V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl Hình Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose cảm biến GOx làm việc điện áp 0,7V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl Hình Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose cảm biến GOx làm việc điện áp 0,75V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl Hình Đặc trưng đáp ứng dịng theo nồng độ glucose cảm biến GOx làm việc điện áp 0,8V so với điện cực chuẩn Ag/AgCl Hình Hệ đo QCM200 đầy đủ gồm thiết bị điều khiển số QCM200, dao động QCM25, holder tinh thể cảm biến tinh thể quartz Hình Đặc trưng tần số theo thời gian chế độ đo khơng tải linh kiện QCM Hình 10 Đặc trưng tần số theo thời linh kiện QCM có gắn DNA mơi trường khơng có DNA đích Hình 11 Sự thay đổi khối lượng hấp thụ Δm bề mặt linh kiện QCM có gắn DNA dị đo dung dịch chứa DNA đích với nồng thay đổi từ pM đến 269pM Hình 12 Sự thay đổi tần số dao động theo thời gian linh kiện QCM có gắn DNA dị dung dịch chứa DNA đích với nồng độ thay đổi từ pM đến 28 pM Hình 13 Sự thay đổi tần số dao động theo thời gian linh kiện QCM có gắn DNA dị đo dung dịch chứa DNA đích với nồng độ thay đổi từ 32 pM đến 56 pM Hình 14 Sự thay đổi tần số dao động theo thời gian linh kiện QCM có gắn DNA dị đo dung dịch chứa DNA đích với nồng độ thay đổi từ 59 pM đến 269 pM Hình 15 Sự thay đổi tần số dao động linh kiện QCM có gắn DNA dị theo thay đổi nồng độ DNA đích từ pM đến 269 pM Hình 46 Thay đổi hình dạng chuỗi DNA chuyển từ trạng thái đơn chuỗi sang trạng thái ghép cặp Hình 57 Mơ hình mạch tương đương đơn giản Randles Hình 18 Đặc trưng phổ tổng trở điện cực PPy/DNA dị nồn độ DNA đích khác Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = mV, Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl Hình 19 (a) (b) Đặc trưng phổ tổng trở điện cực PPy/DNA dò nồng độ DNA đích khác Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = mV, Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl Hình 20 Quy trình mô đặc trưng phổ tổng trở xác định Rct sử dụng mơ hình mạch tương đương Randles chế độ Find circle thiết bị Autolab Hình 21 Đường chuẩn sử dụng giá trị 1/Rct hàm nồng độ DNA đích ( từ 25 pM đến 46 pM) với phương trình 1/Rct (Ω-1) = 2,2.10-3+5,5.105 *C(pM) Hình 22 Đặc trưng phổ tổng trở điện cực PPy_CNTs/DNA dị nồn độ DNA đích khác Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = mV, Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl Hình 23 Đặc trưng phổ tổng trở điện cực PPy_CNTs/DNA dò nồng độ DNA đích khác Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = mV, Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl Hình 64 Đặc trưng phổ tổng trở điện cực PPy_CNTs/DNA dò nồng độ DNA đích khác Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = mV, Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl Hình 75 Đường chuẩn sử dụng giá trị 1/Rct hàm nồng độ DNA đích ( từ 25 pM đến 224 pM) với phương trình 1/Rct (Ω-1) = 1,27.10-4 * C – 1,3.10-3 (pM)(nồng độ DNA đích từ 25 pM đến 81 pM) Hình 26 Mơ hình mạch tương đương Randles có tính đến phần đóng góp tổng trở Warburg -1Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, cảm biến sinh học thu hút quan tâm nhà khoa học giới nhà khoa học nước Sự phát triển cảm biến sinh học giúp giải nhu cầu cấp thiết phân tích phát định lượng thành phần sinh học phương pháp phân tích đơn giản dễ đưa vào ứng dụng thực tế Thật vậy, phương pháp phân tích truyền