Bài viết tiến hành xác định các nguyên nhân gây bệnh thán thư trên cây cà phê, cũng như xác định được sự đa dạng của các loài nấm Colletrotichum gây bệnh cho cà phê ở tỉnh Sơn La.
Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 XÁC ĐỊNH NGUYÊN NHÂN GÂY BỆNH THÁN THƢ TRÊN CÀ PHÊ CHÈ TẠI SƠN LA Morphological and Molecular Identification of Colletotrichum Species Associated with Anthracnose Disease of Arabica Coffee in Son La Province 1* Hoàng Văn Thảnh , Nguyễn Văn Tuất , Trịnh Xuân Hoạt Lê Thị Thảo Ngày nhận bài: 24.7.2018 Ngày chấp nhận: 17.8.2018 Abstract The research collected 32 isolates of Colletotrichum in coffee trees in Son La province, which included C siamense accounted for 50%, C theobromicola accounted for 18.75%, C gloeosporiodes accounted for 12.50%, C fragariae accounted for 12.50% and C acutatum accounted for 6.25% of isolates number When infected on coffee seedlings and on coffee berries, the disease symptoms were present in all infected Colletotrichum isolates and symptoms were similar with symptoms in the field The latent period time of disease cause by 32 isolates of Colletotrichum in coffee seedling was from 15.70-23.33 days The disease latent period time from 13.30 to 16.30 days in green coffee berries without wound, from 8.13-13.30 days in green coffee berries with wound, from 12.07 to 15.53 days on ripe coffee berries without wound, from 8.03-10.27 days on ripe coffee berries with wound The anthracnose severity in coffee seedling stems ranged from 15.00 to 42.50% after 35 days of infection The anthracnose severity in coffee berries with wound tend to be higher than those without wound The anthracnose severity in coffee berries with wound of ripe berries tends to be higher than the green one Keywords: Arabica coffee, Colletotrichum, Coffee Berry Disease, Gromerella, ĐẶT VẤN ĐỀ * Chi nấm Colletotrichum giai o n hữu t nh Glomerella c nhi u lo i l ối tư ng gây h i quan trọng sản xuất v sau thu ho ch nhi u lo i tr ng kh c M t số lo i thu c nấm Colletotrichum l lo i a th c c th gây h i nhi u lo i ký ch kh c nhau, Colletotrichum gloeosporioides c th gây h i xo i, bơ, c m i v nhi u tr ng kh c [8] m t số lo i nấm Colletotrichum c ph t hi n gây b nh trên c phê [Freeman, 2000] Trong nghiên cứu d a kỹ thu t phân t Hyde et al miêu tả 66 lo i thu c Colletotrichum sống phụ sinh, ho i sinh v ký sinh tr ng [6] Ở m t số vùng tr ng c phê giới, nấm Colletotrichum spp l nguyên nhân ch nh gây hi n tư ng rụng ối với c phê chè [2] D a v o phân t ch ặc i m hình th i, ặc i m sinh trưởng s i nấm, sinh h a v trình t DNA, Prihastuti Trường Đ i học Tây Bắc Vi n Khoa học Nông nghi p Vi t Nam Vi n Bảo v th c v t Corresponding author: hoangthanhtbu@gmail.com 54 (2009) ph t hi n c lo i nấm C gloeosporioides v C kahawae, C asianum, C fructicola v C siamense gây b nh c phê mi n Bắc Th i Lan [9]; lo i C gloeosporioides, C acutatum, C capsici v C boninense c ph t hi n gây b nh th n thư c phê Coffea spp.) tr ng t i Vi t Nam Nguyễn Thị Hằng Phương nnk (2010) [8] Hi n nay, di n t ch tr ng c phê t nh Sơn La t ha, giống Catimor c s dụng tr ng ph biến B nh th n thư l ối tư ng gây h i nghiêm trọng c phê t i Sơn La Hằng năm, b nh l m rụng - % số quả, ảnh hưởng lớn ến suất v chất lư ng c phê Song cho ến nay, vi c x c ịnh nguyên nhân gây b nh b nh th n thư h i c phê t i Sơn La ch yếu d a v o tri u chứng b nh v hình th i c a nấm chưa c nghiên cứu chuyên sâu X c ịnh ch nh x c nguyên nhân gây b nh th n thư c phê, c ng x c ịnh c s a d ng c a c c lo i nấm Colletotrichum gây b nh cho c phê Sơn La g p ph n cho công t c quản lý dịch h i theo hướng t ng h p t hi u quả, l cấp thiết v