Nghiên cứu sự biểu hiện mRNA một số gen liên quan đến con đường JAK/STAT và biểu hiện viêm ở bệnh nhân ung thư hạch

Nghiên cứu này xác định sự biểu hiện mRNA của các gen liên quan đến con đường JAK/STAT là Klotho, STAT1, STAT3, STAT5 và STAT6 cùng với các gen kiểm soát miễn dịch là LAG-3, CTLA-4, PD-1 bằng phương pháp real time-PCR để làm rõ vai trò của chúng trong ung thư hạch, đồng thời xác định nồng độ TNF-α trong máu ngoại vi bằng phương pháp ELISA.

Khoa học Y - Dược Nghiên cứu biểu mRNA số gen liên quan đến đường JAK/STAT biểu viêm bệnh nhân ung thư hạch Nguyễn Thị Xuân1*, Trần Thị Phương Thảo2, Lê Phương Hà3, Hoàng Văn Tổng2 Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y Trường Đại học Khoa học Công nghệ Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Ngày nhận 21/10/2019; ngày chuyển phản biện 25/10/2019; ngày nhận phản biện 22/11/2019; ngày chấp nhận đăng 4/2/2020 Tóm tắt: Ung thư hạch (lymphoma) bệnh lý ác tính có nguồn gốc từ biến đổi tế bào lympho hệ thống miễn dịch, loại ung thư có tỷ lệ mắc tử vong cao giới Việt Nam Ung thư hạch đặc trưng yếu tố khác nhau, có kích hoạt bất thường đường tín hiệu JAK/STAT qua hoạt hóa mức gen STAT rối loạn kiểm soát miễn dịch Nghiên cứu xác định biểu mRNA gen liên quan đến đường JAK/STAT Klotho, STAT1, STAT3, STAT5 STAT6 với gen kiểm soát miễn dịch LAG-3, CTLA-4, PD-1 phương pháp real time-PCR để làm rõ vai trò chúng ung thư hạch, đồng thời xác định nồng độ TNF-α máu ngoại vi phương pháp ELISA Kết cho thấy biểu gen STAT1, STAT3, STAT5 tăng cao nhóm bệnh nhân Ngược lại, LAG-3 có biểu giảm nhóm bệnh nhân so với nhóm đối chứng Nồng độ TNF-α xuất nhóm bệnh có giá trị trung bình 7,789 pg/ml, cao nhiều so với nhóm đối chứng Kết nghiên cứu cho thấy, STAT1, STAT3, STAT5 LAG-3 marker phân tử quan trọng tiềm chẩn đoán phát sớm ung thư hạch Từ khóa: CTLA-4, Klotho, LAG-3, mRNA, PD-1, STAT, ung thư hạch Chỉ số phân loại: 3.1 Đặt vấn đề Ung thư hạch (lymphoma) bệnh lý ác tính bắt nguồn từ tế bào lympho, thể bị công kháng nguyên vi khuẩn hay virus, hoạt động hệ miễn dịch bẩm sinh kích hoạt thơng qua đường nội bào Một nguyên nhân dẫn tới hoạt động bất thường chuyển ác tính tế bào lympho hạch bạch huyết rối loạn đường truyền tín hiệu, đường JAK/STAT (Janus kinase/ signal transducers and activators of transcription) biểu bất thường thụ thể đóng vai trị điểm kiểm tra miễn dịch [1] Thơng qua đường tín hiệu nội bào, interferon (IFN) cytokine TNF-α phối tử đường JAK/STAT bề mặt tế bào [2] Khi tình trạng viêm nhiễm kéo dài, hoạt động mức tế bào miễn dịch kèm theo yếu tố viêm gây rối loạn tín hiệu tế bào, thay đổi hoạt động protein STAT hoạt hóa gen ung thư oncogen Nhiều nghiên cứu cho thấy hoạt động mức protein STAT đóng vai trị quan trọng hình thành phát * triển khối u Đối với u lympho, hoạt động STAT3 có vai trị trì biến đổi ác tính, bên cạnh STAT5 tìm thấy q trình kích hoạt khối u ác tính, đặc biệt bạch cầu lymphoma STAT1 STAT6 chứng minh yếu tố điều hòa quan trọng chế bệnh sinh ung thư hạch [3] Thêm vào đó, Klotho protein chống lão hóa xem yếu tố ức chế phát triển khối u tác động đến đường tín hiệu JAK/STAT Sự tăng hoạt động JAK/STAT dẫn tới giảm hoạt động gen Klotho đưa tế bào thoát khỏi đường appotosis [4] PD-1 PD-L1 phân tử đặc trưng hệ thống miễn dịch có vai trị cân chức miễn dịch thể Khi liên kết với phối tử, PD-1 cung cấp tín hiệu đồng ức chế, dẫn tới điều hòa ngược chức tế bào T B để trì cân miễn dịch Tuy nhiên, tế bào khối u tế bào di có biểu mức thụ thể PD-L1, tín hiệu PD-1 ln kích hoạt trì tương tác đặc hiệu PD-1 PD-L1, dẫn đến suy giảm nghiêm trọng tế bào T Khi đó, số lượng tế bào miễn dịch Tác giả liên hệ: Email: xuannt@igr.ac.vn 62(5) 5.2020 Khoa học Y - Dược Expression of genes involving in JAK/STAT signaling pathway and inflammation in patients with lymphoma Thi Xuan Nguyen1*, Thi Phuong Thao Tran2, Phuong Ha Le3, Van Tong Hoang2 Institute of Genome Research, Vietnam Academy of Science and Technology Institute of Biomedicine and Pharmacy, Vietnam Military Medical Academy University of Science and Technology of Hanoi, Vietnam Academy of Science and Technology Received 21 October 2019; accepted February 2020 không đủ để nhận tế bào lạ hay tế bào ung thư [1] Ngoài thụ thể PD-1, tế bào lympho có chức điều hịa miễn dịch cịn có thụ thể LAG-3 CTLA-4 Trên bề mặt tế bào ung thư có thụ thể MHC lớp II tương tác đặc hiệu với LAG-3, thụ thể anti CTLA-4 CD80 CD86 tương tác đặc hiệu với CTLA-4, làm giảm hoạt động tế bào T, dẫn tới suy yếu hệ thống miễn dịch chống lại khối u [1] Đây gen quan trọng nghiên cứu ứng dụng lâm sàng cho chẩn đoán điều trị nhiều loại ung thư, có ung thư hạch Trong nghiên cứu này, đánh giá biểu mRNA gen Klotho, LAG-3, CTLA-4, PD-1, STAT1, STAT3, STAT5, STAT6 nồng độ TNF-α bệnh nhân ung thư hạch để làm rõ thêm vai trò tiềm gen chẩn đoán điều trị ung thư hạch Đối tượng phương pháp Abstract: Lymphoma is a malignant cancer that originates from the uncontrolled growth of lymphocytes in the immune system Lymphoma is one of the cancer types with the highest incidence and mortality rate worldwide and in Vietnam The pathogenesis of lymphoma is characterized by various factors including the JAK/STAT signaling pathway through abnormal activation of STAT genes and the disorders of immune regulation This study aims to determine the expression of mRNA of genes in relation to JAK/STAT pathway including Klotho, STAT1, STAT3, STAT5, and STAT6 as well as immune regulatory genes LAG-3, CTLA-4, and PD-1 by realtime PCR method to explore their roles in lymphoma At the same time, the levels of TNF-α in serum samples were also measured by ELISA method The results showed that the relative expressions of STAT1, STAT3, and STAT5 were significantly higher while LAG-3 expression was lower in patients with lymphoma compared to controls The TNF-α levels in lymphoma patients were 7.789 pg/ml which was dramatically higher than these of the controls The results indicated that STAT1, STAT3, STAT5, and LAG-3 might be considered