Nghiên cứu khả năng tổng hợp gamma aminobutyric acid (GABA) của vi khuẩn lactic từ bộ giống VTCC ứng dụng trong lên men chè giàu GABA

Từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng tổng hợp Gamma-aminobutyric acid GABA của vi khuẩn lactic từ bộ giống VTCC ứng dụng trong lên men chè giàu GABA.” Mục ti

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Thùy Dương

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỔNG HỢP

GAMMA -AMINOBUTYRIC ACID (GABA) CỦA VI KHUẨN LACTIC TỪ BỘ GIỐNG VTCC ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN CHÈ GIÀU GABA

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Thùy Dương

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỔNG HỢP

GAMMA -AMINOBUTYRIC ACID (GABA)

CỦA VI KHUẨN LACTIC TỪ BỘ GIỐNG VTCC ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN CHÈ GIÀU GABA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS ĐÀO THỊ LƯƠNG PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội - 2020

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Đào Thị Lương và KS

Hà Thị Hằng đã rất quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình

học tập và thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Quang Huy đã luôn động

viên và hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện làm luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô giáo trong Bộ môn Hóa Sinh học người đã tận tình giảng dạy và dìu dắt tôi trong suốt thời gian học tập tại trường Cùng toàn bộ cán bộ Viện Vi Sinh Vật và Công nghệ Sinh học (IMBT) – Đại học quốc gia Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, động viên, khuyến khích tôi rất nhiều trong suốt quãng thời gian qua

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 03 năm 2020

Học viên

Nguyễn Thị Thùy Dương

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về vi khuẩn axit lactic (LAB) 3

1.1.1 Khái niệm về vi khuẩn axit lactic 3

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của LAB 4

1.1.3 Chi Lactobacillus 8

1.2 Tổng quan về γ -Aminobutyric axit (GABA) 9

1.2.1 Gama-Aminobutyric axit (GABA) 9

1.2.3 Vai trò và chức năng của GABA 19

1.2.4 Tình hình nghiên cứu GABA 21

1.2.5 Giá trị của chè GABA và công nghệ sản xuất chè GABA 24

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

2.1 Nguyên vật liệu 26

2.2 Hóa chất và thiết bị 26

2.2.1 Hóa chất 26

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 26

2.3 Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu 26

2.4 Phương pháp nghiên cứu 27

2.4.1 Phương pháp phân tích GABA 27

2.4.2 Hoạt hóa chủng giống 31

2.4.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme glutamate decarboxylase cao 31

2.4.4 Định danh và phân loại chủng vi khuẩn lacticError! Bookmark not defined. 2.4.5 Thử nghiệm khả năng lên men tạo GABA trên lá chè của vi khuẩn lactic 37

2.4.6 Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng nghiên cứu 38

2.4.7 Khếch đại gen GAD trong vi khuẩn lactic cho việc lên men tạo GABAError! Bookmark not defined.

2.4.8 Nghiên cứu điều kiện lên men tạo GABA trên lá chè cao bằng việc sử

dụng chủng vi khuẩn lactic 39

2.4.9 Nghiên cứu phương pháp thu hồi, ảnh hưởng, tỷ lệ phối trộn của chất mang và bảo quản sinh khối chủng vi sinh vật Error! Bookmark not defined. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme glutamate decarboxylase cao 43

3.2 Định danh và phân loại chủng vi khuẩn lactic 44

3.2.1 Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn lactic 44

3.2.2 Phân loại vi khuẩn dựa trên phân tích trình tự rDNA 46

3.3 Thử nghiệm khả năng lên men tạo GABA trên lá chè 48

3.3.1 Khếch đại gen GAD trong vi khuẩn lactic cho việc lên men tạo GABA 48 3.3.2 Xác định GABA trong mẫu chè lên men bằng phương pháp HPLC 49

3.4 Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic 51

3.4.1 Lựa chọn môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp 51

3.4.2 Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 52

3.4.3 Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp 53

3.4.4 Lựa chọn điều kiện cung cấp khí 54

3.4.5 Lựa chọn tỷ lệ giống thích hợp 54

3.4.6 Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp 55

3.4.7 Lựa chọn nguồn Carbon thích hợp 56

3.4.8 Lựa chọn tỷ lệ Glutamate thích hợp 57

3.5 Nghiên cứu điều kiện lên men tạo GABA trên lá chè cao bằng việc sử dụng chủng vi khuẩn lactic 62

3.5.1 Lựa chọn thời gian lên men thích hợp 62

3.5.2 Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp 62

3.5.3 Lựa chọn độ ẩm lên men thích hợp 63

3.5.4 Lựa chọn chế độ lên men thích hợp 64

3.5.5 Lựa chọn tỷ lệ glutamate bổ sung thích hợp 65

3.6 Nghiên cứu phương pháp thu hồi, làm khô và bảo quản sinh khối

chủng vi sinh vật Error! Bookmark not defined.

3.6.1 Thu hồi sinh khối các chủng vi khuẩn bằng phương pháp ly tâmError! Bookmark not defined.

3.6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất mang và tỷ lệ phối trộn của chất

mang đến khả năng sống của vi khuẩn Error! Bookmark not defined.

3.6.3 Nghiên cứu điều kiện bảo quản sinh khối vi khuẩn lactic (dạng bột)Error! Bookmark not defined.

KẾT LUẬN 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1.Vai trò và chức năng sinh lý của GABA 20 Bảng 2.1.Mật độ quang phổ (OD 570nm) ở các nồng độ GABA 29

Bảng 2.2 Công thức phối trộn chất mang Error! Bookmark not defined

Bảng 3.1 Sàng lọc chủng lactic có khả năng sinh enzyme glutamatedecarboxylase 43 Bảng 3.2 Khả năng lên men tạo GABA trên chè của 4 chủng vi khuẩn 48 Bảng 3.3 Lựa chọn môi trường và thời gian nuôi vi khuẩn tạo GABA của 2 chủng VTCC-B-439 và VTCC-B-411 51 Bảng 3.4 Mật độ tế bào và pH sau nuôi của các chủng nghiên cứu ở pH ban đầu khác nhau 53

Bảng 3.5 Lựa chọn tốc độ ly tâm Error! Bookmark not defined

Bảng 3.6 Số lượng vi khuẩn trong sản phẩm sau đông khô với các công thức chất

mang khác nhau Error! Bookmark not defined Bảng 3.7 Mật độ vi khuẩn sau thời gian bảo quản trong điều kiện khác nhau Error! Bookmark not defined

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của GABA [87] 9

Hình 1.2: Phương trình phản ứng tổng hợp GABA từ Glutamate [88] 10

Hình 1.3 Con đường chuyển hóa GABA shunt [13] 12

Hình 1.4.Quy trình sản xuất chè đen và chè giàu GABA 25

Hình 2.1 Đường chuẩn GABA bằng phương pháp quang phổ 30

Hình 2.2 Đường chuẩn GABA xây dựng bằng phương pháp HPLC 31

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào (B) chủng B-439 44

Hình 3.2 Hình ảnh khuẩn lạc (A), và tế bào (B) chủng VTCC-B-411 45

Hình 3.3 Hình ảnh khuẩn lạc (A) và tế bào (B) chủng 66 45

Hình 3.4 Hình ảnh khuẩn lạc (A) và tế bào (B) chủng 67 46

Hình 3.5.Cây phát sinh chủng loại của các chủng nghiên cứu và các loài có quan hệ họ hàng gần thuộc chi Lactobacillus dựa vào trình tự rDNA 16S 47

Hình 3.6 Phát hiện GAD từ 2 chủng B-411 và B-439 49

Hình 3.7 Sắc kí đồ GABA bằng HPLC a, GABA chuẩn; b, dịch lên men chủng VTCC-B-411; c, dịch lên men chủng VTCC-B-439 50

Hình 3.8 Sinh trưởng của các chủng nghiên cứu ở các nhiệt độ 53

Hình 3.9 Sinh trưởng của các chủng ở các điều kiện cung cấp khí 54

Hình 3.10 Sinh trưởng của chủng Lactobacillus khi nuôi ở các tỷ lệ giống khác nhau 55

Hình 3.11 Sinh trưởng của các chủng nghiên cứu trêncác nguồn nitơ khác nhau 56

Hình 3.12 Sinh trưởng của các chủng nghiên cứu trên các nguồn carbon 57

Hình 3.13 Mật độ tế bào của các chủng nghiên cứu nuôi cấy trên môi trường có tỷ lệ glutamate khác nhau 58

Hình 3.14 Hàm lượng GABA trên chè lên men với các tỷ lệ giống khác nhau 63

Hình 3.15 Hàm lượng GABA trên chè lên men với độ ẩm khác nhau 64

Hình 3.16 Hàm lượng GABA trên chè lên men với chế độ lên men khác nhau 64

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) DNA Deoxyribonucleic acid (axit deoxyribonucleic)

RNA Axit ribonucleic

GABA Gamma -aminobutyric acid

GAD Glutamate decarboxylase

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High-performance liquid chromatography)

MỞ ĐẦU

Ngày nay, với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật cùng với nhu cầu cuộc sống ngày càng nâng cao, vấn đề sức khỏe đời sống con người ngày càng được chú trọng hơn, việc nghiên cứu và tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng nhận được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học Trong đó, Axit Gamma-Aminobutyric (GABA) là một hợp chất được nghiên cứu rất nhiều trong thời gian gần đây GABA là một amino axit phi protein có 4 carbon, được tìm thấy trong các loài vi khuẩn đơn giản đến cây trồng và ở ngay cả động vật có vú GABA được phát hiện trong cây từ hơn nửa thế kỷ trước.GABA là một chất dẫn truyền xung thần kinh quan trọng, có rất nhiều hoạt tính sinh học như giảm stress, chống oxy hóa, giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch,tiểu đường và giảm cholesterol trong máu GABA chủ yếu được hình thành bằng phản ứng α-decarboxylation không nghịch đảo của axit L–glutamic hoặc muối của nó, được xúc tác bởi enzyme decarboxylase glutamic Enzyme này được tìm thấy ở vi khuẩn như

Lactobacillus, Escherichia, Streptococcus, Aspergillus và Neurospora; ở trong thực

vật như chè, cà chua, đậu nành, gạo lứt nảy mầm Tuy nhiên vi khuẩn lactic là loại phổ biến nhất để sản xuất GABA Bởi vì, vi khuẩn lactic có những hoạt tính sinh lý đặc biệt và có thể xem như khá an toàn trong quá trình sử dụng vào mục đích chăm sóc sức khỏe cho con người

Chè là nguồn nguyên liệu rất dồi dào của việt nam, giá thành rẻ, nhưng cho tới nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào sử dụng lá chè xanh như một nguồn nguyên liệu chính trong quá trình sản xuất chè GABA Do vậy, đây là một trong những lý do chính giúp cho quá trình sản xuất chè GABA có ý nghĩa khoa học

và thực tiễn và có thể tạo ra nguồn cung cấp GABA rất tiện lợi với giá thành rẻ

Từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng tổng hợp

Gamma-aminobutyric acid (GABA) của vi khuẩn lactic từ bộ giống VTCC ứng dụng trong lên men chè giàu GABA.”