mặt khoa học v th c tiễn Kết nghiên cứu khoa học PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu thập phân lập mẫu nấm gây bệnh thán thƣ cà phê chè Sơn La Đi u tra, thu th p mẫu b nh th n thư t i khu v c tr ng c phê ch nh c a Sơn La bao g m huy n Thu n Châu, huy n Mai Sơn v th nh phố Sơn La Tiến h nh i u tra vườn > ha/vườn /huy n, thu th p bị b nh/vườn Thời gian lấy mẫu t th ng -7/2016 Mô tả tri u chứng v ặt ký hi u cho t ng mẫu thu th p c [1] Mỗi mẫu b nh c cắt mẩu nhỏ × mm ph n tiếp gi p mô b nh v mô khỏe, kh trùng b mặt c ch nh ng c c mẩu v o dung dịch NaOCl % ph t R a s ch ba l n nước cất kh trùng v ặt lên giấy thấm vô trùng l m khô Đặt c c mẩu ĩa môi trường nước cất v agar WA , o i u ki n nhi t C Khi nấm ph t tri n b mặt môi trường, cắt s i nấm ph n mép tản nấm v chuy n sang môi trường PGA Nấm gây b nh c nh n di n d a v o ặc i m c a tản nấm b o t phân sinh S dụng phương ph p cấy ơn b o t thu c c c mẫu c a nấm thu n [5] 2.2 Đánh giá tính gây bệnh nấm Colletotrichum 2.2.1 Đặc điểm gây bệnh nấm Colletotrichum sp thân cà phê chè giai đoạn Mỗi mẫu s dụng nh gi t nh gây b nh phương ph p lây b nh nhân t o Cấy ơn b o t c a t ng mẫu môi trường PGA với o ng y i u ki n C với i u ki n chiếu s ng v tối Tiến h nh chuẩn n ng b o t t b o t /ml bu ng ếm h ng c u p dụng công thức c a Duncan v Torrance (1992) [4] Lây b nh thân c th c hi n theo phương ph p c a Wokocha (2010) [19] Cây c phê giống Cartimor c tr ng t i nilon nh lưới, ảm bảo s ch b nh, tiến h nh lây nhiễm nhân t o t số l 6- l /cây Th nghi m c bố tr lặp l i l n, cây/mẫu nấm/l n lặp l i Mỗi c t o vết thương giới kim c kh trùng o n thân c c l Dùng b t lông BVTV - Sè 4/2018 nh ng v o cốc chứa dung dịch b o t b o t /ml v chải nh lên to n b thân Cây lây nhiễm c che ph nilon o i u ki n nhi t 8± C trước lây nhiễm l n thứ hai theo c ch tương t mô tả Sau lây nhiễm xong, tiến h nh ph nilon ảm bảo ẩm >8 % v ng ng y, i u o ki n nhi t 8± C, sau bỏ nilon v trì ẩm >6 % Demelash Teferi, [14] Cây ối chứng c lây nhiễm nước cất vô trùng theo c ch tương t Sau lây nhiễm, ghi nh n v nh gi thời gian b nh Sau , , , ng y lây b nh l n u, tiến h nh ki m tra nh gi mức gây h i h i theo cấp Waller, 1998) [17] T nh tỷ l b nh theo công thức T nh ch số b nh theo công thức P Trong + P l ch số b nh % + ni l số bị b nh tương ứng cấp b nh + vi l số cấp tương ứng; + N l t ng số th nghi m; + V l cấp b nh cao 2.2.2 Đánh giá đặc điểm gây bệnh nấm Colletotrichum sp cà phê chè B o t nấm c a t ng mẫu i di n cho c c mẫu nấm c chuẩn bị theo c ch mô tả S dụng c phê s ch b nh ph t tri n t c k ch thước g n tối a với lo i xanh v ch n ỏ Quả c phê th nghi m c kh trùng c ch ngâm v o dung dịch NaOCl % v ng ph t, r a s ch l n nước cất vô trùng, thấm khô giấy thấm vô trùng Quả c phê th nghi m c giữ tươi c ch quấn ẩm vô trùng u cuống Quả c lây nhiễm theo hai c ch l t o vết thương TVT c ch s dụng m i kim châm mm v o c phê v không t o vết thương KTVT Tiến h nh nhỏ µl dung dịch chứa b o t nấm b o t /ml lên vết châm Quả ối chứng nhỏ µl nước cất lên vết châm Quả lây b nh ặt h p nh a kh trùng, 55 Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 o i u ki n nhi t ph ng th nghi m 8± C Th nghi m c bố tr l n nhắc l i, xanh ch n/mẫu nấm/l n nhắc Đ nh gi tỷ l % bị nhiễm, vết b nh v ch số b nh % khoảng thời gian - ng y sau lây nhiễm [15] Phân cấp bị b nh theo thang cấp theo Quy chuẩn Vi t Nam số -38: 2010/BNNPTNT [10] Sau qu trình lây nhiễm, phân l p nấm ph t tri n v bị b nh môi trường PGA phục vụ ki m tra ặc i m hình th i c a nấm x c ịnh nguyên nhân gây b nh theo chu trình Koch’s 2.3 Xác định tên lồi nấm Colletotrichum gây bệnh thán thƣ cà phê T ch chiết DNA t ng