TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NHUỘM hóa mô MIỄN DỊCH với dấu ấn BRAF

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI LÊ THỊ PHƯỢNG TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HĨA MƠ MIỄN DỊCH VỚI DẤU ẤN BRAF KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2013 – 2017 Người hướng dẫn khoa học: ThS Nguyễn Hữu Quốc TS Hoàng Trung Kiên HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo đại học, Bộ môn Giải phẫu bệnh Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ em suốt thời gian làm khóa luận Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Hữu Quốc, Bộ môn Giải phẫu bệnh - Trường Đại học Y Hà Nội, Thầy bảo tận tình, hướng dẫn, giúp đỡ em kiến thức chuyên môn rèn luyện kỹ thực hành để hồn thành tốt khóa luận Thầy người truyền cảm hứng chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu giúp em thêm yêu thích chuyên ngành xét nghiệm Giải phẫu bệnh Em xin trân trọng cảm ơn TS Hoàng Trung Kiên, Ban Tổ chức Trung ương Đảng, Thầy động viên, giúp đỡ bảo tận tình cho em suốt q trình làm khóa luận Với lịng thành kính, em xin cám ơn thầy cơ, cán kỹ thuật Bộ môn Giải phẫu bệnh giúp đỡ, bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi để em học tập, rèn luyện kỹ hồn thành khóa luận Em xin chân thành cám ơn thầy Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp cho em nhận xét quý báu để em hồn thiện khóa luận Cuối em vô biết ơn người mẹ, người thân bạn bè chỗ dựa tinh thần vững giúp em vượt qua khó khăn, khơng ngừng cố gắng phấn đấu để hồn thành tốt cơng việc học tập Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2017 Lê Thị Phượng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các nội dung nêu Tổng quan trung thực chưa công bố công trình khoa học Lê Thị Phượng DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BN BV DAB PBS GPB HMMD KKT KN KN- KT KT TBS : Bệnh nhân : Bệnh viện : 3,3-diaminobenziden tetrahydrochlorid : Phosphat buffer saline : Giải phẫu bệnh : Hóa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry) : Kháng kháng thể : Kháng nguyên : Kháng nguyên - Kháng thể : Kháng thể : Tris Buffer Saline MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TỔNG QUAN VỀ HĨA MƠ MIỄN DỊCH 1.1 Khái niệm hóa mô miễn dịch 1.2 Lịch sử hình thành phát triển hóa mơ miễn dịch 1.3 Tình hình ứng dụng hóa mơ miễn dịch Việt Nam 1.4 Nguyên lí hóa mơ miễn dịch 1.4.1 Kháng nguyên 1.4.2 Kháng thể 1.4.3 Hệ thống nhận biết .8 1.5 Vai trò Hóa mơ miễn dịch giải phẫu bệnh 12 1.6 Dấu ấn BRAF 16 1.6.1 Dấu ấn BRAF đường dẫn truyền tín hiệu .16 1.6.2 Đột biến gen BRAF 16 1.6.3 Các phương pháp phát đột biến gen BRAF 18 1.6.4 Ý nghĩa việc phát đột biến BRAF 20 PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HĨA MƠ MIỄN DỊCH 21 2.1 Kỹ thuật trực tiếp .21 2.1.1 Kỹ thuật trực tiếp truyền thống 21 2.1.2 Kỹ thuật trực tiếp 21 2.2 Kỹ thuật gián tiếp .22 2.2.1 Kỹ thuật gián tiếp truyền thống 22 2.2.2 Kỹ thuật gián tiếp 23 2.3 Kỹ thuật kháng thể không đánh dấu 23 2.4 Phương pháp ABC 24 2.5 Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch 25 2.5.1 Quy trình xử lý mơ bệnh phẩm trước nhuộm .25 2.5.2 Chuyển đúc bệnh phẩm 27 2.5.3 Cắt dán mảnh .27 2.5.4 Nhuộm hóa mơ miễn dịch 28 QUY TRÌNH NHUỘM HĨA MƠ MIỄN DỊCH DẤU ẤN BRAF 32 3.1 Quy trình nhuộm Hóa mơ miễn dịch dấu ấn BRAF