Mục tiêu:

- Sàng lọc được các chủng Lactobacillus có khả năng tổng hợp GABA cao

- Xác định được các điều kiện nuôi cấy phù hợp cho quá trình tạo sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic lựa chọn

- Nghiên cứu được phương pháp thu hồi sinh khối của chủng vi khuẩn lactic lựa chọn và xác định được ảnh hưởng của các chất mang cũng như tỷ lệ phối trộn của chất mang đến khả năng sống của vi khuẩn được lựa chọn

- Nghiên cứu điều kiện lên men trên chè thích hợp tạo GABA cao sử dụng các chủng vi khuẩn lactic lựa chọn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về vi khuẩn axit lactic (LAB)

1.1.1 Khái niệm về vi khuẩn axit lactic

Vi khuẩn lactic là một nhóm các vi sinh vật có chung sản phẩm trao đổi chất cuối cùng là acid lactic, đây là sản phẩm từ quá trình lên men của các carbohydrate LAB là các vi khuẩn Gram dương (+), có dạng trực khuẩn hay cầu khuẩn, ít di động, không sinh bào tử và đặc tính catalase âm tính (Herich, 2002) Chúng có thể

hô hấp kị khí hoặc kị khí tùy tiện Một số loài có thể sinh trưởng được khi có oxi

LAB thu nhận năng lượng nhờ phân giải carbohydrate và sinh acid lactic Khoảng nhiệt độ cho LAB hoạt động khá rộng Nhiệt độ sinh trưởng cho LAB ưa

ấm là 25oC - 30oC, ưa nhiệt là 40oC – 45oC và ưa lạnh là thấp hơn 5oC (Khalid, 2011) Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau tạo thành acid trong môi trường và sức chịu đựng acid cũng khác nhau Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn (khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trực khuẩn này có thể phát triển được ở pH = 4-3,8 còn cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn lactic ở vùng

pH = 5,5-6.0 Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease, chúng phân hủy được protein của sữa tới peptide và acid amin Hoạt tính này có ở các loài khác nhau, thường trực khuẩn là cao hơn Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn ethylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10-15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl tới 7-10% (Nguyễn Văn Thanh, 2001)

Nhóm LAB bao gồm nhiều chi khác nhau và bao gồm bốn chi tiêu biểu:

Lactobacillus, Streptococcus, Leucononstoc và Pediococcus Chi Bifidobacterium

cũng được coi là thuộc về LAB Hơn nữa, có một vài chi cũng thuộc dòng

Lactobacilli: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus, và Weissella (Halasz, 2009)

Dựa vào sản phẩm lên men, người ta phân vi khuẩn lactic thành 2 nhóm: + Lên men đồng hình: Là con đường lên men tạo ra 70-90% axit lactic Một số

chủng lên men đồng hình: Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus

+ Lên men dị hình: Là con đường lên men tạo ra ít hơn 50% axit lactic và tạo ra các

sản phẩm khác như axit lactic, CO2 và Etanol Một số chủng lên men dị hình:

Lactobacillus casei, Bifidobacteria

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của LAB

1.1.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng

Nhu cầu dinh dưỡng được phân làm ba loại là nhu cầu thiết yếu, nhu cầu kích thích, và nhu cầu không thiết yếu (Letort, 2001) Các chất dinh dưỡng thiết yếu

có tác động tuyệt đối đến sự phát triển của vi khuẩn và không thể phát triển khi không có các chất dinh dưỡng này Các chất dinh dưỡng kích thích sự trưởng của vi khuẩn và sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng này có thể dẫn đến sự sinh trưởng kém Các chất dinh dưỡng không thiết yếu không có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn, không tăng cường hay ức chế Tuy nhiên, chất dinh dưỡng, dù là thiết yếu, kích thích, hoặc không cần thiết, đóng một vai trò quan trọng trong việc tối ưu hóa

và kiểm soát các hoạt động trao đổi chất Do vai trò quan trọng của chất dinh dưỡng trong hoạt động trao đổi chất của LAB, nhu cầu dinh dưỡng của LAB được chú ý

nhiều hơn (Saeed, 2013)

a Nhu cầu về carbohydrates

Carbohydrates là nguồn cacbon và năng lượng chính, hình thành các thành phần thiết yếu trong môi trường của LAB cho sự sinh trưởng và chức năng bình thường (Donnell, 2011).Các nguồn carbon và năng lượng có thể sử dụng hầu hết các loại đường, nhưng một số lượng lớn các chủng LAB thích glucose (Kim, 2009).Tuy nhiên, các chủng LAB đã cho thấy sự ưu tiên giữa các loại đường khác nhau và trong khả năng lên men các loại đường khác nhau có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chúng Do đó, sự sinh trưởng và các hoạt động trao đổi chất của LAB có thể bị ảnh hưởng bởi các nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy (Degeest, 2001)

Sự khác nhau về nhu cầu carbohydrates giữa các chủng LAB có thể được sử dụng để điều tra, lựa chọn và xác định Fructose được bổ sung trong môi trường

MRS để phù hợp với sự tăng trưởng của L bulgaricus và MRS bổ sung maltose thích hợp cho sự khác biệt giữa L acidophilus và L paracasei [Tabasco, 2007]

Lactulose là một chất dẫn xuất lactose, thích hợp cho sự tăng cường sinh trưởng của

các chủng L ruminis (Donnell, 2011) Do đó, mặc dù glucose thường được sử dụng

trong môi trường nuôi cấy LAB, nhưng các loài LAB và thậm chí là các chủng cho thấy sự ưu tiên trong số các loại đường cho sự sinh trưởng tối ưu và hoạt động trao đổi chất Nồng độ đường cũng có thể ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và chức năng của LAB

b Nhu cầu về amino acids và peptides

LAB có nhiều nhu cầu về axit amin và peptide để đáp ứng nhu cầu nitơ phức tạp của chúng (Savijoki, 2006) Sự tiến hóa của môi trường phức tạp phức tạp dẫn đến việc lựa chọn dinh dưỡng thụ động có liên quan đến các điều kiện môi trường

ưa thích và khác nhau giữa các loài LAB (Von Wright, 2011) Amino axit và peptide có thể thu được từ các protease hoặc quá trình phân giải protein Các nhu cầu về peptide khác nhau giữa các chủng LAB, do đó các peptide có thể là nhân tố sinh trưởng thiết yếu hoặc nhân tố kích thích, một số chủng có thể phát triển mà không có chúng (Barrangou, 2011) Sinh trưởng của LAB phụ thuộc vào các axit amin từ các nguồn nitơ hữu cơ và sự sinh trưởng của LAB bị hạn chế bởi các axit amin từ nguồn nitơ vô cơ (Savijoki, 2006)

Các axit amin và peptit có thể được cung cấp từ các nguồn nitơ hữu cơ khác nhau như sữa gầy, cao men, tryptone, soy peptones, cao thịt bò, cao malt,…(Aguirre, 2008).Bên cạnh đó, peptide cũng có thể được cung cấp bởi các nguồn nitơ vô cơ như Ure, (NH4) 2SO4, NaNO3 Tuy nhiên, peptone, cao men, cao thịt bò thường được sử dụng cho sự sinh trưởng bình thường của LAB (Vazquez, 2004) Khi thay thế cao nấm men, peptone, cao thịt bò trong môi trường bằng cao

nấm men và peptone, L acidophilus, L plantarum, L casei có thể sinh trưởng trong khi các chủng lactobacilli khác như L delbrueckii subsp bulgaricus và L delbrueckii subsp lactis không thể sinh trưởng Do đó việc thay thế cao thịt bò, cao

nấm men, và peptone với các nguồn nitơ khác có thể ảnh hưởng tiêu cực đến sự sinh trưởng

c Nhu cầu về axit béo

Các axit béo thường liên kết với các hợp chất khác như glycerol, đường hoặc phosphate để tạo thành lipid Lipid là thành phần của cấu trúc tế bào

(phospholipids) và dự trữ năng lượng (triglycerides) Axit béo có nhiều chức năng sinh học được xác định một cách đầy đủ; tuy nhiên, dữ liệu về vai trò của axit béo

và chất béo như là yếu tố tăng trưởng cho LAB vẫn còn hạn chế (Desbois, 2010)

Sự tương tác giữa sự phát triển vi sinh vật và các axit béo bao gồm LAB đã chỉ ra tác dụng kháng khuẩn của axit béo (Desboi, 2010) Do đó, axit béo có thể ức chế sự phát triển của vi sinh vật, nhưng một lượng nhỏ chất béo như 0,1% có xu hướng kích thích sự phát triển của vi khuẩn (Jenkins, 2003)