thống sắc ký, điện di, khối phổ thường đòi hỏi trang thiết bị kèm phức tạp có giá thành cao Cảm biến sinh học thiết bị có nhiều ưu điểm: sử dụng đơn giản, có khả phát nhanh, độ nhạy cao có tính chọn lọc cao hệ hóa học sinh học Lĩnh vực áp dụng cảm biến sinh học đa dạng, cơng cụ quan trọng kiểm tra an tồn thực phẩm, chuẩn đốn y học kiểm tra nội khoa, phát tác nhân ô nhiễm mơi trường Cảm biến sinh học hiểu thiết bị sử dụng tác nhân sinh học enzyme, kháng thể, ADN… để phát hiện, đo đạc phân tích hóa chất Vì cảm biến sinh học thơng thường gồm có thành phần bản, là: thành phần hóa học, thành phần sinh học thành phần vật lý Cùng với phát triển nhanh chóng khoa học cơng nghệ, đặc biệt ngành công nghệ vật liệu nano công nghệ thông tin, cảm biến sinh học đạt tiến vượt bậc, hứa hẹn đưa vi thiết bị nhằm xác định nhanh, xác loại vi khuẩn virut gây bệnh Các thiết bị dị tìm hay phân tích lượng mẫu nhỏ (cỡ vài nM) với độ tin cậy cao Với ưu điểm bật độ nhạy, độ đặc hiệu, tính chọn lọc cao, thiết bị đơn giản, nhỏ gọn…cảm biến sinh học thu hút quan tâm đặc biệt nhà khoa học trung tâm nghiên cứu Tuy nhiên việc chế tạo cảm biến sinh học cịn gặp nhiều khó khăn độ ổn định chế tạo sản phẩm, phương pháp đo tín hiệu, thời gian phản ứng, khả tái sử dụng, … Do Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 68 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN dung dịch chứa ADN đích với nồng độ thấp (từ pM đến 21 pM) trình bày hình 4.22 Kết cho thấy tương tự điện cực PPy_ADN dị, với nồng độ ADN đích thấp khơng phát thấy có tượng lai hố ADN Chúng tơi tiếp tục tăng nồng độ ADN đích q trình đo đặc trưng phổ tổng trở loại điện cực pha tạp CNT 8000 Vi ®iƯn cùc: PPy_CNT_DNA dß 7000 nM pM pM 13 pM 17 pM 21 pM 6000 -Z''(Ω) 5000 4000 3000 2000 1000 0 3000 6000 9000 12000 15000 18000 Z'(Ω) Hình 22 Đặc trưng phổ tổng trở điện cực PPy_CNT_ADN dò nồn độ ADN đích khác Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = mV, Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl Trong dải nồng độ ADN đích từ 25 pM đến 96 pM đặc trưng phổ tổng trở trình bày hình 4.23a 4.23b Kết cho thấy bán cung vùng tần số trung bình có độ cao giảm dần nồng độ ADN đích dung dịch tăng lên Cơ chế đáp ứng hoàn toàn tương tự điện cực sử dụng màng PPy không pha tạp CNT Tuy nhiên, bán cung có kích thước nhỏ so với bán cung đặc trưng phổ tổng trở điện cực PPy_ADN dò Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 69 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN 1250 a) 100 mHz 140 25 pM 28 pM 32 pM 36 pM 39 pM 43 pM 46 pM Vi ®iƯn cùc: PPy_CNT_DNA dß -Z''(Ω) -Z''(Ω) DNA dß: 25 pM f = 1810 Hz - 100 mHz 120 1000 750 100 80 60 500 9.6 Hz 2.2 Hz 180.6 Hz 100 mHz 1800 1850 1900 ' 1950 Z(Ω) 2000 1780 Hz 250 300 150 600 900 1200 Z'(Ω) 1500 b) Vi ®iƯn cùc: PPy_CNT_DNA dß 1800 2100 100 mHz 49 pM 52 pM 56 pM 59 pM 62 pM 65 pM 70 pM 81 pM 96 pM 120 -Z''(Ω) 2050 90 60 30 Hz 290 Hz 300 400 500 600 35 Hz 700 ' Z (Ω) Hình 23 Đặc trưng phổ tổng trở điện cực PPy_CNT_ADN dò nồng độ ADN đích khác Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = mV, Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 70 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN Trên hình 4.24 trình bày đặc trưng phổ tổng trở điện cực PPy_CNT_ADN dị đo nồng độ ADN đích cao (từ 117 pM đến 224 pM) Trong dải nồng độ này, thấy phần bán cung ngày thu nhỏ phần tuyến tính ngày rõ nét Độ dốc phần tuyến tính tăng mạnh