V600E số trung tâm giải phẫu bệnh 32 3.1.1 Quy trình nhuộm Bộ môn Giải phẫu bệnh - Trường Đại học Y Hà Nội 32 3.1.2 Quy trình nhuộm HMMD dấu ấn BRAF V600E tham khảo trường Boston University School of Medicine 35 3.1.3 Quy trình nhuộm HMMD dấu ấn BRAF V600E hãng Spring 36 3.1.4 Kết nhuộm dấu ấn BRAF V600E số tiêu .37 3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng tiêu nhuộm 39 3.3 Vai trò chứng dương, chứng âm 41 KẾT LUẬN 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC HÌNH, ẢNH Hình 1.1: Kháng thể đơn dịng kháng thể đa dịng .8 Hình 2.1: Phương pháp HMMD trực tiếp .21 Hình 2.2: Phương pháp nhuộm HMMD theo kỹ thuật EPOS .22 Hình 2.3: Phương pháp nhuộm HMMD gián tiếp 22 Hình 2.4: Kỹ thuật nhuộm gián tiếp Dako EnVisonTM 23 Hình 2.5: Kỹ thuật Peroxidase anti peroxidase (PAP) 24 Hình 2.6: Kỹ thuật Avidin/Streptavidin Biotin Complex (ABC) 25 Hình 3.1: Ung thư đại trực tràng với BRAF V600E .37 Hình 3.2: U hắc tố ác tính với BRAF V600E 37 Hình 3.3: U hắc tố ác tính với BRAF V600E 38 Hình 3.4: Ung thư tuyến giáp với BRAF V600E 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, toàn giới bệnh ung thư vượt qua bệnh tim mạch để trở thành nguyên gây tử vong hàng đầu với tỷ lệ mắc bệnh cao độ tuổi mắc bệnh ngày giảm Với tốc độ phát triển dân số gia tăng tuổi thọ ước tính đến năm 2050, giới có thêm khoảng 27 triệu trường hợp ung thư mắc khoảng 17.5 triệu bệnh nhân tử vong năm [1] Trong phải kể đến ung thư đại trực tràng, ung thư tuyến giáp, ung thư da ung thư phổi loại ung thư phổ biến Hiện nay, có nhiều phương pháp để chẩn đoán ung thư xét nghiệm mơ bệnh học đặc biệt hóa mơ miễn dịch coi tiêu chuẩn vàng, tiếng nói cuối cho phép chẩn đoán xác định, định hướng điều trị tiên lượng bệnh Ung thư có dạng đơn mà phân thành nhiều type khác gây khó khăn việc tiên lượng điều trị bệnh Vì vậy, việc phát sớm chẩn đốn xác gen gây đột biến có ý nghĩa lớn định đến mức độ tiến triển bệnh thời gian sống bệnh nhân BRAF gen xuất với tần số cao nhiều loại ung thư Đột biến BRAF V600E tìm thấy u hắc tố ác tính (40 – 60%) , ung thư biểu mô thể nhú tuyến giáp (45%), ung thư biểu mô dịch buồng trứng độ thấp (35%), ung thư biểu mô tuyến đại trực tràng (5 -15%) [2] Ngày nhà nghiên cứu sâu vào nghiên cứu bệnh học phân tử dạng đột biến BRAF để tìm yếu tố tiên lượng khác liên quan đến kết lâm sàng tìm hệ thuốc điều trị ung thư có khả tác động xác tới đích tiềm tế bào ung thư - liệu pháp điều trị nhắm trúng đích Có nhiều phương pháp phát đột biến BRAF giải trình tự gen (sanger sequencing) hay PCR (polymerase chain reaction) gần phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch với kháng thể đơn dịng đặc hiệu có nhiều lợi so với hai phương pháp Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu bệnh đột biến gen BRAF chủ yếu đặc điểm lâm sàng, dịch tễ học mơ bệnh học, có nghiên cứu phát đột biến BRAF kĩ thuật nhuộm hóa mơ miễn dịch Vì vậy, tơi tiến hành đề tài nghiên cứu “Tổng quan phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch với dấu ấn BRAF” với mục tiêu: Sơ lược kĩ thuật nhuộm hóa mơ miễn dịch Trình bày số quy trình nhuộm hóa mơ miễn dịch dấu ấn BRAF TỔNG QUAN TỔNG QUAN VỀ HĨA MƠ MIỄN DỊCH 1.1 Khái niệm hóa mơ miễn dịch Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - viết tắt HMMD) phương pháp xác định vị trí kháng nguyên