Bên cạnh đó, hiệu quả ức chế của axit béo phụ thuộc nhiều hơn vào pH (Kankaanpa, 2001) Ngoài ra, mặc dù hiệu quả kháng khuẩn của axit béo đã được nghiên cứu kỹ lưỡng, cơ chế chính xác mà các axit béo ức chế sự phát triển của vi khuẩn chưa được xác định rõ (Desbois, 2010; Jenkins, 2003)

d Nhu cầu vitamin

Vitamin cần thiết cho LAB có thể được chia thành ba nhóm: vitamin thiết yếu, kích thích và không thiết yếu Nếu môi trường nuôi cấy bỏ qua các vitamin thiết yếu, sinh trưởng LAB có thể giảm 67% Vitamin kích thích dẫn đến giảm từ 34 đến 66% sự sinh trưởng khi bỏ qua, các vitamin không thiết yếu dẫn đến giảm nhiều nhất 65% sự sinh trưởng nếu bỏ qua Pantothenic, axit nicotinic và riboflavin là các chất thiết yếu cho hầu hết các chủng LAB (Letort, 2001; Wegkamp, 2010) Sự sinh trưởng của lactobacilli cần thiamine trong arabinose, ribose và gluconate đóng vai trò như một cofactor phosphoketolase, một enzym tham gia vào quá trình phosphate pentose Axit ascorbic không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của một số chủng LAB nhưng nó là yếu tố tăng trưởng cần thiết cho các chủng khác (Wegkamp, 2010) Do

đó, nhu cầu vitamin của LAB thể hiện nhiều sự khác biệt giữa các chủng, và một số vitamin có thể thay thế lẫn nhau Tuy nhiên, từng chủng có nhu cầu từ một đến bốn vitamin cho sự sinh trưởng bình thường

e Nhu cầu chất khoáng

Khoáng chất đóng một vai trò thiết yếu trong hoạt động tăng trưởng và

enzyme của vi khuẩn (Foucaud, 1997) Một số loài LAB như Leuconostoc mesenteroides không thể sinh trưởng khi thiếu ion kim loại, cho thấy nhu cầu thiết

yếucủacác ion kim loại (Foucaud, 1997) Các ion kim loại thiết yếu có một số chức

năng: 1) như các chất kích hoạt hoặc đồng kết hợp của một loạt các enzyme, 2) trong vận chuyển màng, 3) như các thành phần của các phân tử hoặc cấu trúc phức tạp (Hébert, 2004) Mangan (Mn2+) là ion cần thiết cho sự phát triển và hoạt động trao đổi chất của hầu hết các sinh vật bao gồm LAB Mn2+ có tác động sinh học đối với cấu trúc và hoạt hóa enzyme như glutamin synthetase, RNA polymerase, và phosphatase kiềm (Fitzpatrick, 2001) Magnesium (Mg2+) là một thành phần thiết yếu khác cho sự phát triển của LAB và các hoạt động trao đổi chất Mg2+ kích thích

sự phát triển của LAB và cải thiện sự tồn tại của LAB Mg2+ là oligoelement thiết

yếu cho sự phát triển của L delbrueckii subsp lactis (Hébert, 2004) Mg2+ cũng là

một ion kim loại thiết yếu cho sự sinh trưởng của S thermophilus (Leite, 2015)

Mg2+ và Mn2+ được bổ sung vào môi trường tối thiểu của L plantarum đảm bảo sự

sinh trưởng (Wegkamp, 2010)

1.1.2.2 Hoạt động trao đổi chất

Hoạt động trao đổi chất của LAB bao gồm sự phân hủy các carbohydrate khác nhau và các hợp chất liên quan để thu được năng lượng và các phân tử cacbon (Sanchez, 2008) Các hoạt động trao đổi chất khác như phá vỡ protein, lipid, và các hợp chất khác cũng rất quan trọng đối với sự sinh trưởng bình thường Do đó, các hoạt động trao đổi chất của LAB có thể bao gồm trao đổi carbohydrate, protein, lipid và các hoạt động trao đổi chất khác

a Trao đổi carbohydrate

Carbohydrate là nguồn năng lượng chính cho sự sinh trưởng của vi khuẩn LAB chuyển đổi carbohydrate thành các hợp chất hữu ích khác nhau (chủ yếu là axit lactic) thông qua quá trình phổ biến được biết đến như lên men Quá trình lên men là quá trình chuyển hóa đường, trong đó năng lượng có nguồn gốc từ quá trình oxy hóa từng phần của một hợp chất hữu cơ sử dụng các chất trung gian hữu cơ như các nhà cung cấp và nhận electron (Von Wright, 2011)

b Trao đổi protein

Các hoạt động phân giải protein của LAB rất quan trọng trong quá trình chín nhanh và điều chỉnh enzym của các sản phẩm thực phẩm khác nhau như pho mát Phân giải protein là quá trình phá vỡ protein thành các polypeptide, amino axit, và

peptide bởi enzyme proteinase và peptidase (Savijoki, 2006) Hệ thống phân giải protein của LAB rất quan trọng để tạo ra protein, peptide, và axit amin có sẵn cho

sự phát triển của vi khuẩn (Liu, 2010) Phân giải protein liên quan đến sự sinh trưởng của lactobacilli và lactococci trong sữa, nơi chúng chủ yếu chịu trách nhiệm

về sự phát triển hương vị trong sản xuất pho mát [Liu, 2010] Proteinase cũng làm tăng tính dị ứng của sữa và các sản phẩm sữa cho trẻ sơ sinh có thể dẫn đến một vài vấn đề dinh dưỡng nghiêm trọng về thiếu hụt năng lượng protein (Yuan, 2003)

c Trao đổi lipid

Sự trao đổi lipid liên quan đến sự phá vỡ lipid bởi lipase thành axit béo và glycerol Các chủng LAB có lipase nội bào hoặc ngoại bào (Meyers, 1996) Bên cạnh đó, các chủng LAB thực hiện các phản ứng chuyển hóa axit béo bao gồm đồng phân, hydrat hóa, trùng ngưng và bão hòa [Ogawa, 2005] Những chức năng này có thể được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và chế phẩm sinh học, nhưng không phải tất cả các chủng LAB đều có thể chuyển hóa lipid Meyers và cs (1996) đã sàng lọc trên 100 chủng LAB khác nhau để sản xuất lipase và chỉ xác định được 29 chủng tạo ra lipase (Meyers, 1996)

Hoạt tính lipase của LAB cung cấp các lợi ích sức khoẻ khác nhau cho vật chủ Lipase rất hữu ích trong việc chế tạo các chế phẩm ăn kiêng cho trẻ sơ sinh, người cao tuổi, và các bệnh nhân đang dưỡng bệnh (Ogawa, 2005; Taranto, 1998)

Tác dụng gây hạ lipit của Lactobacilluscó thể là do sự hấp thu lipid ở ruột thấp hơn hoặc do sự chuyển hóa lipid cao hơn (Taranto, 1998)

1.1.3 Chi Lactobacillus

Lactobacillus là chi gồm các vi khuẩn Gram dương, hình que không tạo bào

tử, catalase âm tính, sinh trưởng bằng hình thức lên men carbohydrate tạo axít lactic ( Hammes, 2009)

Trong số LAB, Lactobacillus cũng là chi bao gồm một số lượng lớn các loài

GRAS (thường được công nhận là an toàn) và nhiều chủng vi khuẩn quan trọng trong vi sinh vật thực phẩm và dinh dưỡng của con người do sự đóng góp của chúng vào quá trình lên men thực phẩm hoặc sử dụng chúng như là probiotic

Lactobacillus được phân nhóm dựa trên nhiệt độ tăng trưởng của chúng và quá trình lên đồng hình hay dị hình (Carr, 2002) Nhóm lên men đồng hình bao gồm

L acidophilus, L delbrueckii, L helveticus, và L salivarius.Nhóm lên men dị hình bao gồm L casei, L curvatus, L plantarum, L sakei, L brevis, L buchneri, L fermentum, và L reuteri

Nhiệt độ nhiệt độ sinh trưởng của Lactobacillus từ 20 đến 55oC, và chúng có thể phát triển trong khoảng pH 3-9 Nhiệt độ và độ pH sinh trưởng thích hợp cho

Lactobacillus lần lượt là 30-40oC và 6,5-8,0

1.2 Tổng quan về γ -Aminobutyric axit (GABA)

1.2.1 Gama-Aminobutyric axit (GABA)

GABA là một amino axit phi protein có 4 carbon, được tìm thấy trong các loài vi khuẩn đơn giản đến cây trồng và ở ngay cả động vật có vú GABA được phát hiện trong cây từ hơn nửa thế kỷ trước Tuy nhiên vai trò của nó ở trong thế giới thực vật vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, nhưng trong thế giới động vật thì các nhà khoa học đã tìm ra được vai trò của GABA: là một chất dẫn truyền xung thần kinh quan trọng, có rất nhiều hoạt tính sinh học như giảm stress, chống oxy hóa, giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch và thần kinh Ở vi khuẩn và thực vật GABA đóng vai trò trao đổi chất trong chu trình Krebs, còn ở động vật có xương sống nó đóng vai trò như một máy phát tín hiệu thần kinh mạnh (Diana và cộng sự, 2014)

GABA có công thức phân tử là: C4H9NO2

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của GABA [87]

1.2.1.1 Enzyme tổng hợp GABA

L-glutamate decarboxylase (GAD) là enzym xúc tác phản ứng tổng hợp GABA từ Glutamate khi loại đi một phân tử CO2 Hoạt động của enzym GAD cần một cofactor là pyridoxal phosphate (PLP)

Hình 1.2: Phương trình phản ứng tổng hợp GABA từ Glutamate [88]