theo nồng độ ADN đích có mặt dung dịch đo.Tương tự điện cực PPy/ADN dò, tiến hành mô đặc trưng phổ tổng trở đo nồng độ ADN đích khác để xác định giá trị Rct Giá trị Rct nồng ADN đích trình bày bảng 4.2 Vi điện cực: PPy_CNT_DNA dò 120 117 pM 134 pM 164 pM 224 pM 100 -Z''(Ω) 80 100 mHz 60 Hz 35 Hz 40 1503 Hz 20 150 200 250 ' 300 350 400 450 Z (Ω) Hình 24: Đặc trưng phổ tổng trở điện cực PPy_CNT_ADN dị nồng độ ADN đích khác Tần số quét từ 200 kHz đến 100 mHz, Eac = mV, Edc = 0,32 V vs Ag/AgCl Bảng 4.2: Giá trị Rct nhận sau mô nồng độ ADN đích xác định Nồng độ ADN đích (pM) Rct (Ω) Nồng độ ADN đích (pM) Rct (Ω) 25 417 62 143 28 397 65 134 32 350 70 128 Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 71 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN 36 318 81 113 39 294 96 109 42 245 117 105 46 212 134 117 49 191 164 112 52 178 195 111 56 167 224 107 59 153 Từ giá trị Rct xây dựng đường chuẩn giá trị theo nồng độ trình bày hình 4.25 0.011 Vi điện cực: PPy_CNT_DNA dò 0.010 1/Rct (-1) 0.009 0.008 0.011 0.010 0.009 0.008 0.007 0.006 0.005 0.004 0.003 0.002 0.001 10 0.007 0.006 0.005 0.004 0.003 0.002 50 20 30 40 50 60 100 150 Nång ®é DNA ®Ých (pM) 70 200 80 90 250 Hình 25 Đường chuẩn sử dụng giá trị 1/Rct hàm nồng độ ADN đích ( từ 25 pM đến 224 pM) với phương trình 1/Rct (Ω-1) = 1,27.10-4 * C – 1,3.10-3 (pM)(nồng độ ADN đích từ 25 pM đến 81 pM) Chúng nhận thấy khoảng nồng độ ADN đích dung dịch đo từ 25 pM đến 81 pM, giá trị 1/Rct thay đổi tuyến tính theo giá trị nồng độ Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 72 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN theo hàm: 1/Rct (Ω-1) = 1,27.10-4 * C – 1,3.10-3 (pM) Ở dải nồng độ cao (từ 96 pM đến 224 pM) giá trị 1/Rct thay đổi không theo quy luật tuyến tính với nồng độ ADN đích Chúng tơi cho vấn đề xảy tương tự điện cực PPy/ADN dò Từ nồng độ 96 pM ADN đích trở đi, phần tuyến tính vùng tần thấp(có liên quan tới tổng trở Warburg) lớn tới mức bỏ qua Tức mô hình Randles mơ đặc trưng phổ tổng trở xác định Rct khơng cịn phù hợp Trên hình 4.26 trình bày mơ hình mạch tương đương mơ đặc trưng phổ tổng trở cho hệ điện cực PPy_ADN dò PPy_CNT_ADN dị có tính đến ảnh hưởng tổng trở Warburg (đặc trưng cho phần tuyến tính vùng tần số thấp phổ tổng trở) CPE » Rs Rct W Hình 26 Mơ hình mạch tương đương Randles có tính đến phần đóng góp tổng trở Warburg IV.4.4 Nhận xét Tuy giá trị điện trở trao đổi điện tích Rct nhận thơng qua mơ đặc trưng phổ tổng trở với mơ hình mạch tương đương đơn giản Randles, cho thấy quan hệ tuyến tính 1/Rct theo nồng độ Điều phù hợp với lý thuyết khẳng định tính đắn việc lựa chọn mơ hình mạch tương đương gần Hơn nữa, việc pha tạp CNT vào màng PPy mở rộng giới hạn xác định nồng độ ADN đích so với màng PPy không pha tạp Việc pha tạp CNT vào màng làm cho đáp ứng đặc trưng phổ tổng trở màng dải nồng độ cao (từ 49 pM trở lên) rõ ràng hẳn so với không pha tạp CNT Việc mô giá trị Rct để xác định nồng độ ADN đích có lẽ không dừng lại 81 pM, ta mô đặc trưng phổ tổng trở nồng độ ADN đích khác mạch điện tương hình 4.26 Điều đồng nghĩa dải nồng độ ADN đích xác định giá trị Rct cịn mở rộng thêm Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 73 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN KẾT LUẬN • Cố định enzyme glucose lên màng composite PPy_CNT chế tạo thành cơng điện cực GOx • Cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose dung dịch có