đặc hiệu diện mô tế bào (bào tương, màng tế bào, nhân) dựa phản ứng miễn dịch (kháng nguyên - kháng thể) kết hợp với hóa chất [3] Ở số nơi giới, thuật ngữ “Immunohistochemistry - Hóa mơ miễn dịch” dùng tiến hành mảnh cắt mơ “Immunocytochemistry - Hóa miễn dịch tế bào” dùng chuẩn bị tế bào học Ở Anh Mỹ, “Immunocytochemistry” thường coi thuật ngữ bao hàm việc tiến hành kỹ thuật mô học tế bào học [4] 1.2 Lịch sử hình thành phát triển hóa mơ miễn dịch Các ngun tắc hóa mơ miễn dịch biết đến từ năm 1930, phải đến năm 1941 nghiên cứu hóa mơ miễn dịch cơng bố Đó báo Albert H Coons - người có ảnh hưởng quan trọng phát triển kỹ thuật kháng thể gắn huỳnh quang Kỹ thuật hữu dụng số chẩn đoán phát độc tố vi khuẩn bệnh nhiễm trùng, song cần phải có kính hiển vi huỳnh quang khó thể chi tiết hình thái học tế bào gắn [5] Những thành công bước đầu hóa mơ miễn dịch thúc đẩy nhà giải phẫu bệnh tiếp tục tìm phương pháp để tránh hạn chế kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang Rất nhiều nhược điểm khắc phục phương pháp enzyme đời Năm 1966, Graham Karnosky phát triển phương pháp Horseradish peroxidase Năm 1967, Nakane Pierce 35 3.1.2 Quy trình nhuộm HMMD dấu ấn BRAF V600E tham khảo trường Boston University School of Medicine (theo phương pháp HMMD enzyme gián tiếp truyền thống) [46] - Mảnh bệnh phẩm cắt với độ dày 3-5 µm, dán lên lam kính tráng xilane - Tiêu để tủ ấm 750C 30 phút - Tẩy paraffin qua xylen cồn: Qua xylene 1, xylene bể phút Cồn 1000: bể, bể phút Cồn 950 phút Cồn 700 phút - Rửa nước cất phút - Bộc lộ KN dung dịch Citrat buffer pH 9,0 (Dako) 98 0C 12 phút - Để tiêu nguội tự nhiên nhiệt phòng Rửa nước cất lần - Khử peroxidase nội sinh H2O2 3% 10 phút - Rửa nước cất, rửa dung dịch TBS lần - Phủ KT1: KT1 kháng thể đơn dòng kháng BRAF V600E nguồn gốc từ chuột NewEast Bioscience, tỉ lệ pha loãng 1:100 ủ 2h nhiệt độ phòng - Rửa ngâm tiêu TBS lần - Phủ KT2: KT2 sử dụng hãng Dako, phủ ủ 30 phút - Rửa tiêu TBS lần - Phủ dung dịch DAB: Phủ DAB 1-3 phút - Rửa tiêu nước cất - Nhuộm nhân Hematoxyline, loại nước gắn bome 36 Đánh giá kết nhuộm: tiêu coi dương tính bào tương có màu nâu giống với màu chứng dương, trường hợp có nhân bắt màu coi âm tính 3.1.3 Quy trình nhuộm HMMD dấu ấn BRAF V600E hãng Spring (theo nguyên lý kỹ thuật HMMD enzym gián tiếp) [47] Quy trình nhuộm áp dụng với kháng thể đơn dòng BRAF V600E với chất màu DAB hệ thống Ventana Discovery XT BenchMark XT, BenchMark UL TRA, BenchMark GX Ví dụ quy trình máy BenchMark XT: - Chuẩn bị block BN, block chứng Cắt mảnh 3µm dán lên lam tráng silane Để tiêu tủ ấm 560C - 2h - Dán barcode cho tiêu ghi mã tiêu bản, ngày nhuộm, tên marker - Chuẩn bị hóa chất, kiểm tra máy: kiểm tra bổ sung hóa chất cịn thiếu vào máy, đổ chất thải - Đặt tiêu vào rãnh, chạy máy: tiêu đặt vị trí theo quy định nhà sản xuất Mỗi lần chạy tối đa 30 tiêu - Tẩy paraffin dung dịch EZ prep - Bộc lộ KN dung dịch CC1 - Khử enzym peroxidase nội sinh UltraView Inhibitor phút - Phủ dung dịch LCS giúp tiêu không bị khô suốt trình nhuộm - Phủ KT1: KT1 kháng thể BRAF V600E đơn dịng với nồng độ pha lỗng 1:100, điều chỉnh nhiệt độ phù hợp ủ 8-16 phút - Phủ KT2 (UltraView Multimer Ig) ủ 16 - 30 phút 37 - Phủ chất màu: máy phủ UltraView DAB Chromogen phút đến UltraView H 2O2 phút UltraView Copper phút - Nhuộm nhân