Nấm cộng sinh hiện diện trên rễ hồ tiêu trồng tại Việt Nam chưa được xác định và nghiên cứu. Nhằm sử dụng nấm cộng sinh như chỉ thị sinh học cho phục hồi vườn hồ tiêu bị “suy thoái” theo hướng hữu cơ và bền vững trước thực trạng biến đổi khí hậu, thâm canh lệch hướng, và giá hồ tiêu thay đổi như hiện nay, vai trò của AMF cần được minh chứng và xác định giúp định hướng cho người trồng hồ tiêu sử dụng AMF như tác nhân sinh học trong hệ canh tác hồ tiêu bền vững.
Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 XÁC ĐỊNH NẤM CỘNG SINH Mycorhiza TRÊN RỄ CÂY HỒ TIÊU Identification of Mycorhiza in Blackpepper Roots 1 Lê Thị Kim Duyên , Trần Trọng Nghĩa , Trần Đỗ Hoàng , Trần Đào Uyên Đa Lê Đình Đơn Ngày nhận bài: 27.2.2019 Ngày chấp nhận: 11.3.2019 Abstract Mycorrhiza was determinated in rhizosphere and root of blackpepper trees by using the stained root samples collected from the fields and the inoculation test with mycorrhiza commercialized Results indicated that four endomycorrhizae were detected such as Glomus, Acaulospora, Gigaspora and Scutellopora, with a frequency of mycorrhizal colonisation into roots from to 31.3% and those spores were variation in sharps and abundance in rhizosphere of blackpepper tree Data suggested that a technology for balancing and adapting of fertilizers imputed in order to reducing the costs and improving the sustainability based on organic model Keywords: Mycorrhiza, Glomus, Acaulospora, Gigaspora and Scutellopora, ĐẶT VẤN ĐỀ * Nấm cộng sinh (AMF) với thực vật tượng phổ biến tự nhiên Nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh vai trò nấm cộng sinh thúc đẩy sinh trưởng phát triển điều kiện bất lợi môi trường, ổn định cấu trúc đặc tính sinh học đất (Nguyễn Thị Giang, 2012) Các nghiên cứu Anandaraj cs (1994) cho thấy AMF giúp tăng chất lượng hồ tiêu giống Panniyur-1 giai đoạn vườn ươm, giúp rễ phát triển hấp thu đầy đủ lân (P) (Thanuja cs, 2002) Nấm cộng sinh diện rễ hồ tiêu trồng Việt Nam chưa xác định nghiên cứu Nhằm sử dụng nấm cộng sinh thị sinh học cho phục hồi vườn hồ tiêu bị “suy thoái” theo hướng hữu bền vững trước thực trạng biến đổi khí hậu, thâm canh lệch hướng, giá hồ tiêu thay đổi nay, vai trò AMF cần minh chứng xác định giúp định hướng cho người trồng hồ tiêu sử dụng AMF tác nhân sinh học hệ canh tác hồ tiêu bền vững PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Cơng ty Cơng ty Cổ phần Tập đồn Lộc Trời Viện Nghiên cứu Cơng nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Phương pháp tách bào tử nhận diện AMF: Tháng 12 năm 2017, 50 mẫu rễ đất thu thập vườn hồ tiêu giống Vĩnh Linh trồng thuần, xen canh chuối, cà phê điều, xã Láng Lớn, Xà Bang Kim Long, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu Bào tử nấm cộng sinh phân lập từ đất theo kỹ thuật sàng ướt (wet sieving) kết hợp với ly tâm dung dịch 50% sucrose (Brundrett cs, 1996) Thu bào tử sàng rây 40 µm đếm số bào tử kính soi Nhận dạng nấm cộng sinh dựa vào hình dạng bào tử theo mô tả Gerdermann (1963), Gerdemann Trappe (1974) Dựa hình thái xâm nhiễm sợi nấm, túi, cấu trúc cộng sinh theo mô tả Brundrett cs (1996) Phương pháp chủng AMF vào rễ hồ tiêu: Hom tiêu giống Vĩnh Linh thu từ vườn tiêu không bổ sung nấm cộng sinh Hom tiêu có đốt ngâm phút Mexyl MZ 0,45% (w/v) giâm vào cát hấp khử trùng Sau tháng lựa chọn hom tương đồng chiều cao chồi số chuyển vào chậu chứa cát khử trùng, chậu hom Khi tháng bổ sung Rhizomyx 2.5G (Nhà cung cấp Novozymes - Mỹ) chứa loài AM Glomus mosseae, Glomus aggregatum, Glomus intraradices, Glomus entunicatum, Glomus deserticola, Glomus