dải nồng độ tuyến tính rộng (15-95mM) so với số nghiên cứu trước • Đã chế tạo thành cơng màng polyme dẫn (PPy) ứng dụng chế tạo cảm biến ADN phát chuyển gen đậu tương • Nghiên cứu ứng dụng thành công linh kiện vi cân tinh thể QCM chế tạo cảm biến ADN • Xây dựng ứng dụng thành cơng quy trình xác định nồng độ ADN đích dung dịch phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) Vi cân tinh thể thạch anh (QCM) ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO • Đối với cảm biến GOx hướng nghiên cứu tới nâng cao độ nhạy cảm biến, cải thiện tính chọn lọc cách giảm điện chiều điện cực làm việc đo • Hồn thiện quy trình chế tạo cảm biến ADN sử dụng QCM cảm biến ADN sử linh kiện vi điện cực • Thử nghiệm đo cảm biến ADN sử dụng QCM chế độ bơm • Kiểm tra tiếp tính ổn định tính lặp lại phép đo cảm biến ADN • Sử dụng mơ hình mạch điện tương đương mơ đặc trưng phổ tổng trở để xây dựng đường chuẩn nồng độ ADN đích theo giá trị Rct hoàn thiện Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 74 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] IUPAC, A definition of biosensor Biosensors and Bioelectronics, 1996 [2] Clark L C.; Lyons C Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery Acad Sci 1962, 102, 29-45 [3] Guilbault, G.G and Montalvo, J JACS 91, 2164-2569 (1969) [4] Lubbers, D.W and Opitz, N Z Naturforsch C: Biosci 30c, 532-533 (1975) [5] Professor Anthony P F Turner, Biosensors: Past, Present and Future, Cranfield University 1996 [6] Shichiri, M., Kawamori, R., Yamaski, R., Hakai, Y and Abe, H Lancet ii, 1129-1131 (1982) [7] Updike, S.J.; Hicks, G.P The Enzyme Electrode Nature 1967, 214, 986-988 [8] Nguyễn văn Mùi, Xác định hoạt độ enzym, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 2002 [9] Sung, W.J.; Bae, Y.H A glucose oxidase electrode based on PPy with polyanion PEG/enzyme conjugate dopant Biosens Bioelectron 2003, 18, 12311239 [10] Yao, T.; Takashima, K Amperometric biosensor with a composite membrane of sol-gel derived enzyme film and electrochemically generated poly(1,2diaminobenzene) film Biosens.Bioelectron 1998, 13, 67-73 [11] Li, G.; Wang, Y.; Xu, H A hydrogen peroxide sensor prepared by electropolymeization of pyrrole based on screen-printed carbon paste electrodes Sensors 2007, 7, 239-250 [12] Rahman, A.; Kumar, P.; Park, D.-S.; Shim, Y.-B Electrochemical sensors based on organic conjugated polymes Sensors 2008, 8, 118-141 [13] Ohnuki, H.; Saiki, T.; Kusakari, A.; Endo, H.; Ichihara, M.; Izumi, M Incorporation of glucose oxidase into langmuir-blodgett films based on prussian blue applied to amperometric glucose biosensor Langmuir 2007, 23, 4675-4681 Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 75 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN [14] Caseli, L.; dos Santos Jr, D.S.; Foschini, M.; Goncalves, D.; Oliveira Jr, O.N The effect of the layer structure on the activity of immobilized enzymes in ultrathin films J Colloid Interface Sci.2006, 303, 326-331 [15] Mashazi, P.N.; Ozoemena, K.I.; Nyokong, T Tetracarboxylic acid cobalt phthalocyanine SAM on gold: Potential applications as amperometric sensor for H2O2 and fabrication of glucose biosensor Electrochim Acta 2006, 52, 177-186 [16] Sun, Y.; Yan, F.; Yang, W.; Sun, C Multilayered construction of glucose oxidase and silica nanoparticles on Au electrodes based on layer-by-layer covalent attachment Biomaterials 2006, 27, 