GAD tồn tại dưới hai dạng đồng phân là GAD65 và GAD67 theo khối lượng phân

tử của chúng (lần lượt là 65 và 67 kDa) Chúng được mã hóa bởi hai gen độc lập nằm trên hai nhiễm sắc thể số 2 và số 10 ở người, gen GAD65 nằm trên NST số 10

và gen GAD67 nằm trên NST số 2 GAD67 là một enzym phân bố khắp các tế bào thần kinh GABAergic trong cơ thể Ngược lại, GAD65 chủ yếu được tìm thấy ở tận cùng các dây thần kinh và nó có thể được treo trên màng của các túi chất dẫn truyền thần kinh Cả GAD65 và GAD 67 đều được quy định thông qua sự phosphoryl hóa GAD65 được kích hoạt bởi sự photphoryl hóa trong khi GAD67 bị ức chế bởi sự photphoryl hóa GAD67 được photphoryl hóa bởi protein kinase C (PKC) Cả GAD67 và GAD65 cũng được quy định sau khi dịch bởi Pyridoxal 5’-phosphate (PLP); GAD được kích hoạt khi bị ràng buộc với PLP Đa số GAD67 bị ràng buộc với PLP vào bất kỳ thời điểm nào, trong khi GAD65 liên kết với PLP khi mà GABA là chất cần thiết cho sự dẫn truyền thần kinh Điều này phản ánh sự khác nhau về tính chất và chức năng của 2 đồng vị

1.2.1.2 Cơ chất tham gia tổng hợp GABA

Trong quá trình sản xuất Axit γ-aminobutyric (GABA) bằng vi khuẩn lactic thì Monosodium glutamate (MSG) được xem như là một cơ chất quan trọng (Kook

và cộng sự, 2010) MSG là một dạng muối của glutamic axit MSG trong tự nhiên sinh ra từ amino axit mà được tìm thấy trong đa số các thực phẩm Đặc biệt các thực

phẩm chứa hàm lượng protein cao chẳng hạn như phomai, sữa, thịt, cá và nhiều loại rau khác nhau Trong thực phẩm thường sử dụng MSG để tạo ra vị đã được biết tới khoảng 1200 năm về trước Nó đã có mặt trên thị trường cách đây hơn 300 năm Nhiều loại thực phẩm đã tăng thêm hương vị bằng cho thêm MSG với hàm lượng cao MSG trong một số loại thuốc đã chứng minh có thể hoạt hóa tế bào thần kinh ở chuột cống mới sinh Tuy nhiên, quá trình hoạt hóa tế bào thần kinh đã không xảy ra trong thực phẩm có MSG Ngoài ra, dựa vào vô số những chứng minh khoa học cũng đã công bố MSG là một gia vị thực phẩm không gây nguy hại đến sức khỏe con người mà nó có vai trò như một phân tử truyền tín hiệu không chỉ ở trong thần kinh

mà còn ở một số các mô khác Tuy nhiên, nếu quá trình tích lũy MSG vượt quá ngưỡng trong các khe xináp của tế bào thần kinh sẽ liên kết tạo ra những độc tố dẫn tới phá hỏng hoặc làm tổn thương tới tế bào Hơn nữa, MSG đã có nhiều công bố là gây độc cho tế bào thần kinh ở trẻ em dưới 5 tuổi Bởi vậy, sử dụng MSG như là một

cơ chất cho quá trình chuyển hóa thành GABA là một điều đáng được quan tâm

1.2.1.3 Cơ chế hình thành GABA

Trong cây và trong động vật, GABA được hình thành qua 3 enzyme: enzyme glutamate decarboxylase (GAD), enzyme GABA transaminase (GABA–T) và enzyme succinic seminaldehyde dehydrogenase (SSADH)

Chu trình thủy phân nitrogen bởi enzyme glutamine–synthetase hay glutamate–synthase (GS hay GOGAT) là một con đường chính để đồng hóa nitrogen thành glutamate và amino axit trong thực vật Glutamate decarboxylase (GAD) là một enzyme trong dịch tế bào chịu ảnh hưởng bởi phức hợp Ca2+–calmondulin (CaM), làm xúc tác cho quá trình decarboxyl glutamate biến đổi thành GABA Sau đó, GABA được chuyển vào trong ty thể và bị biến đổi thành succinic seminaldehyde bởi enzyme GABA transaminases sử dụng cả α–ketoglutarate (thành enzyme GABA–TK) và pyruvate (thành enzyme GABA–TP) như là những nơi tiếp nhận các amino axit Tiếp theo, succinic seminaldehyde được biến đổi thành succinate bởi enzyme succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH), sau đó tham gia vào chu trình TCA Cả ATP và NADH có thể trở thành chất ức chế hoạt động của enzyme SSADH Các enzyme succinyl–CoA ligase và α–ketoglutarate

dehydrogenase (α–KGDH) là các enzyme của chu trình TCA nhưng có liên quan đến chu trình biến đổi GABA và các enzyme này nhạy cảm với sự stress oxy hóa Succinic semialdehyde còn có thể bị biến đổi thành γ–hydroxybutyric (GHB) ở bên ngoài là dịch bào ở cả động vật và thực vật.Ở động vật có vú, GHB được biết đến như là một chất dẫn truyền xung thần kinh, trong khi đó, ở thực vật thì vẫn chưa biết rõ chức năng của GHB

Vai trò của enzyme GABA–TK vẫn còn đang được nghiên cứu, trong khi đó, vai trò của enzyme GABA–TP đã được nghiên cứu rõ ràng trong cây thuốc lá và cây hoa Arabidopsis GABA–TP là một enzyme chức năng cho quá trình biến đổi GABA GABA–TP có một vài chức năng đặc biệt ở các loài hoa: đóng góp vào sự cân bằng C:N, điều chỉnh lại độ pH, chống lại sự oxy hóa, bảo vệ cây khỏi côn trùng, GABA còn là chất điều hòa thẩm thấu màng tế bào (Palanivelu và cộng sự, 2003)

Hình 1.3 Con đường chuyển hóa GABA shunt [13]

Như vậy, cơ chất chính trong quá trình tạo thành GABA chính là glutamate, sau đó GABA sinh ra sẽ được chuyển hóa tiếp tạo thành succinic semialdehyde và cuối cùng tạo thành sản phẩm GHB (ở dịch tế bào) và succinate (ty lạp thể) Ngoài

ra ta cũng có thể thu được glutamate từ con đường dị hóa lysine (Bouche' và cộng

sự, 2004)

Có rất nhiều nghiên cứu mới để làm tăng hàm lượng GABA như tác động lên

bộ gen của enzyme glutamate dehydroxylase, biến tế bào thành một nhà máy sinh tổng hợp thừa GABA Bên cạnh đó, các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp lên

men bằng vi sinh vật Lactobacillus brevis, Lactobacillus paracasei, ; Escherichia

coli; Monascus,… trên nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau để sản xuất GABA và

còn nhiều phương pháp khác (Bouche' và cộng sự, 2004)

1.2.1.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến tổng hợp GABA

Các yếu tố lên men khác nhau ảnh hưởng đến tỷ lệ sản xuất GABA từ vi sinh vật Giữa chúng các nhân tố chung và cần thiết là pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, các chất phụ gia của môi trường Các điều kiện lên men có thể được tối ưu hóa dựa trên các đặc tính sinh hóa của GAD của các vi sinh vật lên men Hiệu quả của phảnứng này làm tăng tính kiềm của cytosol và môi trường Để duy trì pH tối ưu 5,0;

tại pH này sản xuất GABA cao nhất thu được bằng L brevis, H2SO4 đã được bổ

sung vào dịch lên men để bù lại sự gia tăng pH, phát sinh từ decarboxylation Tương

tự, hàm lượng glutamat 500 mM trong nuôi cấy vừa được chuyển thành 302 mM

GABA bằng cách tối ưu hóa điều kiện lên men của L paracasei NFRI 7415 ở pH 5.0

với việc bổ sung pyridoxal-5’- phosphate (PLP) (Komatsuzaki, 2005) Các sản xuất

GABA bởi Streptococcus salivarius subsp thermophilus Y2 cũng được tăng cường

bằng cách tối ưu hóa điều kiện lên men ở pH 4,5 và bằng cách bổ sung PLP

Các điều kiện tối ưu khác nhau giữa các vi sinh vật lên men do các tính chất khác nhau của GAD, do đó, đặc tính hóa hóa sinh của GAD sẽ được yêu cầu trong các vi sinh vật quan tâm để đạt được sản xuất GABA cao nhất Điều kiện tối ưu cho

vi sinh vật sản xuất GABA được tóm tắt dưới đây, đặc biệt ảnh hưởng của pH, nhiệt

độ, thời gian nuôi cấy, các chất phụ gia

• Ảnh hưởng của pH

Sự sinh tổng hợp GABA trong vi sinh vật chủ yếu được điều chỉnh bởi độ

pH, thường có tác động rõ rệt nhất đối với quá trình lên men (Komatsuzaki, 2005) Các đặc tính sinh hóa của GAD khác nhau giữa các vi sinh vật khác nhau, do đó giá trị pH hiệu quả cho sản xuất GABA tối là đa phụ thuộc vào loài (Li, 2010)

pH trong môi trường lên men thay đổi theo thời gian lên men, do đó độ pH ban đầu ảnh hưởng đến sản lượng GABA cuối cùng và pH của môi trường nên được điều chỉnh kịp thời để duy trì độ pH tối ưu (Li, 2010)

Sản xuất GABA cao bằng quá trình lên men không chỉ phụ thuộc vào kích hoạt hoạt động của GAD mà còn liên quan đến ức chế hoạt động của các enzyme

phân hủy GABA Một con đường để phân hủy GABA tồn tại trong rất nhiều loại thực vật và vi sinh vật