clarum, Glomus monosporum, Gigaspora margarita Đối chứng chủng nhiễm sử dụng Cao lương Ngô gieo từ hạt xử lý bề mặt hạt Kết nghiên cứu Khoa học Xác định nấm cộng sinh rễ: Sau chủng 2, 4, 6, tuần, mẫu rễ (dài 1cm) xử lý KOH 10% (w/v) 12 giờ, ngâm HCl 2% (v/v) 10 phút, sau rửa mẫu nước cất Rễ nhuộm với trypan blue 0,02% (w/v) 12 giờ, quan sát kính hiển vi để xác định diện nấm cộng sinh Tổng số đoạn rễ diện AMF Tỷ lệ rễ có cộng sinh = x 100 Tổng số đoạn rễ quan sát) KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Xác định diện nấm cộng sinh AMF đất rễ hồ tiêu Căn vào kiểu xâm nhiễm, hình dạng cấu trúc dạng bụi (arbuscules) túi (vesicles) theo mô tả Brundrett cs (1996), có chi nấm công sinh ghi nhận diện rễ BVTV - Số 2/2019 hồ tiêu gồm Acauslospora, Glomus, Gigaspora Scutellospora Các chi nấm thuộc nhóm nội cộng sinh thiết lập hệ sợi cấu trúc chuyên biệt mơ rễ hồ tiêu giống Vĩnh Linh, chi Acaulospora phổ biến với tỉ lệ 100%, Gigaspora chiếm 80%, Glomus 40% 20% mẫu rễ có Scutellospora Dựa vào đặc điểm hình dạng, màu sắc, cuống bào tử, thành bào tử mô tả bỡi Gerdermann (1963), Gerdemann Trappe (1974), Brundrett cs (1996), phân lập 17 kiểu hình bào tử, chi Glomus có kiểu hình bào tử Acaulospora xuất nhiều với kiểu hình (hình 2) Sự xuất nhiều kiểu hình bào tử cho thấy mơi trường vùng rễ hồ tiêu vườn lấy mẫu phù hợp cho tồn AMF cần thiết xây dựng công thức dinh dưỡng cân giúp AMF thiết lập quan hệ với rễ hồ tiêu Hình Dạng cấu trúc sợi, bụi (arbuscules) túi (vesicles) nấm AMF rễ hồ tiêu A chi Acaulospora; B chi Gigaspora; C chi Glomus; D Scutellospora, hình chụp vật kính 40X Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 2/2019 Hinh Các dạng bào tử AMF ghi nhận đất vùng rễ hồ tiêu Vĩnh Linh (Vật kính 40X) Bảng Mức độ cộng sinh với AMF hồ tiêu có điều kiện canh tác khác Vườn (mẫu) V (10) V (10) V (10) V (10) V (10) Tỉ lệ (%) trung bình Số bào tử 50 g Chi AMF diện Tuổi Cây trồng xen Cây phủ đất rễ có cộng sinh (thấp đất (thấp – cao rễ – cao nhất) nhất) Không Cỏ 21 (10-50) 138 (83 – 209) Acaulospora, Gigaspora Chuối Không cỏ 11 ( – 23) 126 (81 – 164) Acaulospora, Glomus 15 Điều + Cà phê Không cỏ 14 (0 – 36) 132 (49 – 200) Acaulospora, Gigaspora Cà phê Không cỏ (0 – 20) 113 (83 – 148) Acaulospora, Gigaspora 10 Điều + Cà phê Cỏ 31 (0 – 80) 125 (82 – 208) Acaulospora, Gigaspora, Glomus, Scutellospora Tỉ lệ rễ cộng sinh không liên quan với mật số bào tử AMF đất, tuổi hồ tiêu, loại diện vườn hồ tiêu (bảng 1), tỉ lệ rễ có nấm cộng sinh thấp (0%) cho dù bào tử nấm diện đất vùng rễ tiêu, với 49 bào tử/50 gram đất Kết cho thấy, nấm nội cộng sinh, endomycorrhiza, diện vùng rễ hồ tiêu thiết lập hệ cộng sinh có đặc điểm nhóm Abuscular Mycorrhiza với cấu trúc chuyên biệt phân lập quan sát 3.2 Xác định nấm cộng sinh AMF rễ hồ tiêu phương pháp lây nhiễm nhân tạo Trong điều kiện chủng thí nghiệm, sau tuần ghi nhận cấu trúc điển hình AMF mơ rễ hồ tiêu kính hiển vi quang học (vật kính 40X), quan hệ cộng sinh thiết lập sớm nhiên khó phát kỹ thuật nhuộm tế bào Ở đối chứng chủng nhiễm, rễ cao lương ngô sau tuần xác định có cấu trúc cộng sinh rễ Quan sát tiêu mô rễ, ghi nhận sợi nấm nội bào (I) phát triển dọc theo chiều dài đoạn rễ, phân nhánh có dạng chữ “H” phía bắt màu sẫm với trypan blue Trong rễ, xuất túi (V) có màu sẫm hình bầu dục elip nằm tế bào rễ, cấu trúc bụi (A) rễ phân nhánh hình chữ “T”, đặc điểm chi Glomus Kết nghiên cứu Khoa học Như Gigaspora margarita không thiết lập thành công quan hệ cộng sinh với hồ tiêu, chi Gigaspora ghi nhận rễ hồ BVTV - Số 2/2019 tiêu điều kiện thực địa (hình 