4042-4049 [17] Zhang, S.; Yang, W.; Niu, Y.; Li, Y.; Zhang, M.; Sun, C Construction of glucose biosensor based on sorption of glucose oxidase onto multilayers of polyelectrolyte/nanoparticles Anal Bioanal Chem 2006, 384, 736-741 [18] Liu, G.; Lin, Y Amperometric glucose biosensor based on self-assembling glucose oxidase on carbon nanotubes Electrochem Commun 2006, 8, 251-256 [19] Chen, P.C.; Hsieh, B.C.; Chen, R.L.C.; Wang, T.Y.; Hsiao, H.Y.; Cheng, T.J Characterization of natural chitosan membranes from the carapace of the soldier crab Mictyris brevidactylus and its application to immobilize glucose oxidase in amperometric flow-injection biosensing system Bioelectrochemistry 2006, 68, 7280 [20] Wang, J.; Carlisle, J.A Covalent immobilization of glucose oxidase on conducting ultrananocrystalline diamond thin films Diamond Relat Mater 2006, 15, 279-284 [21] Florescu, M.; Barsan, M.; Pauliukaite, R.; Brett, C.M.A Development and application of oxysilane sol-gel electrochemical glucose biosensors based on cobalt hexacyanoferrate modified carbon film electrodes Electroanalysis 2007, 19, 220226 [22] Li, J.; Yu, J.; Zhao, F.; Zeng, B Direct electrochemistry of glucose oxidase entrapped in nano gold particles-ionic liquid-N,N-dimethylformamide composite film on glassy carbon electrode and glucose sensing Anal Chim Acta 2007, 587, 33-40 [23] Dai, Z.H.; Ni, J.; Huang, X.H.; Lu, G.F.; Bao, J.C Direct electrochemistry of glucose oxidase immobilized on a hexagonal mesoporous silica-MCM-41 matrix Bioelectrochemistry 2007, 70, 250-256 Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 76 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN [24] Kan, J.; Mu, S.; Xue, H.; Chen, H Effects of conducting polymes on immobilized galactose oxidase Synth Met 1997, 87, 205-209 [25] Poet, P.D.T.d.; Miyamoto, S.; Murakami, T.; Kimura, J.; Karube, I Direct electron transfer with glucose oxidase immobilized in an electropolymeized poly-Nmethylpyrrole film on a gold microelectrode Anal Chim Acta 1990, 235, 255-264 [26] Gerard, M.; Chaubey, A.; Malhotra, B.D Application of conducting polymes to biosensors Biosens Bioelectron 2002, 17, 345-359 [27] Li, G.; Zheng, J.; Ma, X.; Sun, Y.; Fu, J.; Wu, G Development of QCM trimethylamine sensor based on water soluble polyaniline Sensors 2007, 7, 23782388 [28] Tsujimoto, M.; Yabutani, T.; Sano, A.; Tani, Y.; Murotani, H.; Mishima, Y.; Maruyama, K.; Yasuzawa, M.; Motonaka, J Characterization of a glucose sensor prepared by electropolymeization of pyrroles containing a tris-bipyridine osmium complex Anal Sci 2007 23, 59-63 [29] Borole, D.D.; Kapadi, U.R.; Mahulikar, P.P.; Hundiwale, D.G Glucose oxidase electrodes of polyaniline, poly(o-anisidine) and their co-polyme as a biosensor: A comparative study J Mater Sci 2007, 42, 4947-4953 [30] Deng, C.; Li, M.; Xie, Q.; Liu, M.; Yang, Q.; Xiang, C.; Yao, S Construction as well as EQCM and SECM characterizations of a novel Nafion/glucose oxidaseglutaraldehyde/poly(thionine) /Au enzyme electrode for glucose sensing Sens Actuat B Chem 2007, 122, 148-157 [31] Pan, X.; Kan, J.; Yuan, L Polyaniline glucose oxidase biosensor prepared with template process Sens Actuat B Chem 2004, 102, 325-330 [32] Cosnier, S Biomolecule immobilization on electrode surfaces by entrapment or attachment to electrochemically polymeized films A review Biosens Bioelectron 1999, 14, 443-456 [33] 43 