số theo phương ph p CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide d a theo t i li u mô tả c a Doyle Doyle [3] S dụng cặp primer ITS ’-CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3’ v ITS ’- GAA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’ khuếch i o n gen vùng ITS Internally Transcribed Spacer với k ch thước sản phẩm PCR khoảng bp v th c hi n phản ứng, chu trình PCR d a theo t i li u mô tả c a White v c ng s [18] Sản phẩm PCR c i n di agarose gel % v ® chụp ảnh i n di GelDoc-IT 310 Imaging System United Kingdom Sản phẩm PCR c tinh s ch t agarose gel s dụng QIAquick PCR Purifcation Kit Qiagen, Đức v giải m trình t m y ABI3 Trình t c c mẫu c so s nh với Ngân h ng Gen ph n m m tr c tuyến http://blast.ncbi nlm nih gov/Blast.cgi [11] Cây phả h xây d ng theo phương ph p Neighbor-joining với khoảng c ch di truy n c c chuỗi c x c ịnh d a mơ hình thay Kimura hai tham số, gi trị thống kê bootstrap % với ph n m m MEGA [13] l n lặp l i 2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu C c số li u c c phân t ch thống kê s dụng ph n m m MINITAB , Excel KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Triệu chứng bệnh thán thƣ gây hại cà phê chè Sơn La B nh xuất hi n v gây h i tất c c giai o n ph t tri n c a v ặc bi t gây h i nặng t c phê hoa ến ch n hình Vết bệnh thường c hình tr n, m u nâu ến nâu en, mô b nh bị lõm xuống, c qu ng s ng bên ngo i, b mặt vết b nh c ường tr n ng tâm, ường k nh , -2,5 cm Vết b nh ban u thường xuất hi n mép l v lan d n v o bên phiến l Vết bệnh cành thường xuất hi n g n c c ốt c nh t o vết m u nâu en lõm xuống, bị nặng to n b c nh biến m u nâu en, c nh c c c vết nứt bi u bì chứa c c khối b o t m u v ng nhỏ khoảng mm, l c nh bị b nh c m u v ng v t n lụi d n Vết bệnh thường bắt u t vị tr cuống d nh với c nh hay t i i m tiếp x c quả; c c vết b nh ban u rõ với c c ốm nhỏ vỏ b nh l m cho vỏ lõm v o v trở nên sẫm m u; vết b nh ph t tri n lan r ng d n vỏ v ăn sâu v o l m khô en c nh rụng Hình Triệu chứng bệnh thán thƣ gây hại lá, cành cà phê chè Sơn La 56 Kết nghiên cứu khoa học 3.2 Một số đặc điểm hình thái nấm gây bệnh thán thƣ hại cà phê chè Sơn La Đ phân l p c mẫu nấm thu n BVTV - Sè 4/2018 phương ph p cấy ơn b o t môi trường PGA o i u ki n C v tối ho n to n Sau nuôi cấy ng y, tiến h nh o, quan s t ặc i m tản nấm hình Hình Tản nấm bảo tử phân sinh nấm Colletotrichum D a v o ặc i m hình th i, m u sắc tản nấm v b o t phân sinh, chia c c mẫu nấm Colletochitrum th nh nh m Nhóm I: tản nấm c m u trắng ến trắng nâu, s i nấm b mặt nhi u v m u trắng; thường xuất hi n b o t m u v ng xanh, nhỏ li ti, nằm rải r c b mặt môi trường nuôi cấy; b o t phân sinh hình trụ, thường c m t u tù v m t u nhọn, nhìn rõ c c giọt dịch; sau ng y nuôi cấy, k ch thước tản nấm t t 68, -8 ,33 mm, k ch thước b o t phân sinh 3, 3× ,6 - 8, × , µm Nhóm II: tản nấm c m u x m ến x m nâu, s i nấm b mặt nhi u v m u x m trắng; sau ng y nuôi cấy, k ch thước tản nấm t t 68,6 81,6 mm; b o t phân sinh hình trụ d i, thường c hai u tù, m t số c u tù v u nhọn, k ch thước ,86ì ,68- 8, ì , àm Nhúm III: tn nm c m u x m ến en x m, s i nấm b mặt t v c m u trắng nâu; sau ng y nuôi cấy, k ch thước tản nấm t ,678 ,33 mm; b o t hình trụ m t u tù, m t u nhọn, m t số t p l i, k ch thc ,6 ì , - , ì , àm Nhóm IV: tản nấm m u phớt h ng s i nấm b mặt t, ngắn, m u trắng h ng sau ng y nuôi cấy, k ch thước tản nấm t 66,6 -77,53 mm; b o t hình trụ, thường c hai u nhọn, k ch thước , × , - 8, 6ì , àm Nhúm V: tn nấm m u x m ến x m en, s i nấm mọc th nh c c vùng ki u v ng tr n ng tâm, s i nấm b mặt ngắn v c m u nâu en; sau ng y nuôi cấy, k ch thước tản nấm t 79,33-82,00 mm; b