GABA transaminase làm xúc tác chuyển đổi thuận của GABA thành aldehyde succinic sử dụng pyruvate hoặc α-ketoglutarate như là chất chấp nhận amino và succinate semi-aldehyde dehydrogenase làm xúc tác sự chuyển đổi có thể

semi-đảo ngược succinate semi-aldehyin GABA transaminase phân lập từ Pseudomonas aeruginosa chuyển GABA hoạt động mạnh nhất ở pH 8,5 Các sinh vật khác, bao gồm Pseudomonads cũng như các sinh vật cao hơn cũng cho thấy hoạt tính cao nhất

của transaminase GABA khoảng pH 8,5 Succinic semi-aldehydedehydrogenase

phân lập từ Saccharomyces có pH tối ưu 8,4 cho hoạt động enzyme cao nhất Do

đó, hoạt động của hai enzyme nên bị cản trở bởi pH bằng cách điều chỉnh độ pH của đệm để đạt được sản xuất tối đa GABA

• Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ cũng là nhân tố ảnh hưởng sản lượng GABA tối đa bằng lên men Ngoài tác động lên hoạt động sinh học và ổn định, nhiệt độ còn có ảnh hưởng đến

sự cân bằng nhiệt động lựchọc của một phản ứng Việc chuyển đổi glutamate thành GABA đạt hiệu quả cao đòi hỏi mật độ tế bào cao và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp

Sản xuất GABA ở L brevis NCL912 có tương quan dương với mật độ tế bào, điều này phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy L brevis NCL912 tăng trưởng với nhiệt độ cao hơn và đạt ngưỡng tại 35ºC, sau đó giảm xuống khi nhiệt độ giảm L plantarumDSM19463 tổng hợp lượng GABA (59 μM / h) cao nhất khi được nuôi tại nhiệt độ giữa 30ºC và37ºC Nhiệt độ tối ưu cho L brevis GAD và L brevis CGMCC 1306 đã được tìm ra tại 30 ° C và 37 ° C; L brevis GABA100 nước ép

mâm xôi đen lên men sản sinh tối đa GABA (27,6 mg / ml) ở pH 3,5 và 30 ° C vào

ngày thứ 12 của quá trình lên men L buchneri nuôi cấy trong môi trường dịch thể MRS cũng có nhiệt độ tối ưu cho sản xuất GABA tại 30 ° C Tế bào của L brevis

đã sản xuất 92% GABA sau 8 giờ lên men Nói chung, nhiệt độ lên men dao động

từ 25 ° C đến 40 ° C, tạo ra sản lượng GABA cao

• Ảnh hưởng của thời gian lên men

Yếu tố thời gian đóng một vai trò quan trọng trong quá trình lên men và sản

xuất GABA khi nhiệt độ và pH làm L plantarum DSM19463 và L paracasei NFRI

7415 cần 72 giờ và 144 giờ lên men để đạt được sản lượng GABA cao nhất là 4,83

mM và 60 mM Nước mâm xôi đen lên men với L brevis GABA 100 đạt sản lượng

cao nhất GABA ở mức 25,4 mg / ml và 26,5 mg / ml vào ngày thứ 15 của quá trình lên men ở (25 ° C; pH 4,0) và (37 ° C; pH 5,5), trong khi đó nó đạt đến mức cao nhất của GABA vào ngày thứ 12 khi các mẫu được lên men ở pH 3,5 và 30 ° C

(Kim, 2009)

Thời gian bổ sung cho cơ chất GABA cũng ảnh hưởng đến năng suất cuối cùng của GABA cũng như nồng độ chất nền trong môi trường Một sự khác biệt đáng kể về sản lượng GABA giữa các lần bổ sung MSG khác nhau đã được hiển thị

trong quá trình lên men của Lc lactis, sản lượng GABA cao nhất thu được khi

MSG được thêm vào lúc bắt đầu lên men (0 giờ), sản lượng GABA giảm xuống khi MSG được bổ sung trong suốt 6 đến 96 giờ lên men trong khoảng thời gian 6 giờ Việc bổ sung PLP trong các khoảng thời gian khác nhau cũng ảnh hưởng đến việc sản xuất GABA (Yang, 2008) Sản xuất GABA ở 72 giờ đạt 6272; 6570 và 7333

mg / l khi PLP được thêm vào lúc 0; 24 và 48 giờ Lượng GABA cao hơn được tạo

ra bằng cách thêm PLP vào lúc 48 giờ so với lúc 0 và 24 giờ cho thấy rằng PLP có thể dễ dàng mất đi vai trò là coenzyme do mất kiểm soát đối với dịch nuôi cấy trong quá trình lên men Tuy nhiên , bổ sung PLP tại 48h cũng phục hồi một phần hoạt động GAD Những kết quả này chỉ ra rằng sản xuất GABA cao nhất do vi sinh vật

có thể phụ thuộc vào việc bổ sung các chất phụ gia thích hợp và thời gian bổ sung

tối ưu cho các chất phụ gia

• Ảnh hưởng của các chất phụ gia

Thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sản xuất GABA bằng quá trình lên men vi sinh Ngoài ra, các chất phụ gia bao gồm glutamate và PLP là coenzyme của GAD là những yếu tố chính ảnh hưởng đến sản xuất GABA trong quá trình lên men Thành phần môi trường, đặc biệt là nguồn cacbon , nitơ và các thành phần khác có thể ảnh hưởng đến sản lượng sản xuất GABA Ngoài ra, nồng độ cơ chất cũng quan trong cho năng suất GABA cao

L plantarum DSM19463 đã sản xuất 0,9 mM GABA bằng quá trình lên men

nho phải pha loãng tới 4% (w / v) trong tổng số carbohydrate (Di Cagno, 2010)

Trong số các loại carbohydrate khác nhau được thử nghiệm như L-arabinose; Ribose; D-xylose; galactose; glucose; fructose; maltose; Melibiose; a-metyl D-glucoside; N-acetyl D-glucosamine và gluconate làm nguồn carbon, glucose 1,25%

là carbon tốt nhất cho sản xuất GABA cao Bổ sung 0,5% ethanol làm nguồn carbon

trong quá trình lên men bằng cách sử dụng M purpureus NTU 601 và M pilosus

làm tăng sản xuất GABA và đạt đến 7453 và 385 mgGABA / kg Việc bổ sung 2,5% cao men, peptone và cao thịt là một nguồn nitơ sản xuất khoảng 200 mM

GABA So với việc lên men của M pilosuss không bổ sung MSG như là nguồn

nitơ, việc bổ sung 1,0% MSG vào môi trường của gạo 60 g đã khử trùng với peptone 1,0% (w / w) đã tạo ra GABA khoảng 2,8 lần (502,39 mg / kg) Ngay cả 0,5% urê như là một nguồn nitơ đã tăng cường sản xuất GABA trong quá trình lên

men với M purpureus 601 (Wang, 2003)

Bổ sung glutamate làm tăng sản xuất GABA bằng L paracasei và L brevis

Nồng độ GABA đạt 161 mM sau nuôi cấy 144 h trong môi trường chứa 500 mM

glutamate của L paracasei NFRI 7415, L brevis NCL912 và L brevis cũng tăng sản xuất GABA bằng cách bổ sung glutamate Tuy nhiên, S salivarius subsp thermophilus Y2 không làm tăng sản xuất GABA đáng kể khi glutamate được thêm

10-20g / l môi trường, cho thấy nồng độ glutamate này không thích hợp cho sự tổng hợp GABA trong loài này Việc sản xuất GABA bằng cách sử dụng glutamatelàm

cơ chất vẫn còn với một số vấn đề, như chi phí cao của môi trường nuôi cấy

PLP được sử dụng như là một coenzyme của GAD để tăng cường hoạt tính GAD Bằng cách bổ sung PLP, sản xuất GABA tăng lên và đạt đến 7333 mg / l, 200

mM và 504 mg / kg trong quá trình lên men với S salivarius subsp.thermophilus Y2, L paracasei NFRI 74150 và L plantarum C48 Việc bổ sung 0,1 mM PLP vào

nho đã pha loãng không làm tăng tổng hợp GABA , có thể là do sự có mặt của PLP trong nho (Castor, 1953) Việc bổ sung PLP trong môi trường nuôi cấy cho sản xuất

GABA bằng L brevis NCL912 không tăng số lượng GABA, cho thấy rằng L.brevis

NCL912 có thể tự tổng hợp PLP bằng chính nó (Li, 2010)

Việc bổ sung ion sunfat làm tăng hoạt tính GAD của L brevis IFO 12005

cho thấy hoạt động GAD tăng lên là do sự tương tác hydrophytobic tăng lên giữa

các tiểu đơn vị Tổng cộng 5% MSG đã được chuyển hóa thành GABA trong vòng

48 giờ khi 10 mM amoni sulfat đã được thêm vào môi trường phản ứng L brevis

GABA 057 Việc bổ sung trên 0,6% glucose mà không có amoni sulfat không làm tăng tỷ lệ chuyển hóa thành GABA (Su, 2003)

Khả năng sống sót của tế bào và sự ổn định trong hạt có thể được cải thiện với tỷ lệ chuyển đổi GABA cao hơn bằng cách điều chỉnh nồng độ các chất phụ gia truyền thông, baogồm skim milk, isomalto-oligosaccharide, erythritol và pectin một cách tối ưu nồng độ (Soo, 2006) Các hạt với 0,6% isomalto-oligosaccharide là sự kết hợp hiệu quả nhất cho sản xuất GABA và cũng cải thiện sự sống còn của probiotic trong sữa lên men (Chen, 2004)