Huang, J.; Yang, Y.; Shi, H.; Song, Z.; Zhao, Z.; Anzai, J.I.; Osa, T.; Chen, Q Multi-walled carbon nanotubes-based glucose biosensor prepared by a layer-by-layer technique Mater Sci Eng., B 2006, 26, 113-117 [34] Zhou, Q.; Xie, Q.; Fu, Y.; Su, Z.; Jia, X.; Yao, S Electrodeposition of carbon nanotubes - Chitosan - Glucose oxidase biosensing composite films triggered by reduction of pbenzoquinone or H2O2 J Phys Chem B 2007, 111, 11276-11284 Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 77 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN [35] Sljukic, B.; Banks, C.E.; Salter, C.; Crossley, A.; Compton, R.G Electrochemically polymeised composites of multi-walled carbon nanotubes and poly(vinylferrocene) and their use as modified electrodes: Application to glucose sensing Analyst 2006, 131, 670-677 [36] Timur, S.; Anik, U.; Odaci, D.; Gorton, L Development of a microbial biosensor based on carbon nanotube (CNT) modified electrodes Electrochem Commun 2007, 9, 1810-1815 [37] Liu, Y.; Wang, M.; Zhao, F.; Xu, Z.; Dong, S The direct electron transfer of glucose oxidase and glucose biosensor based on carbon nanotubes/chitosan matrix Biosens Bioelectron 2005, 21, 984-988 [38] Yogeswaran, U.; Chen, S.-M A review on the electrochemical sensors and biosensors composed of nanowires as sensing material Sensors 2008, 8, 290-313 [39] Rubianes, M.D.; Rivas, G.A Dispersion of multi-wall carbon nanotubes in polyethylenimine: A new alternative for preparing electrochemical sensors Electrochem Commun 2007, 9, 480-484 [40] Rivas, G.A.; Rubianes, M.D.; Pedano, M.L.; Ferreyra, N.F.; Luque, G.L.; Rodriguez, M.C.; Miscoria, S.A Carbon nanotubes paste electrodes A new alternative for the development of electrochemical sensors Electroanalysis 2007, 19, 823-831 [41] Chen, J.; Burrell, A.K.; Collis, G.E.; Officer, D.L.; Swiegers, G.F.; Too, C.O.; Wallace, G.G Preparation, characterisation and biosensor application of conducting polymes based on ferrocene substituted thiophene and terthiophene Electrochimica Acta 2002, 47, 2715-2724 [42] Wu, L.; Zhang, X.; Ju, H Amperometric glucose sensor based on catalytic reduction of dissolved oxygen at soluble carbon nanofiber Biosens Bioelectron 2007, 23, 479-484 [43] Shin, C.; Shin, W.; Hong, H.G Electrochemical fabrication and electrocatalytic characteristics studies of gold nanopillar array electrode (AuNPE) for development of a novel electrochemical sensor Electrochim Acta 2007, 53, 720-728 [44] Sun, Y.; Bai, Y.; Yang, W.; Sun, C Controlled multilayer films of sulfonatecapped gold nanoparticles/thionine used for construction of a reagentless bienzymatic glucose biosensor Electrochim Acta 2007, 52, 7352-7361 Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 78 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN [45] Zhao, W.; Xu, J.J.; Shi, C.G.; Chen, H.Y Fabrication, characterization and application of gold nano-structured film Electrochem Commun 2006, 8, 773-778 [46] Ekanayake, E.M.I.M.; Preethichandra, D.M.G.; Kaneto, K PPy nanotube array sensor for enhanced adsorption of glucose oxidase in glucose biosensors Biosens Bioelectron 2007, 23, 107-113 [47] Liu, L.; Jia, N.q.; Zhou, Q.; Yan, M.m.; Jiang, Z.y Electrochemically fabricated nanoelectrode ensembles for glucose biosensors Mater Sci Eng., C 2007, 27, 57-60 [48] Millan K M and Mikkelsen S R , Sequence-selective biosensor for ADN based on electroactive