Hematoxyline, làm xanh nhân dung dịch Bluing Reagent - Rửa nước, làm gắn bome 3.1.4 Kết nhuộm dấu ấn BRAF V600E số tiêu Hình 3.1: Ung thư đại trực tràng với BRAF V600E (Catalog: NBP2-29501- novusbio biological) 38 Hình 3.2: U hắc tố ác tính với BRAF V600E (Catalog: 20899-1-AP – proteintech) Hình 3.3: U hắc tố ác tính với BRAF V600E (Catalog 20899-1-AP- proteintech) 39 Hình 3.4: Ung thư tuyến giáp với BRAF V600E (Catalog 20899-1-AP- proteintech) 3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng tiêu nhuộm - Cố định không tốt: Dấu ấn BRAF nhạy cảm, cố định không tốt làm giảm đáng kể độ nhạy BRAF V600E Trong nghiên cứu K.Dvorak cộng ảnh hưởng việc cố định đến kết nhuộm HMMD BRAF V600E: để đạt kết nhuộm tốt BRAF V600E, mảnh mơ nên cố định với formol trung tính 10% vòng 12-24h cố định 2h sau lấy Nếu thời gian cố định nhỏ 6h lớn 72h hay để mẫu mô không cố định 6h làm giảm đáng kể độ nhạy BRAF V600E [30] Các bước thực Lấy bệnh phẩm Cố định - Các lỗi gặp Lấy bệnh phẩm không đạt yêu cầu BP không cố định sau lấy Chất cố định khơng thích hợp BP pha q dày, làm giập nát BP 40 Chuyển đúc Cắt dán mảnh bệnh phẩm Tẩy paraffin Bộc lộ kháng nguyên Chưa khử hết enzyme nội sinh KT1 KT2 Rửa TBS - Thời gian cố định không đủ, chất cố định không đủ thể tích khơng đủ nồng độ - Thời gian cố định q dài - Hóa chất chuyển khơng đảm bảo chất lượng, số lượng - Thời gian chuyển không phù hợp với loại bệnh phẩm - Không định hướng tốt bệnh phẩm, đúc chìm, block gắn kết khơng chặt chẽ - Mảnh cắt không đại diện tốt cho mẫu mô - Tiêu bị gấp, nhăn, xước, rách, dày mỏng không - Tiêu bị bong - Mô bị rạn, tan chảy - Khoảng cách mô bệnh mô chứng cách xa - Tiêu sau cắt để lâu nhuộm - Không gây che lấp kháng nguyên - Dung dịch bộc lộ không đảm bảo: không tỷ lệ, hết hạn sử dụng, tái sử dụng nhiều lần - Thời gian bộc lộ ngắn dài - Nhiệt độ bộc lộ cao thấp - Gây dương tính giả - Pha lỗng khơng tỉ lệ - KT hết hạn sử dụng bị hỏng (do bảo quản không kỹ thao tác kỹ thuật viên) - Thời gian ủ KT ngắn không đủ cho phản ứng xảy ra, thời gian dài gây dương tính giả - Nhiệt độ ủ cao hay thấp - Khơng đủ độ ẩm q trình ủ: tiêu bị khô - Dung dịch rửa không pha tỉ lệ, pH không 41 - Rửa thời gian ngắn tiêu không - Pha DAB không tỉ lệ - DAB hết hạn sử dụng bảo quản không Phủ DAB hợp lý - Phủ DAB: thời gian ngắn dài - Nhuộm nhân q nhạt khơng có tương Nhuộm nhân phản màu, đậm làm che lấp số kháng nguyên nhân dương tính yếu - Thừa thiếu bome Gắn bome - Có bọt khí, bọt nước 3.3 Vai trò chứng dương, chứng âm * Chứng dương: Mô chứng dương mẫu mô biết chắn có kháng ngun cần tìm (hay nói cách khác biết chắn dương tính), nhuộm giống với mô BN tất bước Mô chứng dương mơ nội sinh ngoại sinh Với marker cần mô chứng dương, thường cắt dán mảnh lam kính với mô BN để thuận lợi nhuộm tiết kiệm hóa chất, đảm bảo mơ chứng mơ bệnh nhân thực điều kiện giống Đối với marker BRAF V600E mơ chứng dương dùng mơ bệnh nhân có u hắc tố ác tính, ung thư đại trực tràng, ung thư tuyến giáp thể nhú,… Mơ cho dương tính tế bào u bắt màu nâu đỏ lan tỏa bào tương Bất kì trường hợp bắt màu với nhân tế bào bắt màu yếu với bào tương rải rác số tế bào u đánh giá phản ứng âm tính Nếu mơ bệnh nhân cho phản ứng âm tính chắn âm tính thật với đảm bảo mô chứng dương mô BN thực điều kiện giống khơng xảy sai sót khâu chuẩn bị mô BN (cố