as potential biomarkers for early detection of lymphoma Keywords: CTLA-4, Klotho, LAG-3, lymphoma, mRNA, PD-1, STAT Classification number: 3.1 62(5) 5.2020 Đối tượng nghiên cứu Tại Bệnh viện 103, Học viện Quân y, Hà Nội, lấy mẫu máu ngoại vi thu thập từ 18 bệnh nhân chưa điều trị chẩn đoán mắc bệnh ung thư hạch Các bệnh nhân thăm khám lâm sàng, làm xét nghiệm cận lâm sàng giải phẫu bệnh để chẩn đốn xác định bệnh ung thư hạch Nhóm đối chứng gồm 18 người khỏe mạnh, khơng có cá nhân dùng thuốc bị bệnh cấp tính hay mạn tính khác Tất bệnh nhân tình nguyện viên ký văn đồng ý tham gia nghiên cứu Các quy trình thí nghiệm việc chăm sóc cá nhân thực theo luật pháp Việt Nam phê duyệt Hội đồng Đạo đức Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tách chiết RNA tổng số phân tích mức độ biểu gen kỹ thuật RT-PCR RNA tổng số phân lập cách sử dụng Kit Qiashredder RNeasy Mini Kit từ Qiagen theo hướng dẫn nhà sản xuất cDNA tổng hợp từ RNA tổng số (1 µg RNA tổng số 12,5 µl nước DEPC) trộn với µl oligo-dT (500 µg/ml, Invitrogen) ủ 70°C phút Các primer sử dụng bao gồm: mồi gen CTLA-4: 5’GTC CGG GTG ACA GTG CTT CG-3’ (mồi xuôi) 5’CCA GGT AGT ATG GCG GTG GG-3’ (mồi ngược); mồi gen PD-1: 5’-TGC AGC TTC TCC AAC ACA TC-3’ (mồi xuôi) 5’-CAC GCT CAT GTG GAA GTC AC-3’ (mồi ngược); mồi gen STAT1: 5’-CCC TTC TGG CTT TGG ATT GAA-3’ (mồi xuôi) 5’-CTT CCC GGG AGC TCT CAC TGA-3’ (mồi ngược); mồi gen STAT3: 5’-GGA GGA GTT GCA GCA AAA AG-3’ (mồi xuôi) 5’-TGT GTT TGT GCC CAG AAT GT-3’ (mồi ngược); mồi gen STAT-5: 5’- Khoa học Y - Dược CAG ACC AAG TTT GCA GCC AC-3’ (mồi xuôi) 5’CAC AGC ACT TTG TCA GGC AC-3’ (mồi ngược); mồi gen STAT-6: 5’-GCC CAC TCA CTC CAG AGG ACC T-3’ (mồi xuôi) 5’-GGT GTT GGG GAA AGT CGA CAT3’ (mồi ngược); mồi gen LAG-3: 5’-CCT CAC TGT TCT GGG TCT GG-3’ (mồi xuôi) 5’-GGA TAT GGC AGG TGT AGG TC-3’ (mồi ngược); mồi gen GAPDH: 5’-GGA GCG AGA TCC CTC CAA A-3’ (mồi xuôi) 5’-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT-3’ (mồi ngược) Phản ứng PCR chứa 20 µl tổng thể tích gồm µl cDNA, 2,4 µl MgCl2 (3 µM), µl cho loại mồi (0,5 µM loại), µl cDNA Master SybrGreen I mix (Roche Molecular Biochemicals) 12,6 µl nước DEPC Đoạn cDNA khuyếch đại 95ºC 10 giây, 62ºC 10 giây, 72ºC 16 giây, số vòng nhắc lại 40 vòng Phương pháp RT-PCR định lượng cho CTL4, PD-1, STAT1, STAT3, STAT5, STAT6 LAG-3 thực hệ thống LightCycler System (Roche Diagnostics) Tỷ lệ gen tương ứng GAPDH đối chứng tính mẫu theo phương pháp ngưỡng chu trình Phương pháp đo nồng độ TNF-α ELISA Lấy ml mẫu máu ngoại vi người bệnh người khỏe, sau tách huyết tương trữ đơng -20°C phân tích thí nghiệm ELISA Để đo nồng độ TNF-α huyết tương, sử dụng kít thương mại ELISA Max Deluxe Set Human TNF-α (Biolegend), quy trình dựa hướng dẫn cụ thể Biolegend Phân tích thống kê Số liệu nhập quản lý Excel 2013 phân tích phần mềm SPSS v.20 Kiểm định khác biệt biến định lượng phân bố không chuẩn phương pháp Mann-Whitney U test Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê phân tích so sánh giá trị p