hybridization in dicators Anal Chem 1993 65, 2317-2323 [49] Millan K M, Saraullo S and Mikkelsen S R, Voltametric ADN biosensor for cystic fibrosis based on a modified carbon paste electrode Anal Chem 1996 66, 2943-2948 [50] Piunno P A E, Krull U J, Hudson R H E, Damha M J and Cohen H, Fiber optic for fluorimetric detection of ADN hibridization Anal Chim 1994 Acta 288, 205-214 [51] Minunni M, Tombelli S, Scielzi R, Mannelli I, MasciniMand Gaudiano C, Detection of β-thalassemia by a ADN piezoelectric biosensor coupled with polymease chain reaction Anal Chim 2003 Acta 481, 55-64 [52] Kelley S O, Boon E M, Barton J K, Jackson N M and Hill M G, Single-base mismatch detection based on charge transduction through ADN Nucleic Acids Res 1999 27, 4830-4837 [53] Watson J D and Crick F H C, Nature 1953 171, 737 [54] Allen J B, Larry R, Faulkner, Electrochemmistry: Principe, method and application 2001: John Viley & Sons Inc [55] Tran Dai Lam, Ph.D thesis Univ Paris VII 2003, Direct Electrochemical ADN biosensor based on novel conducting polymes [56] Guedon P, Livache T, Martin F, Lesbre F, Roget A, Bidan G and Levy Y, PPy electrospotting for the condtruction of oligonucleotide arrays compatible with a surface plasmon resonnance hybridization detection Sythetic metals 2001 121(13), 1443-1444 Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 79 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN [57] Ngyễn Đức Nghĩa, Bán dẫn hữu polyme Công nghệ chế tạo, tính chất, ứng dụng Nhà xuất Khoa học tự nhiên công nghệ, Hà Nội 2007 [58] Truong T.N Lien, L H Bac, T D Lam, P Q Pho, Glucose sensor based on multi-wall carbon nanotubes doped PPy,Proceedings of the 10th GermanVietnamese Seminar on Physics and Engineering, Bonn, 04-09,June, 2007 [59] Pablo A Fiorito, Susana I Córdoba de Torresi, Glucose Amperometric Biosensor Based on the Co-immobilization of Glucose Oxidase (Gox) and Ferrocene in Poly(pyrrole)Generated from Ethanol/WaterMixtures,CP26077,05513-970 [60] Yu-Chen Tsai, Shih-Ci Li, Shang-Wei Liao, Electrodeionposition of polypyrole-multiwalled carbon nanotube-glucose oxidase nanobiocomposite film for the detection of glucose, Biosensor and Bioelectronics 22, (2006) 495-500 [61] Kanan Balasubramanian, Marko Burghard, Biosensors based on carbon nanotubes, Anal Bional Chem (2006) 385: 452-468 [62] Chun Xiang Li, Yun Zeng, Chun Ran Tang, Glucose biosensor based on carbon/PVC-COOH/Ferrocene composite with covalently immobilized enzyme, Chinese Chemical Letters Vol.16, No.10, (2005)1357-1360 [63] Sulak, M.T., Gokdogan, O., Gulce, A and Gulce, Amperometric glucose biosensors based on gold-deposited polyvinylferrocene film on Pt electrode, Biosensor and Bioelectronics 21, (2006)1719-[8] Uang, Y.M., Chou, T.C., 2003 Biosens Bioelectron.19, 141-147 [64] Ma, M., Qu, L., Shi, G., 2005 J Appl Polym Sci 98, 2550-2554 [66] Z.Wang, J.Liu, Q.Liang, Y.Wang, G.Luo, Analyst 127 (2002) 653 [67] Eugenii Katz and Itamar Willner, Bionecule-Functionnalized Carbon Nanotubes: Applications in nanobioelectronics, Chemphischem 2004, 5, 10841140 Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 80 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: CẢM BIẾN SINH HỌC I.