1.2.2 Sản xuất GABA từ vi sinh vật

GABA có hàm lượng rất thấp trong các thực phẩm tự nhiên Do vậy, GABA được tổng hợp theo một số con đường như tổng hợp hóa học hoặc sinh học Tuy nhiên các sản phẩm GABA tổng hợp theo con đường hóa học có nhiều tác dụng phụ

do GABA tổng hợp được sản xuất từ pyrrolidinone (một thành phần bị xem là chất độc, không được cho phép sử dụng ở Nhật Bản), trong khi đó các sản phẩm GABA tự nhiên hoặc GABA được sinh tổng hợp trong quá trình lên men đã được chứng minh

là an toàn, hầu như không có tác dụng phụ trên động vật thực nghiệm và người

Hiện nay, quá trình sản xuất GABA có rất nhiều con đường khác nhau chẳng hạn: quá trình khử cacbon của axít glutamic nhờ phân cắt của GAD, tách chiết từ các loại ngũ cốc, tạo điều kiện tối ưu để hạt gạo nảy mầm cho hàm lượng GABA gần 15,8 g/300 g gạo, kích thích GAD trong mầm gạo để có thể chuyển hóa GABA đạt hiệu suất là 29 g/300 g mầm gạo hoặc lên men đậu tương bằng vi sinh vật Công nghệ sử dụng các vi sinh vật đặc biệt vi khuẩn lactic là một phương pháp tốt để sản xuất GABA

GABA chủ yếu được hình thành bằng phản ứng α–decarboxylation không nghịch đảo của axit L–glutamic hoặc muối của nó, được xúc tác bởi enzyme decarboxylase axit glutamic Enzyme này được tìm thấy ở vi khuẩn như

Lactobacillus (Bertoldi và cộng sự, 1999), Escherichia (Rice và cộng sự,1993),

Streptococcus, Aspergillus (Kato và cộng sự, 2002) và Neurospora (Kubicek và

cộng sự, 1979); ở trong thực vật như trà (Zhao và cộng sự, 2011), cà chua (Yoshimura và cộng sự, 2010), đậu nành (Serraj và cộng sự, 1998), gạo lứt nảy mầm (Daixin và cộng sự, 2008); và trong não của động vật có vú (Nathan và cộng

sự, 1994)

Tuy nhiên vi khuẩn Lactobacillus và nấm men là hai loại phổ biến nhất để

sản xuất GABA Bởi vì, vi khuẩn lactic có những hoạt tính sinh lý đặc biệt và có thể xem như khá an toàn trong quá trình sử dụng vào mục đích chăm sóc sức khỏe cho con người

Lactobacillus là một chi trong nhóm vi khuẩn lactic, là những trực khuẩn

không sinh bào tử thuộc nhóm vi khuẩn gram dương Trình tự gen GAD được tìm

thấy trong Lactobacillus brevis (Park O, 2007), Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus (Sun Z và CS, 2011), Lactobacillus paracasei (Komatsuzake N và CS, 2005), và Lactococcus lactis subsp lactis

(Nomura M và CS, 1999)

Do vậy, GABA được sản xuất từ vi khuẩn lactic có bản chất từ tự nhiên và

an toàn cho sức khỏe như làm tăng lượng GABA trong nước ép dâu Nhiều sản phẩm được làm tăng hàm lượng GABA bằng sử dụng những GABA sản xuất từ vi khuẩn lactic được phân lập từ sản phẩm của bơ, sữa đậu nành, kimchi, phophat và những sản phẩm lên men từ cá Một vài chủng sản xuất GABA đã được chứng minh

có tiềm năng sản xuất GABA ở quy mô lên men với thể tích lớn Chẳng hạn, chủng

Lactobacillus brevis NCL 912 phân lập từ paocai Trung Quốc đã thu được nồng độ GABA trong dịch lên men tối ưu là 3005,8 mM Leuconostoc sp NC5 phân lập từ

sản phẩm lên men của tôm Malaysia cho nồng độ GABA là gần 800 mM Đặc biệt,

chủng Latobacillus sakei B2-16 được phân lập từ kim chi Hàn Quốc đã có khả năng

lên men GABA từ dịch chiết cám gạo với nồng độ 660 mM Việc sàng lọc vi khuẩn lactic dựa vào khả năng tổng hợp GABA có thể mở ra một triển vọng mới về quá trình sản xuất GABA

Hiện nay, việc lên men có bổ sung vi khuẩn để tổng hợp GABA từ các nguồn nguyên liệu dồi dào trong nông nghiệp đang là một hướng mới đầy tiềm

năng Hoạt động của GAD trong chủng vi khuẩn lên men giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại pH thấp của môi trường Sau khi hấp thụ L-glutamate từ các transpoter đặc hiệu, GAD sẽ xúc tác phản ứng decarboxyl hóa L-glutamate trong tế bào chất, dẫn đến tiêu thụ một proton trong tế bào, kết quả làm tăng độ pH của tế bào chất

và tăng pH ngoại bào do chuyển đổi L-glutamate thành GABA kiềm hơn (Di Cagno

và cộng sự, 2009, Komatsuzake và cộng sự, 2005)

Ngoài ra, một số vi sinh vật khác cũng có khả năng sinh GABA đã được ứng dụng chẳng hạn như vi khuẩn kỵ khí đã sản xuất GABA trong các loại chè như chè mầm tươi, chè đen, chè Gabaron, chè Olong, chè xanh

1.2.3 Vai trò và chức năng của GABA

Ngày nay GABA được nghiên cứu nhiều do nó có hoạt tính sinh học mạnh, có nhiều chức năng sinh lý và nhiều tác động tích cực có lợi cho sức khỏe con người Như đã nói GABA là một chất dẫn truyền xung thần kinh quan trọng,

có rất nhiều hoạt tính sinh học, giảm thiểu nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch và thần kinh như bệnh Huntington, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer (Wong và cộng

sự, 2003)

Ngoài ra GABA còn có chức năng sinh lý khác như thư giãn (Wong và cộng

sự, 2003), mất ngủ và trầm cảm (Okada và cộng sự, 2000), các bệnh này đã được điều trị bằng GABA Hơn nữa, amino acid này góp phần làm tăng nồng độ của hormone tăng trưởng trong huyết tương và tỷ lệ tổng hợp protein trong não (Tujioka

và cộng sự, 2009) Mới đây các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng đó là một secretor mạnh của insulin, và do đó có thể giúp ngăn ngừa bệnh tiểu đường (Adeghate và cộng sự, 2002) GABA có thể làm chậm hoặc ngăn chặn sự xâm nhập và di căn của các loại tế bào ung thư khác nhau chẳng hạn như tuyến vú, đại tràng và các tế bào ung thư gan (Kleinrok và cộng sự, 1998; Minuk, 2000; Opolski và cộng sự, 2000) Ngoài ra, GABA còn có tế bào chống viêm và nguyên bào sợi hoạt động phổ biến, trong đó thúc đẩy việc chữa lành da vết thương (Han và cộng sự, 2007)

Vai trò và chức năng sinh lý của GABA đã được tổng hợp ở bảng 1.1 (Diana

và cộng sự, 2014)

Bảng 1.1.Vai trò và chức năng sinh lý của GABA Vai trò và chức năng

Dẫn truyền thần kinh Ức chế dẫn truyền thần kinh

Điều chỉnh huyết áp Giảm huyết áp

Bệnh não Làm giảm các rối loạn thần kinh

Bệnh tâm thần

Tăng cường trí nhớ Làm giảm các rối loạn tâm trạng Tác dụng thư giãn

Làm giảm triệu chứng mất ngủ Giảm phiền muộn

Phòng ngừa và điều trị các chứn nghiện rượu

Các cơ quan quan trọng

Bảo vệ và chống lại bệnh thận mãn tính Kích hoạt chức năng gan

Cải thiện chức năng thị giác Tăng tốc độ tổng hợp protein trong não

Hệ thống miễn dịch Tăng khả năng miễn dịch

Nâng cao hiệu suất của các nguyên bào sợi da

Tim mạch Làm suy giảm các phản ứng trao đổi chất làm thiếu

máu cục bộ

Kiểm soát đường hô hấp

Điều chỉnh nội tiết tố

Tăng hormone tăng trưởng Kiểm soát bài tiết hormone Kiểm soát progesterone Kiểm soát hormone tuyến giáp Ngăn ngừa béo phì

1.2.4 Tình hình nghiên cứu GABA

1.2.4.1 Tình hình nghiên cứu GABA trên thế giới

Nhóm tác giả N Lacroix ở Canada đã nghiên cứu khả năng sản xuất GABA

của các chủng Lactococcus được phân lập từ phô mai Các tác giả đã cho thấy rằng

trong tổng số 50 chủng vi sinh vật riêng biệt có trong hai mẫu phô mai, thì có chín vi sinh vật có thể sản xuất GABA, trong đó ULAAC–A13 và ULAAC–A23 có khả năng sản xuất GABA lên đến 50 mg/300 ml sữa lên men Nghiên cứu này cho thấy rằng chủng vi sinh vật sản xuất GABA trong phô mai cứng và phô mai bán cứng với những điều kiện phổ biến trong việc sản xuất GABA (Lacroix và cộng sự, 2013)

Bên cạnh đó, nhóm tác giả Jannoey ở Thái Lan đã nghiên cứu quá trình tích lũy GABA ở gạo trong suốt thời gian nảy mầm Sự tích lũy GABA trong gạo và lá của năm giống gạo đã được nghiên cứu trong suốt thời gian nảy mầm Các tác giả cho thấy mặc dù các giống gạo khác nhau có hàm lượng axit glutamic khác nhau nhưng hàm lượng GABA trong gạo không khác nhau nhiều (chênh lệch khoảng 0.05%) Hàm lượng GABA trong gạo và lá tăng đáng kể trong suốt thời gian nảy mầm Tuy nhiên trong lá có hàm lượng GABA cao hơn so với hạt gạo (gấp 2 – 3 lần

ở tất cả giống gạo) Nghiên cứu cho thấy gạo là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất GABA (Jannoey và cộng sự, 2010)