o t phân sinh thuôn d i, thường c u tù, m t u nhọn, m t số c hai u tù, k ch thước , × , 6- , ì , àm c i m ph t tri n c a c c mẫu nấm kh c c th ch ng thu c c c lo i ch ng kh c Kết n y trùng với nghiên cứu c a James v c ng s , Prihastuti v c ng s , Nguyễn Thị Hằng Phương , MacKenzie v c ng s [7] 3.3 Lây nhiễm nhân tạo thân cà phê chè giai đoạn Sau 16- ng y lây nhiễm, bi u hi n tri u chứng b nh ban u xuất hi n vỏ l c c ốm m u nâu, sau c c vết ốm lan r ng bao quanh thân, l m cho vết b nh lõm v o Cây bị b nh nặng c l chuy n m u v ng v dễ 57 Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 bị rụng Tri u chứng n y trùng với tri u chứng b nh h i c nh c phê ngo i ng ru ng Trong , c phê công thức ối chứng không bi u hi n tri u chứng bảng , hình Hình Triệu chứng bệnh thán thƣ sau 35 ngày lây nhiễm Tất c c mẫu nấm th nghi m u gây b nh cho c phê Ở i u ki n th nghi m, thời gian ti m dục c a b nh t ,6 - 3, ng y giai o n 6- l Thời gian ti m dục phụ thu c nhi u yếu tố c khả gây b nh c a c c mẫu nấm kh c mẫu nấm CBMS c thời gian ti m dục ngắn , ng y v d i l mẫu nấm MNTC tới 3, ng y Sau ng y lây nhiễm, tỷ l bị b nh c a c c mẫu t 3,33-66,6 % mẫu nấm c mẫu c khả gây b nh cho c c th nghi m % C c mẫu nấm c khả gây b nh cho c phê cao CBMS v CBMS với tỷ l b nh tương ứng l 63, 66% v 66,6 % v ch số b nh tương ứng l , %v 39,17% Trong i u ki n th nghi m, ch số b nh th n thư h i tăng nhanh t sau 20-3 ng y lây nhiễm v mức bị b nh c a c phê c s kh c c c mẫu nấm lây nhiễm bảng Bảng Kết lây bệnh nhân tạo mẫu nấm Colletotrichum spp lên cà phê chè Mẫu nấm CBMS1 CBMS2 CBMS3 CBMS4 CBMS5 CBMS6 CBMS7 CBMS8 CBMS9 CBMS10 58 Thời gian ti m dục ng y 16,47 15,70 16,63 17,87 17,53 18,35 18,00 17,87 15,60 17,53 Sau ng y Tỷ l b nh v ch số b nh % Sau ng y Sau ng y Sau ng y TLB CSB TLB CSB TLB CSB TLB CSB 33,33 30,00 23,33 23,33 20,00 16,67 13,33 16,67 26,67 23,33 13,33 11,67 8,33 9,17 10,00 5,83 5,00 6,67 8,33 8,33 40,00 43,33 30,00 56,67 40,00 33,33 23,33 23,33 36,67 43,33 24,17 24,17 19,17 37,50 20,00 14,17 11,67 10,83 20,83 15,83 40,00 46,67 43,33 56,67 43,33 46,67 40,00 33,33 46,67 53,33 29,17 30,00 27,50 33,33 26,67 20,83 17,50 13,33 35,00 27,50 63,33 50,00 53,33 63,33 66,67 60,00 53,33 36,67 53,33 63,33 42,50 32,50 33,33 36,67 39,17 26,67 24,17 15,00 38,33 32,50 Kết nghiên cứu khoa học Mẫu nấm CBMS11 CBMS12 CBMS13 CBMS14 CBMS15 CBMS16 MNTC1 MNTC2 MNTC3 MNTC4 MNTC5 MNTC6 MNTC7 MNTC8 MNTC9 NTC10 NTC11 MNTC12 MNTC13 NTC14 MNTC15 MNTC18 Thời gian ti m dục ng y 17,35 15,87 19,87 18,40 18,73 19,70 17,53 17,87 18,40 17,67 16,34 17,87 18,63 17,53 16,32 18,20 19,03 17,87 16,67 23,20 16,67 23,23 Sau BVTV - Sè 4/2018 ng y Tỷ l b nh v ch số b nh % Sau ng y Sau ng y Sau ng y TLB CSB TLB CSB TLB CSB TLB CSB 13,33 43,33 30,00 10,00 23,33 10,00 6,67 13,33 10,00 23,33 20,00 13,33 10,00 20,00 6,67 23,33 3,33 6,67 3,33 6,67 - 4,17 24,17 20,00 6,67 15,00 3,33 2,50 5,00 5,83 11,67 7,50 4,17 6,67 5,83 2,50 10,83 1,67 3,33 0,83 3,33 - 26,67 53,33 36,67 13,33 26,67 16,67 16,67 23,33 23,33 26,67 33,33 23,33 33,33 30,00 13,33 36,67 23,33 16,67 20,00 16,67 26,67 13,33 10,00 30,83 25,83 7,50 17,50 7,50 5,83 9,17 13,33 13,33 13,33 10,00 24,17 10,83 5,83 22,50 13,33 7,50 9,17 5,83 14,17 5,00 33,33 56,67 43,33 23,33 36,67 20,00 26,67 36,67 43,33 26,67 40,00 40,00 40,00 33,33 23,33 43,33 26,67 23,33 26,67 20,00 26,67 16,67 12,50 32,50 30,00 15,00 28,33 10,83 12,92 16,67 21,67 17,50 15,83 18,33 25,00 13,33 12,50 25,83 20,83 16,67 19,17 10,00 15,83 10,83 46,67 66,67 50,00 40,00 43,33 23,33 40,00 40,00 53,33 36,67 43,33 46,67 46,67 46,67 43,33 46,67 36,67 33,33 33,33 33,33 23,33 23,33 20,00 37,50 34,17 30,00 33,33 16,67 20,83 