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CẢM BIẾN SINH HỌC I.1.1 Cấu tạo cảm biến sinh học I.1.1.1 Cấu tạo chung I.1.1.2 Tác nhân cần phát I.1.1.3 Đầu thu sinh học I.1.1.4 Tác nhân cố định I.1.1.5 Bộ phận chuyển đổi I.1.2 Ứng dụng cảm biến sinh học I.1.3 Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học 10 I.2 CẢM BIẾN GOx 11 I.2.1 Enzym glucose 11 I.2.2 Nguyên tắc phản ứng điện hoá 12 I.2.3 Cố định enzyme 12 I.2.4 Vật liệu nano 13 I.3 CẢM BIẾN ADN 15 I.3.1 Thành phần cấu tạo ADN[53]: 15 I.3.2 Nguyên lý hoạt động cảm biến ADN: 17 I.3.3 Các phương pháp phát ADN 17 CHƯƠNG II: POLYME DẪN, POLYPYRROLE VÀ CACBONNANOTUBE 19 II.1 POLYME DẪN 19 II.2 PPy 23 II.2.1 Monome Pyrrole (Py) 23 II.2.2 Polyme PPy (PPy) 23 II.2.3.1 Tổng họp PPy phương pháp hóa học 26 II.2.3.2 Tổng hợp PPy phương pháp điện hóa 26 II.2.3.3 Tổng hợp màng PPy 28 Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 81 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN II.3 Ống nano cacbon 29 II.3.1 Giới thiệu chung CNT 29 II.3.2 Các tính chất đặc biệt CNT 30 CHƯƠNG III: TỔNG HỢP ĐIỆN CỰC VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 III.1 TỔNG HỢP ĐIỆN CỰC 32 III.1.1 Thiết bị 32 III.1.2 Hóa chất 32 III.1.3 Quy trình thực nghiệm 33 III.1.3.1 Quy tình tổng hợp - cố định ADN dò lên màng PPy pha tạp không pha tạp ống nanô cácbon CNT 33 III.1.3.2 Quy tình tổng hợp - cố định enzyme glucose lên màng PPy pha tạp MWCNT 35 III.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 III.2.1 Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh (Quartz Crystal MicrobalanceQCM) 35 III.2.1.1 Tinh thể thạch anh 36 III.2.1.2 Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh (QCM) 38 III.2.1.3 Một số cấu trúc QCM 40 III.2.2 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (Electrochemical impedance spectroscopy – EIS) 41 III.2.2.1 Bản chất phương pháp 41 III.2.2.2 Nội dung phương pháp 43 III.2.2.3 Tổng trở polyme dẫn 43 III.2.2.4 Mạch điện tương đương: 44 III.2.3 Phương pháp đo dòng (Amperometric) 47 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 IV.1 TỔNG HỢP MÀNG PPy_CNT_Gox; PPy_ADN dò; PPy_CNT_ADN dò 48 IV.2 CẢM BIẾN GOx SỬ DỤNG VI ĐIỆN CỰC 50 IV.2.1 Cơ sở lý thuyết xác định nồng độ glucose dung dịch phương pháp đo dòng (amperometric) 50 Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 - 82 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN IV.2.2 Đặc trưng đáp ứng dòng theo nồng độ glucose dung dịch 50 IV.2.3 Nhận xét 54 IV.3 CẢM BIẾN ADN PHÁT HIỆN CHUYỂN GEN TRONG ĐẬU TƯƠNG 54 IV.3.1 Cảm biến ADN sử dụng linh kiện vi cân tinh thể (QCM) 54 IV.3.1.1 Hệ đo QCM 200 54 IV.3.1.2 Sự thay đổi tần số dao động linh kiện QCM theo nồng độ ADN đích 55 IV.4 CẢM BIẾN ADN SỬ DỤNG VI ĐIỆN CỰC 62 IV.4.1 Cơ sở lý thuyết xác định ADN đích dung dịch phương pháp phổ tổng trở 62 IV.4.2 Xây dựng hệ đo thiết lập mạch mô 62 IV.4.3 Đặc trưng phổ tổng trở 63 IV.4.4 Nhận xét 72 KẾT LUẬN 73 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý-Hóa lý thuyết 2006-2008 ... cảm biến sinh học (hình 1) Hình 1: Mơ hình cảm biến sinh học C Clark [2] Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý -Hóa lý thuyết 2006-2008 - 4Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx. .. học Hóa lý -Hóa lý thuyết 2006-2008 - 41 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN III.2.1.4 Cảm biến ADN sở linh kiện QCM Cảm biến sinh học sở linh kiện QCM ứng dụng triển... tạo cảm biến GOx sở màng composite PPy pha tạp CNT Vũ thị Hồng Ân – Cao học Hóa lý -Hóa lý thuyết 2006-2008 - 15 Cảm biến sinh học sở composite PPy ống nanocacbon xác định GOx ADN I.3 CẢM BIẾN