Ngoài những nghiên cứu trên, nhiều nhóm tác giả cũng đã nghiên cứu về những điều kiện đặc biệt để làm tăng hàm lượng GABA trong suốt quá trình chuyển hóa Nhóm của tác giả Shigematsu ở Nhật Bản đã nghiên cứu quá trình chuyển hóa sinh học axit glutamic thành GABA bằng áp lực cao Kết quả cho thấy tính khả thi của giả thiết sử dụng công nghệ áp lực cao để thay đổi con đường trao đổi chất của

tế bào vi sinh vật và tích lũy cơ chất có lợi (Shigematsu và cộng sự, 2010)

Nhóm của tác giả Lee ở Hàn Quốc đã nghiên cứu quá trình sản xuất GABA bằng glutamate decarboxylase cố định Các tác giả đã phát triển công nghệ sản xuất

GABA sử dụng his – tag thông qua sự cố định của Escherichia coli–derived

glutamate decarboxylase (GAD) Dựa vào nghiên cứu hoạt động của enzyme cụ thể

và đặc tính phản ứng, axit glutamic được ưu tiên chọn hơn monosodium glutamate (MSG) để làm cơ chất chính cho GAD cố định (Lee và cộng sự, 2013)

Điều đáng quan tâm là một số nhà nghiên cứu Nhật Bản và Đài Loan đã phát hiện khi lên men chè trong điều kiện nhất định đã sinh ra một lượng lớn GABA Từ kết quả nghiên cứu, Nhật Bản và Đài Loan đã bắt đầu sản xuất một loại sản phẩm mới là chè GABA Loại chè này rất dễ uống như tất cả những sản phẩm chè truyền thống khác (chè đen, chè xanh, chè Olong .) và rất có lợi cho sức khỏe và hoàn toàn không có tác dụng phụ như đã được công bố (Cho và cộng sự, 2007)

Theo công trình nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Ứng dụng, Đại học quốc gia Jeju, Hàn Quốc (2012) Chè được lên men trong môi trường kỵ khí có chứa nitơ liên tục trong thời gian từ 6 đến

12 giờ thu được hàm lượng GABA cao gấp 12 lần so với chè không lên men trong môi trường kỵ khí (từ 25.8mg/300g lên 312.7mg/300g), mà các hợp chất hoạt tính sinh học như các axit amin tự do khác như alanin, valin, leucine, isoleucine, proline,

và asparagin đã tăng lên, còn các axit hữu cơ và chất béo trong chè không thay đổi, phù hợp với công bố trước đó của (Wang và cộng sự, 2006)

1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu GABA ở trong nước

• Tách chiết GABA từ đậu tương

Năm 2007 Viện Công nghệ Thực phẩm chủ trì dự án cấp nhà nước về nghiên cứu tách chiết GABA từ đậu tương để sản xuất một số thực phẩm chức năng giàu GABA phòng chống bệnh ung thư Tuy nhiên, khả năng ứng dụng sản xuất ở mức quy mô công nghiệp vẫn chưa hiệu quả vì việc tách chiết chiết GABA từ đậu tương

là một công nghệ phức tạp, khó có thể đưa vào sản xuất công nghiệp vì hàm lượng GABA trong đậu tương không lớn Khối lượng sản phẩm chính là GABA thu được rất nhỏ so với lượng đậu tương dùng làm nguyên liệu để sản xuất GABA, điều đó làm giá thành sản phẩm tăng lên rất cao khó được chấp nhận trên thị trường Trong khi đó, một số công ty dược của Trung Quốc đang bán sản phẩm có hàm lượng GABA cao với giá chỉ khoảng 400.000 đồng/kg

• Sản xuất thực phẩm chức năng từ lên men dịch cám gạo

Năm 2013, TS Trịnh Tất Cường và cộng sự thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã thực hiện đề tài của bộ KH&CN “Nghiên cứu qui trình sản xuất axít

gamma amino butyric từ lên men dịch cám gạo bằng Lactobacillus để ứng dụng làm

thực phẩm chức năng”

Đề tài hướng đến mục tiêu: xây dựng quy trình sản xuất axít gamma amino

butyric từ lên men dịch cám gạo bằng Lactobacillus (10lít/mẻ)

Trong số các thực phẩm truyền thống, cám gạo là nguồn nguyên liệu rất dồi dào, giá thành rẻ và gần như chỉ sử dụng để làm thức ăn gia súc Tuy nhiên, hiện

chưa có một công trình nghiên cứu nào ứng dụng vi khuẩn Lactobacillus lên men từ

dịch cám gạo để sản xuất GABA có hoạt tính kích thích miễn dịch ổn định Đề tài

đã chọn được chủng Lactobacillus có khả năng sinh ra GABA từ dưa muối, tìm

điều kiện phù hợp cho quá trình lên men (các thông số pH, nhiệt độ, tỉ lệ O2), tối ưu hóa các thành phần trong dịch lên men cám gạo, sản xuất GABA ở dạng bột bằng phương pháp kết tinh, xác định hoạt tính sinh học của GABA thu được thông qua thụ thể đặc hiệu GABA và khả năng sống của dòng tế bào P12 (tế bào thần kinh phân lập từ chuột) bị ức chế bằng H2O2 Kết quả, đề tài đã phân lập được chủng

Lactobactillus plantarum KLEPT từ dịch dưa muối Đây là nguồn nguyên liệu sẵn

có giúp việc phân lập chủng vi sinh vật có hoạt tính rất thuận lợi

Đề tài đã xây dựng được quy trình sản xuất GABA từ lên men dịch cám gạo

bằng Lactobacillus plantarum KLEPT Hàm lượng GABA thu được tương đối cao

660 nM tương đương với 700 gram GABA trong 10 lít dịch lên men Quá trình thực hiện cho thấy, việc sản xuất GABA tương đối đơn giản và có giá thành khá thấp

Sản xuất GABA từ gạo lức nẩy mầm

Năm 2012 TS.Cung Thị Tố Quỳnh cùng công sự đã thực hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất gạo mầm (gạo GABA) từ gạo lức nẩy mầm“, mã số KC.07.TN02/11-15

Kết quả nghiên cứu đã khẳng định có thể sản xuất được gạo GABA từ nguồn nguyên liệu gạo lức Huyết Rồng và Jacmine của Việt nam với quy trình công nghệ như sau: Gạo lức được ngâm trong nước có pH 6, nhiệt độ 300C trong 20 giờ, sau

đó gao được ủ ở nhiệt độ 350C trong 36 giờ đối với gạo Jacmine và trong 40 giờ đối với gạo Huyết Rồng, kết hợp thổi khí.Gạo được sấy ở nhiệt độ 600C trong thời gian

18 giờ Gạo mầm thu được có hàm lượng GABA khá lớn (140 ppm) gấp 5 lần so với gạo lức nguyên liệu

Đề tài đã tạo ra một hướng ứng dụng trong sản xuất các loại gạo dinh dưỡng

có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam Gạo GABA có thể sử dụng như gạo thông thường

để nấu ăn hoặc sản xuất bột dinh dưỡng có chứa GABA cao

1.2.5 Giá trị của chè GABA và công nghệ sản xuất chè GABA

1.2.5.1 Giá trị của chè GABA

Cho tới nay vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào sử dụng lá chè xanh như một nguồn nguyên liệu chính trong quá trình sản xuất chè GABA Trong khi

đó, nguồn nguyên liệu từ lá chè xanh trong nước rất dồi dào, giá rẻ Do vậy, đây là một trong những lý do chính giúp cho quá trình sản xuất chè GABA có ý nghĩa khoa học và thực tiễn và có thể tạo ra nguồn cung cấp GABA rất tiện lợi với giá thành rẻ

Việc sản xuất chè GABA sẽ tạo ra sản phẩm rất có giá trị với những lý do sau đây:

+ Chè vốn dĩ đã là một loại đồ uống rất phổ biến nhưng rất được coi trọng về tính chất dược lý của nó Chè chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao như các hợp chất polyphenol đặc biệt là Epigalocatechingalat có khả năng chống oxy hóa cao, + Hợp chất L-theanine có tác dụng điều hòa hệ thần kinh trung ương và điều hòa hệ tuần hoàn,

+ Caphein trong chè có tác dụng kích thích hệ thần kinh trưng ương làm cho con người hưng phấn, khỏe mạnh

+ Theobromin và Theophilin có tác dụng tốt kích thích hệ bài tiết, giúp cho việc thải chất độc ra khỏi cơ thể dễ dàng .v.v

+ Việc chè có thêm GABA sẽ tạo ra lợi thế rất cao để cung cấp cho con người một loại nước uống có tính chất của một thực phẩm chức năng vừa dễ sử dụng, vừa

có tính phổ biến cao và giá thành thấp hơn bất kỳ loại thực phẩm chức năng nào có

bổ xung GABA

1.2.5.2 Công nghệ sản xuất chè giàu GABA

Về nguyên tắc, quy trình sản xuất chè đen GABA cơ bản cũng giống như sản xuất chè đen thông thường, chỉ khác nhau điểm cơ bản là quá trình lên men

Hình 1.4.Quy trình sản xuất chè đen và chè giàu GABA

Như vậy điểm khác nhau cơ bản để sản xuất chè giàu GABA so với sản xuất chè đen truyền thống là giai đoạn lên men Quá trình lên men này ngoài lên men tự nhiên còn có bổ sung chủng vi khuẩn Để tạo ra chè giàu GABA cần phải tiến hành lên men trong điều kiện yếm khí Tuy nhiên những chế độ kỹ thuật sản xuất chè đen truyền thống ở những giai đoạn khác như: héo, vò và sấy khô, cũng có thể cần phải nghiên cứu thay đổi cho phù hợp với giai đoạn lên men để tạo ra những tính chất riêng đặc trưng của sản phẩm chè giàu GABA