định, chuyển đúc, cắt) Nếu chứng dương cho phản ứng âm tính kết nhuộm mô BN không chấp nhận dù âm tính hay dương tính 42 * Chứng âm: Chứng âm mẫu mơ biết chắn âm tính nhuộm HMMD Có loại chứng âm: - Tiêu cắt mẫu mô biết chắn khơng chứa KN cần tìm, ta lấy vùng lành mô BN (nội sinh) mô khác (ngoại sinh) Mẫu mô nhuộm tương tự mơ bệnh nhân dán mảnh tiêu với mô bệnh nhân Hai tiêu cắt mô bệnh nhân, tiến hành nhuộm giống tiêu phủ KT1, Khi mô chứng âm cho phản ứng âm tính chứng tỏ KT1 có độ đặc hiệu cao mơ BN cho phản ứng dương tính dương tính thật.Khi mơ chứng âm cho phản ứng dương tính dù mơ BN cho phản ứng dương tính hay âm tính khơng có giá trị 43 KẾT LUẬN HMMD cho phép nhà Giải phẫu bệnh quan sát đánh giá hai phương diện: hình thái học miễn dịch học tế bào giúp chẩn đoán, phân loại, điều trị tiên lượng bệnh, đặc biệt khối u biệt hóa, khơng biệt hóa Tuy nhiên, để ứng dụng HMMD vào chẩn đoán ung thư xét nghiệm thường quy cần: phòng xét nghiệm xây dựng quy trình chuẩn, đầy đủ hóa chất trang thiết bị cần thiết; nhuộm máy tay, nhuộm tay người thực kỹ thuật nhuộm phải đào tạo tốt; lần nhuộm phải sử dụng mẫu mô chứng kèm theo để kiểm soát chất lượng Hiện nay, việc xác định đột biến BRAF ngày trở lên phổ biến, đặc biệt đột biến BRAF V600E Đột biến coi chìa khóa nhiều loại ung thư ung thư đại trực tràng, u hắc tố ác tính, u tuyến giáp thể nhú, bệnh bạch cầu tế bào tóc… Có nhiều phương pháp sinh học phân tử để xác định đột biến BRAF V600E xét nghiệm HMMD thường lựa chọn để thay phương pháp sinh học phân tử có độ nhạy, độ đặc hiệu cao tương đương với phương pháp sinh học phân tử; quan sát hình thái tế bào; kết trì lâu dễ dàng phiên giải; cho kết nhanh; tỉ lệ thất bại thấp hơn; giá thành rẻ khơng địi hỏi trang thiết bị đại thực rộng rãi labo xét nghiệm Ngồi ra, nhuộm dấu ấn BRAF việc ủ KT1 qua đêm 0C cho kết tốt so với ủ 30 phút nhiệt độ phòng TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Minh Hà (2014), Xác định đột biến gen EGFR gen KRAS định tính đáp ứng thuốc điều trị bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Đoàn Minh Khuy (2016), Đặc điểm mô bệnh học bộc lộ BRAF hóa mơ miễn dịch ung thư biểu mô đại trực tràng, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Hứa Thị Ngọc Hà (2015), Bài giảng chứng sinh học phân tử: Hóa mơ miễn dịch Đồn Thị Ngọc Thúy (2014), Kỹ thuật nhuộm Hóa mơ miễn dịch chuẩn đốn mơ bệnh học, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội De Matos LL, Trufelli DC, de Matos MGL, et al (2010) Immunohistochemistry as an Important Tool in Biomarkers Detection and Clinical Practice, 9–20 P.K.Nakane, G.B.Pierce (1966) Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens J Histochem Cytochem, 929-931 L.A.Sternberger, P.H.Hardy, J.J.Cuculis, et al (1970) The unlabeled antibody enzyme method of immunohistochemistry: preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidaseantihorseradish peroxidase) and its use in identification of spirochetes J Histochem Cytochem, 315-333 S Kim Suvarna, Christopher Layton, John D Bancroft (2012), Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 381 - 426 S.R.Shi, M.E.Key K.L.Kalra (1991) Antigen retrieval in formalinfixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections J Histochem Cytochem, 741-748 10 Dr.Kalpajyoti Bhattacharjee Imunohistochemistry