17,50 26,67 28,33 16,67 22,50 31,67 20,83 22,50 28,33 29,17 24,17 23,33 21,67 17,50 16,67 Ghi chú: hời gian tiềm dục theo dõi, đánh giá ngày sau lây nhi m lần cuối 3.4 Kết lây nhiễm nhân tạo cà phê chè Tri u chứng c lây nhiễm c ặc i m trùng với tri u chứng b nh h i c phê ngo i ng ru ng, công thức ối chứng không bi u hi n tri u chứng S xây x t c a t o i u ki n thu n l i cho nấm xâm nh p gây h i cho c phê Trong trường h p không c vết thương, thời gian ti m dục c a b nh d i so với trường h p t o vết thương t 3- ng y bảng v 3, hình Hình Triệu chứng bệnh thán thƣ cà phê xanh sau lây nhiễm 20 ngày 59 Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 Trên c phê xanh c t o vết thương, thời gian ti m dục c s kh c c c mẫu nấm, thời gian ti m dục c a MNTC ngắn nhất, MNTC d i t 8, ng y v 3,3 ng y, tương ứng Trên c phê xanh không t o vết thương, thời gian ti m dục c a CBMS ngắn nhất, MNTC d i t 3,3 ng y v 6,3 ng y, tương ứng Trên c phê ch n c t o vết thương, thời gian ti m dục c a CBMS ngắn t 8, ng y, MNTC8 d i t ,83 ng y Trên c phê ch n không t o vết thương, thời gian ti m dục c a CBMS ngắn t , ng y, CBMS v CBMS d i t , ng y Sau ng y lây nhiễm c phê xanh c t o vết thương, tỷ l b nh lây mẫu MNTC thấp t 3,33%, MNTC v MNTC8 cao t %; ch số b nh c c mẫu nấm MNTC thấp t ,3 %, MNTC t cao 38, % Sau ng y lây nhiễm c phê xanh c t o vết thương, tỷ l b nh c thấp MNTC t 36,6 % v cao MNTC8 t 6,6 %, ch số b nh c a CBMS thấp nhấp t 8,8 %, ch số b nh c a CBMS cao t 68, % Sau ng y lây nhiễm c phê xanh không t o vết thương, ngo i tr mẫu nấm CBMS v MNTC chưa bi u hi n tri u chứng b nh, c c mẫu nấm kh c u gây tri u chứng Tỷ l b nh thấp c c mấu nấm CBMS , CBMS 6, MNTC t 6,6 %; tỷ l b nh cao mẫu nấm MNTC t %; ch số b nh mẫu nấm CBMS l thấp t , % v MNTC cao t , 3% Sau ng y lây nhiễm không gây vết thương, tỷ l b nh thấp CBMS v CBMS t 6,6 %, tỷ l b nh cao CBMS , MNTC6, MNTC v MNTC t 33,33%, ch số b nh thấp CBMS t 3,33%, ch số b nh cao CBMS t ,8 % bảng Bảng Tỷ lệ bệnh số bệnh thán thƣ (Colletotrichum spp.) cà phê xanh sau lây nhiễm Mẫu nấm CBMS1 CBMS2 CBMS3 CBMS4 CBMS5 CBMS6 CBMS7 CBMS8 CBMS9 CBMS10 CBMS11 CBMS12 CBMS13 CBMS14 CBMS15 CBMS16 MNTC1 MNTC2 MNTC3 MNTC4 MNTC5 MNTC6 MNTC7 MNTC8 MNTC9 MNTC10 60 Thời gian ti m dục ng y TVT KTVT 10,13 10,20 9,03 9,65 10,23 10,00 12,53 9,30 10,07 10,27 10,20 10,07 9,37 10,33 10,27 10,40 10,26 10,62 10,47 10,38 10,41 10,59 10,47 9,42 9,83 10,57 14,67 14,60 13,53 13,74 13,67 13,37 15,53 14,67 13,47 14,30 14,47 13,30 14,70 14,30 14,43 14,47 14,70 14,31 14,61 14,31 14,61 14,19 13,57 13,83 14,73 14,57 Tỷ l b nh v ch số b nh sau lây nhiễm % ng y sau nhiễm ng y sau nhiễm TVT KTVT TVT KTVT TLB CSB TLB CSB TLB CSB TLB CSB 30,00 24,07 10,00 1,85 56,67 47,04 23,33 11,48 43,33 29,26 10,00 1,85 56,67 50,74 20,00 8,15 23,33 15,19 13,33 2,22 43,33 35,93 20,00 8,15 50,00 30,00 16,67 4,81 70,00 46,30 33,33 14,81 16,67 11,48 16,67 2,59 40,00 28,89 30,00 11,48 33,33 14,07 16,67 4,81 60,00 33,33 30,00 15,93 46,67 25,19 73,33 68,15 16,67 4,81 33,33 20,00 16,67 4,07 56,67 42,59 30,00 12,96 26,67 17,04 13,33 3,70 56,67 41,11 26,67 12,59 23,33 15,19 13,33 3,70 50,00 36,67 26,67 8,89 26,67 14,07 16,67 4,81 60,00 39,26 30,00 10,74 33,33 13,33 16,67 3,33 50,00 40,37 20,00 8,15 30,00 12,96 10,00 1,85 63,33 44,81 23,33 7,04 43,33 28,52 13,33 2,96 70,00 67,78 23,33 10,00 43,33 32,96 6,67 1,48 56,67 52,96 20,00 7,41 36,67 26,30 6,67 0,74 50,00 44,81 16,67 3,33 26,67 10,37 16,67 4,81 53,33 40,74 26,67 12,59 36,67 26,30 10,00 1,85 73,33 54,81 20,00 5,93 23,33 13,70 13,33 2,96 46,67 34,07 26,67 11,11 36,67 19,63 20,00 5,93 66,67 48,89 30,00 12,22 43,33 25,56 16,67 3,33 66,67 48,15 