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

• Máy lắc ổn nhiệt (Metler, Thụy Sĩ)

• Cân điện tử AL – 300 (Osi, Mỹ)

• Nồi hấp khử trùng Hiclave HV – 85 (Hirayama, Nhật)

• Tủ sấy (Carbolite, Anh)

• Tủ cấy (Nuaire, Mỹ)

• Máy li tâm 5417R (Eppendorf, Đức)

• Kính hiển vi quang học Axio (Zeiss, Đức)

• Máy đo quang phổ (Beckman, Mỹ)

• Cùng các thiết bị liên quan khác

Dụng cụ : đĩa Petri, pipette các loại, ống eppendorf, đèn cồn, bình tam giác (100ml,

250ml), ống nghiệm, ống đong định mức, que cấy…

2.3 Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Môi trường MRSS : Glucose-25, Yeast extract – 6,25 , Peptone – 6,25,

MgSO4·7H2O – 0.2, MnSO4·4H2O - 0.05, sodium L-glutamate-10,Tween 80–2ml

Môi trường M1: MRS (Man, Rogosa, Sharpe Broth)(g/l): Peptone-10; Yeast

extract-5; Meat extract-10; Glucose-20; Potassium phosphate-2; Sodium acetate-5;

Magnesium sulphate-0.2; Manganese sulphate-0.05; Tween 80- 1.08; Ammomium citrate-2, pH6.5±0.2

Môi trường M2(g/l): Glucose-20; K2HPO4-2; CH3COONa-5; diamonium hydrogen citrate-2; MgSO4-0,2; MnSO4-0,04; Tween 80-1; yeast extract-50,1

Môi trường M3(g/l): Glucose-25; yeast extract-6,25; peptone-6,25; MgSO4.7H22; MnSO4.4H2O-0,05; tween 80-2

Môi trường M4(g/l): Glucose-40; yeast extract-5; peptone-10; MgSO4.7H2O-0,2;

K2HPO4-2

Môi trường M5 (g/l): Glucose-20; peptone-20; yeast extract-10

Môi trường M6 (g/l): Glucose-20; cao thịt-10; peptone-10; CH3COONa-5; cao men-5; ammonium citrate-2; K2HPO4-2; MgSO4.7H2O-0,1; MnSO4.5H2O-0,05

Môi trường M7 (g/l): Glucose-10; yeast extract-10; peptone-5; CH3COONa-2; MgSO4.7H2O-0,02; MnSO4.4H2O-0,01; FeSO4.7H2O-0,01; NaCl-0.01

Môi trường M8 (g/l): peptone-15; cao thịt-12,5; sucrose-12,5; K2HPO4-1,03;

CH3COONa-5; ammonium dibasic citrate-2; CaCl2-2; tween80-1

Môi trường giữ giống lạnh sâu

Môi trường giữ giống lạnh sâu -80oC bằng dung dịch glycerol 20%

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp phân tích GABA

2.4.1.1 Phương pháp định tính GABA ( Sắc ký bản mỏng - TLC) (Ting Qiu, 2010)

• Hóa chất: γ-Aminobutyric acid (Sigma); n-butanol (China); Axit acetic

(Wako); ninhydrin (Merk); bản TLC (Merk)

• Chuẩn bị bản TLC: Cắt đôi bản TLC sấy 80oC trong 2 giờ (ép phẳng) Kẻ chặn mép trên, mép dưới 1cm Chia đều 10 đến 12 mẫu trên 1 bản TLC cách

mép trái, mép phải 1cm

• Pha dung môi : Pha dung môi n-butanol: acetic acid: nước cất (5:3:2, v/v/v)

chứa 0.4% (w/v) ninhydrin Cần 75ml dung môi thì n-butanol là 37.5ml,

acetic acid là 22.5ml, nước cất là 15ml và 0.3g ninhydrin

• Định tính GABA

- Các chủng lactic sử dụng cho thử nghiệm sinh enzyme glutamic decacboxylase được nuôi cấy trong môi trường MRSStại 37oC trong 48 giờ

- Dịch nuôi cấy sau 48 giờ được đem đi ly tâm 15000rpm/ 15 phút/ 4°C Sau

đó cặn tế bào được ngâm trong nitơ để qua 12h rồi cho qua máy siêu âm 30 phút, trộn với dịch nuôi cấy, ly tâm 3000g/5 phút Thu dịch để định tính

- Chấm 5μl từng mẫu lên bản TLC đã chuẩn bị (chấm thành từng chấm nhỏ đều sau đó dùng máy sấy sấy khô vết chấm rồi lại chấm tiếp đến khi hết 5μl mẫu), chờ khô

- Đặt bản TLC vừa chấm mẫu vào bên trong bể sắc khí chứa dung môi (chú ý đặt bản phải thẳng, các bản không được chạm vào nhau)

- Quan sát đến khi dung môi chạy đến vạch kẻ thì nhấc bản TLC ra để khô tự nhiên rồi cho vào tủ sấy 90ºC trong 5 phút

- Sau khi sấy thì trên bản TLC sẽ hiện rõ các dải màu, mẫu nào có vệt màu cao bằng và có màu giống với vệt màu của đối chứng dương thì có chứa GABA

2.4.1.2 Phương pháp định lượng GABA

a Phương pháp quang phổ (Su Y.C, 2003)

• Hóa chất: GAGA (Sigma); Ethanol (Merck); Axit boric (Merk); Muối natri

borat ; Acetnone (Merck)

• Dựng đường chuẩn GABA

GABA được sấy khô ở 105oC trong 2 giờ Cân 0.2g GABA trong 10ml nước cất- được stock solution 20mg/ml Hút 1ml stock solution vào 9ml nước cất được stock solution 1 có nồng độ 1 có nồng độ 2mg/ml Dùng stock solution 1 để pha loãng thành các dãy nồng độ sau từ 0; 0,2; 0,4;…; 2

3 Đun sôi hỗn hợp trong vòng 20 phút tại 85±5oC

4 Làm lạnh nhanh trong nước đá 5 phút

5 Để hỗn hợp có nhiệt độ bằng nhiệt độ phòng, bổ sung 2ml ethanol 50%

6 Đo hỗn hợp OD 570 nm, dùng Blank là mẫu có nồng độ 0mg/ml

7 Lặp lại thí nghiệm 2 lần để thu được giá trị OD1 và OD2

Từ bảng dưới đây, ta thu được phương trình tuyến tính là Y=1.1817*X-0.0448 với R=0.9925, X là nồng độ GABA(mg/ml), Y là giá trị OD 570 nm

Bảng 2.1.Mật độ quang phổ (OD 570nm) ở các nồng độ GABA

Nồng độ

(mg/ml)

Stock solution 1(µl)

Nước cất (µl)

Hình 2.1 Đường chuẩn GABA bằng phương pháp quang phổ

b Phương pháp HPLC (Li, 2016)

• Hóa chất: Ortho-phthalaldehyde (Merck); Axit boric (Merk); Muối natri borat ; 2-Mercaptoethanol (Merck); Acetonitrile (Merck); Đệm ammonium acetate

• Phương pháp định lượng GABA

1 100μl mẫu được thêm vào 500μl dung dịch đệm borat (0,4M và pH=10,4) và 100μl chất dẫn xuất (chứa 10mg của ortho-phthalaldehyde

và 10μl2-mercaptoethanol trong 2,5ml acetonitrile)

2 Sau đó hỗn hợp được votex trong 30s và được giữ để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

3 20μl mẫu đã được thêm vào cột phân tích đảo ngược pha ZORBAX Eclipse Plus C18 đảo ngược pha (4.60 mm x 250 mm, 5 μm, Agilent) và được dò bằng máy dò DVD (G1315 B) tại bước sóng 334nm

4 Hệ thống dung môi làm sạch gồm pha A (đệm ammonium acetate 0,02M; pH=7,3) và pha B (acetonitrile)

5 Chu trình được cài đặt tại 20% của pha B trong 10 phút, đẩy lên 100% trong 20 phút và sau đó giảm xuống 20% pha B trong 25 phút với tốc độ 0.6ml/phút Nhiệt độ nung cột là 25oC

6 Đường chuẩn được dựng dựa trên 6 nồng độ (100, 200, 300, 400, 500 và

600 mg /ml) của GABA chuẩn

Hình 2.2 Đường chuẩn GABA xây dựng bằng phương pháp HPLC

2.4.2 Phương pháp hoạt hóa chủng giống

Các chủng vi sinh vật lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam (VTCC) được hoạt hóa và tinh sạch trên môi trường nuôi cấy MRS Sau đó, quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào các chủng vi sinh vật

2.4.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp GABA cao

Các chủng Lactobacillus được hoạt hóa trên môi trường MRS thạch sau 48

giờ Sau đó sẽ được cấy chuyển sang ống nghiệm thủy tinh chứa môi trường MRSS

bổ sung 1% glutamate tại 37oC, 48 giờ Dịch nuôi cấy được đem đi ly tâm 15000 rpm/15phút/4oC loại bỏ cặn thu dịch phía trên Dịch thu được định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng-TLC

2.4.4 Phương pháp phân loại

2.4.4.1 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn axit lactic

Quan sát hình thái khuẩn lạc: Các chủng vi khuẩn axit lactic thuần khiết

được cấy ria ba pha trên môi trường thạch MRS trong 72 giờ ở 37oC Tiến hành quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc theo các tiêu chí như: màu sắc, độ bóng, mức

độ trơn nhẵn, trạng thái bề mặt

Hình thái tế bào : Các chủng được tinh sạch cấy ria ba pha trên môi trường đĩa

thạch MRS trong 48 giờ ở 37oC Tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào

Quy trình nhuộm Gram như sau:

Nguyên tắc: Nhuộm Gram (phản ứng Gram) có vai trò đặc biệt trong việc

phân loại vi khuẩn Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với