Methods https://www.slideshare.net/DRKALPAJYOTI/immunohistochemistrymethods 11 Phạm Nguyên Cường (2014), Nghiên cứu phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô phổi theo WHO 2004 IASLC/ATS/ERS 2011 có sử dụng dấu ấn hóa mô miễn dịch, Trường đại học Y Hà Nội, Hà Nội 12 Nguyễn Kim Bình, Trương Nam Chi, Nguyễn Phúc Cương cộng (2001), Báo cáo khoa học kết thử nghiệm nhuộm hóa mơ miễn dịch bệnh viện Việt Đức từ tháng 10/2000 – 4/2001 13 Ekta Jajodia (2015) Principle of immunohistochemistry and its use in diagnostics,https://www.slideshare.net/ektataparia/principle-ofimmunohistochemistry-and-its-use-in-diagnostics 14 Hứa Thị Ngọc Hà Huỳnh Ngọc Linh (2002), Ứng dụng kỹ thuật hóa mơ miễn dịch chẩn đốn giải phẫu bệnh Tập huấn ứng dụng hóa mơ miễn dịch chẩn đốn Giải phẫu bệnh, 143 – 154 15 Nguyễn Văn Duy (2014), Quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng, ưu nhược điểm, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên 16 Bộ Y tế (2011), Sinh lý bệnh miễn dịch (Phần miễn dịch học), Nhà xuất Y học, Hà Nội 17 J A.Ramos-Vara (2005) Technical aspects of immunohistochemistry, Vet Pathol, 405-426 18 R C Graham, Jr M J Karnovsky (1966) The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique, J Histochem Cytochem, 291-302 19 R.C.Graham, U.Lundholm, M.J.Karnovsky (1965) Cytochemical Demonstration of Peroxidase Activity with 3-Amino-9-Ethylcarbazole J Histochem Cytochem, 150-152 20 I S Kaplow (1975) Letter: Substitute for benzidine in myeloperoxidase stains, Am J Clin Pathol, 451 21 C R Taylor J Burns (1974) The demonstration of plasma cells and other immunoglobulin-containing cells in formalin-fixed, paraffinembedded tissues using peroxidase-labelled antibody, J Clin Pathol, 14-20 22 K.H.Mohan, S.Pai, R.Rao, et al (2008) Techniques of immunofluorescence and their significance, Indian J Dermatol Venereol Leprol, 415-419 23 C S Holgate, P Jackson, I Lauder, et al (1983) Surface membrane staining of immunoglobulins in paraffin sections of non-Hodgkin's lymphomas using immunogold-silver staining technique, J Clin Pathol, 742-746 24 J Roth (1982) Applications of immunocolloids in light microscopy, Preparation of protein A-silver and protein A-gold complexes and their applicatio`n for localization of single and multiple antigens in paraffin sections, J Histochem Cytochem, 691-696 25 Hứa thị ngọc hà (2014) Hóa mơ miễn dịch chẩn đoán tiên lượng điều trị bệnh, Nhà xuất Y học, Tp Hồ Chí Minh 26 Breast Cancer Health Center (2014) Types of Breast Cancer: ER Positive, HER2 Positive, and Triple Negative 27 Jeffrey S Ross, Jonathan A Fletcher (2003) The HER - 2/neu gene and Protein in Breast Cancer 2003: Biomarker and Target Therapy, 7, 307325 28 Jeffrey S Ross, Jonathan A Fletcher (1998) The HER - 2/neu Oncogene in Breast Cancer: Prognostic Factor, Predective Factor, and Target for Therapy, 237-252 29 Piton N, Borrini F, Bolognese A, et al (2015) KRAS and BRAF Mutation Detection: Is Immunohistochemistry a Possible Alternative to Molecular Biology in Colorectal Cance, Gastroenterology research and practice 30 Dvorak K, Aggeler B, Palting J, et al (2014) Immunohistochemistry with the anti-BRAF V600E (VE1) antibody: impact of pre-analytical conditions and concordance with DNA sequencing in colorectal and papillary thyroid