26,67 9,63 33,33 20,00 16,67 4,81 56,67 45,56 33,33 11,85 50,00 38,15 13,33 3,70 60,00 57,04 26,67 12,59 50,00 30,74 13,33 4,44 76,67 64,07 23,33 11,85 46,67 35,56 16,67 4,07 70,00 56,67 33,33 13,33 20,00 15,56 6,67 1,48 36,67 31,48 30,00 11,48 Kết nghiên cứu khoa học Mẫu nấm MNTC11 MNTC12 MNTC13 MNTC14 MNTC15 MNTC18 Thời gian ti m dục ng y TVT KTVT 8,13 10,71 10,56 13,30 12,37 10,20 13,70 14,91 14,61 16,30 14,13 14,47 BVTV - Sè 4/2018 Tỷ l b nh v ch số b nh sau lây nhiễm % ng y sau nhiễm ng y sau nhiễm TVT KTVT TVT KTVT TLB CSB TLB CSB TLB CSB TLB CSB 33,33 20,00 13,33 2,96 53,33 42,96 30,00 12,22 36,67 18,15 13,33 2,96 56,67 42,59 33,33 12,59 40,00 30,37 13,33 2,22 73,33 54,81 26,67 11,11 13,33 11,11 46,67 35,56 23,33 6,30 36,67 33,70 10,00 1,85 56,67 46,30 26,67 8,15 26,67 14,07 13,33 2,22 46,67 40,00 23,33 8,52 Ghi chú: V – tạo vết thương; K V – không tạo vết thương; LB – ỷ lệ bệnh; CSB – Chỉ số bệnh Sau ng y lây nhiễm c phê ch n c t o vết thương, tri u chứng b nh c lây c c mẫu nấm u c bi u hi n rõ; tỷ l b nh thấp CBMS v MNTC t 6,6 , tỷ l b nh cao CBMS8 t 6,6 %, ch số b nh thấp MNTC t 8,8 %, ch số b nh cao MNTC t ,63% Sau ng y lây nhiễm c phê ch n c t o vết thương, tỷ l b nh thấp CBMS t 33,33%, CBMS c tỷ l b nh cao t 86,6 %, ch số b nh thấp CBMS t , %, ch số b nh cao CBMS t ,8 % Trên c phê ch n không t o vết thương, sau lây nhiễm ng y tri u chứng b nh chưa xuất hi n lây nhiễm mẫu nấm CBMS15, -, mẫu nấm MNTC c tỷ l b nh thấp t 6,6 %, tỷ l b nh cao MNTC t %, MNTC ch số b nh thấp t , %, ch số b nh cao MNTC t 8, % Sau ng y lây nhiễm Trên c phê ch n không t o v t thương, tỷ l b nh thấp CBMS t 3,33%, tỷ l b nh cao MNTC t %, ch số b nh thấp CBMS v CBMS t , %, ch số b nh cao MNTC t ,8 % bảng Bảng Tỷ lệ bệnh số bệnh thán thƣ (Colletotrichum spp.) cà phê chín sau lây nhiễm (Sơn La, 2017) Mẫu nấm Thời gian ti m dục ng y TVT CBMS1 CBMS2 CBMS3 CBMS4 CBMS5 CBMS6 CBMS7 CBMS8 CBMS9 CBMS10 CBMS11 CBMS12 CBMS13 CBMS14 CBMS15 CBMS16 MNTC1 MNTC2 MNTC3 MNTC4 10,13 9,60 10,17 10,13 10,23 10,07 10,26 9,03 10,00 10,00 10,27 10,03 8,03 10,00 10,03 10,07 10,20 10,00 9,33 10,17 KTVT 13,37 13,80 13,43 13,53 12,67 13,33 14,43 13,43 13,67 12,54 13,26 12,07 14,67 12,80 15,53 13,33 14,10 13,41 13,53 13,26 ng y sau nhiễm TVT TLB CSB 46,67 25,93 50,00 24,07 43,33 13,70 36,67 16,67 43,33 16,67 33,33 20,00 40,00 15,56 56,67 29,26 26,67 13,33 43,33 18,89 40,00 18,52 33,33 11,11 36,67 15,19 43,33 14,44 33,33 13,33 33,33 12,59 46,67 22,96 36,67 18,15 43,33 16,67 46,67 18,52 KTVT TLB CSB 13,33 2,96 10,00 1,11 13,33 2,22 13,33 2,22 20,00 2,96 16,67 3,33 20,00 5,19 16,67 4,07 13,33 2,22 20,00 5,19 26,67 7,41 10,00 2,59 6,67 0,74 20,00 3,70 20,00 3,70 26,67 6,67 26,67 5,93 26,67 6,67 20,00 5,19 ng y sau nhiễm TVT TLB CSB 86,67 59,26 73,33 54,81 83,33 55,93 66,67 45,93 76,67 58,89 70,00 52,96 56,67 37,41 83,33 52,22 63,33 50,74 73,33 51,85 43,33 30,74 83,33 61,85 63,33 47,78 33,33 24,44 46,67 36,30 56,67 36,67 56,67 32,22 56,67 30,00 76,67 54,44 80,00 51,85 KTVT TLB CSB 16,67 6,30 20,00 5,19 20,00 6,67 26,67 7,41 33,33 10,37 36,67 10,37 26,67 15,93 26,67 10,37 30,00 6,67 40,00 12,22 13,33 22,96 20,00 5,19 23,33 6,67 23,33 9,26 23,33 7,78 46,67 10,00 40,00 20,00 40,00 19,26 33,33 16,30 26,67 14,07 61 Kết nghiên cứu khoa học Mẫu nấm Thời gian ti m dục ng y TVT MNTC5 MNTC6 MNTC7 MNTC8 MNTC9 MNTC10 MNTC11 MNTC12 MNTC13 MNTC14 MNTC15 MNTC18 BVTV - Sè 4/2018 9,24 9,42 10,27 10,83 8,73 10,30 9,03 10,50 10,00 10,07 10,23 10,10 KTVT 14,61 14,57 12,67 13,71 14,40 12,53 13,53 14,31 14,19 14,57 12,67 14,07 ng y sau nhiễm TVT TLB CSB 46,67 29,63 43,33 18,15 30,00 11,48 43,33 18,15 46,67 19,26 33,33 14,07 36,67 10,74 53,33 28,15 40,00 21,48 26,67 8,89 36,67 13,70 43,33 16,67 KTVT TLB CSB 16,67 3,33 26,67 6,67 23,33 4,07 26,67 6,67 23,33 5,56 20,00 3,70 20,00 4,44 30,00 8,52 10,00 1,85 6,67 0,74 20,00 4,44 20,00 4,44 ng y sau nhiễm TVT TLB CSB 83,33 52,22 76,67 52,96 50,00 41,11 76,67 50,00 76,67 52,22 56,67 44,81 76,67 53,70 80,00 53,33 56,67 39,63 56,67 38,89 80,00 54,07 56,67 43,33 KTVT TLB CSB 43,33 11,11 20,00 18,89 33,33 7,41 40,00 16,30 30,00 17,78 16,67 12,22 50,00 5,56 33,33 24,81 23,33 10,37 20,00 11,48 26,67 9,63 16,67 12,59 Ghi chú: V – tạo vết thương; K V – không tạo vết thương; LB – ỷ lệ bệnh; CSB – Chỉ số bệnh Ch số b nh th nghi m lây nhiễm c phê c t o vết thương cao so với c phê không t o vết thương Khi c phê c vết thương giới t o i u ki n thu n l i cho nấm Colletotrichum sp Kết th nghi m ch s xây x t v c vết thương l i u ki n thu n l i nấm Colletotrichum sp xâm nhiễm v gây b nh c phê c c giai o n ph t tri n Sau nấm xâm nhiễm gây b nh cho quảs ph t tri n c a ch số b nh phụ thu c v o khả gây b nh c a c c mẫu nấm kahawae, C coffaeophilum C coffenum, C acutatum c miêu tả Theo kết nghiên cứu c a Prihastuti , c lo i thu c nấm Colletotrichum gây b nh c phê t i m t số vùng mi n Bắc - Th i Lan, g m c c lo i C asianum, C siamense, C fructicola Theo Nguyen et al , x c ịnh c c c lo i nấm C gloeosporiodes, C acutatum, C capsici, C boninense gây b nh c phê t i m t số vùng tr ng c phê ch nh c a Vi t Nam 3.4 Xác định loài nấm kỹ thuật PCR phân tích phả hệ D a hình th i tản nấm v b o t phân sinh chia c c mẫu th nh nh m, nh m lấy % số mẫu nấm 6/3 mẫu tiến h nh giải trình t gen Mỗi mẫu nấm c phân l p thu n phương ph p cấy ơn b o t v giải trình t o n ITS cặp primer ITS /ITS Kết phân t ch mẫu nấm gây b nh th n thư c phê t i Sơn La x c ịnh c lo i nấm Colletotrichum gây b nh cho c phê Sơn La , mẫu nấm c mẫu thu c lo i C siamense chiếm %, mẫu thu c lo i C theobromicola chiếm 8, %, mẫu thu c lo i C gloeosporiodes chiếm , %, mẫu thu c lo i C fragariae chiếm , % v mẫu thu c C acutatum chiếm 6, % Hình C c nghiên cứu nấm Colletotrichum gây b nh c phê x c ịnh c c c lo i C asianum, C siamense, C fructicola, C gloeosporiodes, C 62 Hình Phân tích phả hệ mẫu nấm Colletotrichum phân lập cà phê chè (Sơn La, 2017) Kết nghiên cứu khoa học BVTV - Sè 4/2018 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ in northern Thailand, online December 2009, http://www.fungaldiversity.org/fdp/jinds3.php H.J Tode, 1790 Fungi Mecklenbergensis Selecti J.A.M Bedimo, D Bieysse, I Njiayouom, J Deumeni, C Cilas, J Nottéghem, Effect of cultural practices on the development of arabica coffee berry disease, caused by Colletotrichum kahawae, European Journal of Plant Pathology 119, 391-400 J.J Doyle, J.L Doyle, 1990 Isolation of plant DNA from fresh tissue, Focus, 12, 13-15 J.M Waller, B.J Ritchie, M Holderness, 1998 Plant Clinic Handbook IMI Technical Handbooks, CAB International, Egham 3, 94 10 K.Hy de L Cai, P Cannon, J Crouch, P Crous, U Damm, P Goodwin, H Chen, P Johnston, E Jones, 2009 Colletotrichum–names in current use, Fungal Diversity 39, 147-183 11 K Tamura, G Stecher, D Peterson, A Filipski, S Kumar, 2013 MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0, Molecular Biology and Evolution 30, 2725-2729 12 M Abdi, J Abu, 2015 Importance and Characterization of Coffee Berry Disease (Colletotrichum kahawae) in Borena and Guji Zones, Southern Ethiopia, Plant Pathology & Microbiology 13 N T H Phương, Colletotrichum spp associated with anthracnose disease on coffee in Vietnam and on some other major tropical crops, Doctoral Thesis, Swedish University of Agricultural Sciences, Alnarp 14 