carcinoma Pathology, 509-517 31 Dvorak K, Palting J and Aggeler B (2013) Evaluation of BRAF (V600E) mutation by immunohistochemical staining with anti-BRAF V600E (VE1) antibody: A comparison with Sanger sequencing, Cancer Research, 42 32 Thiel A and Ristimäki A (2013) Toward a molecular classification of colorectal cancer: the role of BRAF, Frontiers in oncology, 33 Thiel A, Heinonen M, Kantonen J, et al (2013) BRAF mutation in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome, Virchows Archiv, 613621 34 Q.Ashton Acton, PhD General Editor (2013) Thyroid Nodules: New Insights for the Healthcare Professional 35 Sherilyn Alvaran Tuazon BRAF Gene Mutation Tests: Interpretation, BRAF and other cancers 36 Nicos M, Krawczyk P, Jarosoz B, et al (2015) Analysis of KRAS nd BRAF genes mutation in the central nervous system metastases of nonsmall cell lung cancer, Clin Eyp Med 37 Sanger F, Coulson AR (May 1975) A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase, J Mol Biol, 441 38 Day F, Muranyi A, Singh S, et al (2014) A mutant BRAF V600Especific immunohistochemical assay: correlation with molecular mutation status and clinical outcome in colorectal cancer, Targeted oncology, 99-109 39 Affolter K, Samowitz W, Tripp S, et al (2013) BRAF V600E mutation detection by immunohistochemistry in colorectal carcinoma, Genes, Chromosomes and Cancer, 748-752 40 Thiel A, Heinonen M, Kantonen J, et al (2013) BRAF mutation in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome, Virchows Archiv, 613621 41 Day F, Muranyi A, Singh S, et al (2014) A mutant BRAF V600Especific immunohistochemical assay: correlation with molecular mutation status and clinical outcome in colorectal cancer, Targeted oncology, 99-109 42 Aprile G, Macerelli M, De Maglio G, et al (2013) Relevance of BRAF and extended RAS mutational analyses for metastatic colorectal cancer patients, OA Molecular Oncology 43 Di Nicolantonio F, Martini M, Molinari F, et al (2008) Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer, Journal of Clinical Oncology, 5705-5712 44 K Pluzek, E Sweeney, K Miller, et al (1993) A major advance for immunocytochemistry Enhanced polymer one-step staining, Journal of Pathology, 169 45 Polak JM, Van Noorden S Polak JM, Van Noorden S (2003).Introduction to Immunocytochemistry, Bios Scientific Publishers Ltd 46 John K Feller, Shi Yang, and Meera Mahalingam Immunohistochemistry with a mutation-specific monoclonal antibody as a screening tool for the BRAF V600E mutational status in primary cutaneous malignant melanoma Modern Pathology, 414-420 47 Spring bioscience Mouse Anti-Human BRAF V600E Monoclonal Antibody (Clone VE1), Catalog E19290, E19292, E19294 ... cứu ? ?Tổng quan phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch với dấu ấn BRAF? ?? với mục tiêu: Sơ lược kĩ thuật nhuộm hóa mơ miễn dịch Trình bày số quy trình nhuộm hóa mơ miễn dịch dấu ấn BRAF 3 TỔNG QUAN TỔNG... Cắt dán mảnh .27 2.5.4 Nhuộm hóa mơ miễn dịch 28 QUY TRÌNH NHUỘM HĨA MƠ MIỄN DỊCH DẤU ẤN BRAF 32 3.1 Quy trình nhuộm Hóa mơ miễn dịch dấu ấn BRAF V600E số trung tâm giải phẫu... thuật: miễn dịch huỳnh quang miễn dịch men Miễn dịch huỳnh quang: cho phức hợp KN - KT gắn với chất huỳnh quang quan sát kính hiển vi huỳnh quang Miễn dịch men: Cho phức hợp KN - KT gắn với loại