P.P Than, R Jeewon, K.D Hyde, S Pongsupasamit, O Mongkolporn, P.W.J.Taylor, 2008 Characterization and pathogenicity of Colletotrichum species associated with anthracnose on chilli (Capsicum spp.) in Thailand, Plant Pathology 57, 562 - 572 15 R.C Wokocha, N.E Nneke, C.I Umechuraba, 2010 Screening Colletotrchum gloeosporioides F.SP manihotis isolates for virulence on cassava in Akwa Ibom State of Nigeria, Tropical Agriculture 56-63 16 S.Freeman, 2000 Genetic diversity and host specificity of Colletotrichum species on various fruits, In D Prusky, S Freeman & M B Dickman (Eds.), Colletotrichum: Host specificity, pathology, and hostpathogen interaction (pp.131–144) St Paul: APS 17 S.J MacKenzie, J.C Mertely, T.E Seijo, N.A Peres, 2008 Colletotrichum fragariae Is a Pathogen on Hosts Other Than Strawberry, Plant Dis 92 18 T.J White, T Bruns, S Lee, J Taylor, 1990 Amplication and direct sequencing of fungal ribomsomal RNA genes for phylogenetics, San Diego, CA, UAS: Academic Press, 315-322 19 T.K Goh, 1999 Single-spore isolation using a hand-made glass needle, Fungal Diversity, 47-63 B nh th n thư h i c phê Sơn La c c nấm C siamense, C theobromicola, C gloeosporiodes, C fragariae C acutatum gây giải trình t gen mẫu cặp primer ITS /ITS c mẫu thu c lo i C siamense chiếm %, mẫu thu c lo i C theobromicola chiếm 8, %, mẫu thu c lo i C gloeosporiodes chiếm , %, mẫu thu c lo i C fragariae chiếm , % v mẫu thu c lo i C acutatum chiếm 6, % Tất c c mẫu nấm u c khả gây b nh cho c phê tri u chứng b nh th nghi m giống với tri u chứng b nh ngo i ng ru ng Thời gian ti m dục c a b nh t ,6 - 3,33 ng y C c mẫu nấm CBMS v CBMS c khả gây b nh cho c phê cao Thời gian ti m dục c a b nh t 8, -16,30 ng y xanh, t 8, 3- , ng y ch n Quả bị thương thời gian ti m dục ngắn xanh v ch n S ph t tri n, c a b nh c vết thương v chin c ng nhanh không bị thương v xanh Tiếp tục nghiên cứu s ph t sinh gây h i c a b nh th n thư Colletotrichum spp c phê chè ngo i ng ru ng t i Sơn L v th nghi m c c bi n ph p ph ng tr xây d ng c quy trình ph ng tr b nh hi u quả, an to n Lời cảm ơn Kết l m t ph n n i dung c a t i khoa học v công ngh cấp B Gi o dục v Đ o t o “Nghiên cứu c c giải ph p khoa học công ngh quản lý b nh th n thư h i c phê chè (Colletotrichum spp t i Sơn La”, m số B TTB - Ho ng Văn Thảnh l m ch trì t i TÀI LIỆU THAM KHẢO A.S.F, W Gish, W Miller, E.W Myers, D.J Lipman, 1990 Basic local alignment search too, l J Mol Biol 215, 403-410 B NN PTNT, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia phương pháp điều tra phát dịch hại trồng, QCN 01-38: 2010/BNNPTNT C Duncan, L Torrance, 1992 Techniques for the Rapid Detection of Plant Pathogens, Blackwell scientific Publishers, London D Teferi, 2014 Status of Released Coffea Arabica varities for their Resistance to Colletotrichum kahawae (Coffee Berry Disease) under laboratory condition, Discourse Journal of Agriculture and Food Sciences 2, 197-202 H Prihastuti, 2009 Characterization of Colletotrichum species associated with coffee berries Phản biện: TS Đặng Vũ Thị Thanh 63 ... rụng Hình Triệu chứng bệnh thán thƣ gây hại lá, cành cà phê chè Sơn La 56 Kết nghiên cứu khoa học 3.2 Một số đặc điểm hình thái nấm gây bệnh thán thƣ hại cà phê chè Sơn La Đ phân l p c mẫu nấm... lập mẫu nấm gây bệnh thán thƣ cà phê chè Sơn La Đi u tra, thu th p mẫu b nh th n thư t i khu v c tr ng c phê ch nh c a Sơn La bao g m huy n Thu n Châu, huy n Mai Sơn v th nh phố Sơn La Tiến h nh... LUẬN 3.1 Triệu chứng bệnh thán thƣ gây hại cà phê chè Sơn La B nh xuất hi n v gây h i tất c c giai o n ph t tri n c a v ặc bi t gây h i nặng t c phê hoa ến ch n hình Vết bệnh thư ng c hình tr n,