1) G margarita thiết lập quan hệ cộng sinh rễ ngô cao lương (hình 3) Bảng Tỷ lệ rễ hồ tiêu thiết lập quan hệ cộng sinh với AMF lây nhiễm nhân tạo Công thức Hồ tiêu (không chủng) Ngô (chủng g Rhizomyx 2.5G) Cao lương (chủng g Rhizomyx 2.5G) Hồ tiêu (chủng g Rhizomyx 2.5G) Hồ tiêu (chủng g Rhizomyx 2.5G) Hồ tiêu (chủng g Rhizomyx 2.5G) tuần 5,3 2,0 0 Tỷ lệ cộng sinh (%) tuần tuần 0 64,0 18,0 0 0 0 Hình Nấm cộng sinh rễ hồ tiêu chủng nhiễm Cao lương Ngô C, cấu trúc điển hình AMF; D, E, cấu trúc sợi túi mô rễ Ngô; F, H, cấu trúc búi sợi nấm mô rễ Cao lương Vật kính 40X tuần 35,3 34,0 64,0 Kết nghiên cứu Khoa học Nhiều nghiên cứu xác định nấm AMF có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng phát triển hồ tiêu, rõ giai đoạn vườn ươm (Thanuja cs, 2002) Mala ctv (2010) xác định Glomus mosseae làm tăng phát triển hệ rễ tiêu, đặc biệt điều kiện dinh dưỡng thấp Wimalarathne ctv (2014) cho bón nấm AMF (Funneliformis mosseae) phương pháp hữu ích để tăng cường phát triển hom tiêu Kandiannan ctv (2000) nhận thấy kết hợp - loại phân bón sinh học có nấm mycorrhiza làm tăng chiều cao, diện tích lá, sinh khối vây hồ tiêu vườn ươm AMF chứng minh kiểm soát Phytophthora capsici đất, làm giảm tỉ lệ chết hồ tiêu sau tuần (Norma cs, 2017) Đặc biệt, nấm AMF cộng sinh rễ kích thich sinh tổng hợp chất thứ cấp, tinh dầu, kháng oxi hóa phần (Shirlley cs, 2016) Kết xác định hồ tiêu nấm AMF thiết lập quan hệ cộng sinh thực tế đồng ruộng chủng nhân tạo, sở cho sử dụng AMF tác nhân sinh học bảo vệ hồ tiêu, chuyển hóa dinh dưỡng, cải thiện sức khỏe cây, thị sinh học cho sức khỏe đất vùng rễ hồ tiêu KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Kết nghiên cứu xác nhận hồ tiêu thiết lập quan hệ cộng sinh với chi nấm thuộc nhóm nội cộng sinh gồm Glomus, Acaulospora, Gigaspora Scutellopora, với tỉ lệ rễ cộng sinh từ đến 31,3% bào tử nấm đa dạng kiểu hình diện phổ biến đất vùng rễ hồ tiêu Glomus cần tuần để thiết lập quan hệ cộng sinh với hồ tiêu, với tỉ lệ rễ có nấm cộng sinh liên quan đến nguồn chủng ban đầu Đề nghị Sử dụng chế phẩm chứa nấm rễ cộng sinh AMF vào giai đoạn giâm hom hồ tiêu giống bón vào thời điểm trồng giúp thiết lập hệ cộng sinh cho hồ tiêu Cần nghiên cứu bón phân hữu cân đối lượng phân vơ cơ, đặc biệt đạm lân nhằm trì gia tăng tỉ lệ rễ cộng sinh giúp gia tăng sức chống chịu trì sức khỏe đất BVTV - Số 2/2019 Lời cảm ơn Các tác giả cảm ơn Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Bình Thuận hỗ trợ nguồn kinh phí, Cơng ty Harris Freeman Việt Nam Công ty Cổ phần Tập đoàn Lộc Trời tạo điều kiện cho thực phần nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Brundrett, M.C., Bougher, N., Dell, B., Grove, T., and Malajczuk, N., 1996 Working with Mycorrhizas in Forestry and Agriculture Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia Gerdemann, J.W., 1963 Spores of mycorrhizal endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting Trans Brit mycol Soc 46:235 - 244 Gerdemann, J.W and Trappe, J.M., 1974 The Endogonaceae in the Pacific Northwest Mycologia Memoir 5: - 76 Kandiannan, K., Sivaraman, K., Anandaraj, M and Krishnamurthy, K.S., 2000 Growth and nutrient content of black pepper (Piper nigrum L.) cuttings as influenced by inoculation with biofertilizers Journal of Spices and Aromatic Crops 9:145-147 Nguyễn Thị Giang, 2012 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường giá thể mô rễ đến khả nhân sinh khối cộng sinh nấm rễ Arbuscular mycorrhiza in vitro Luận văn Thạc sĩ Sinh học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Norma Fauziyah, Bambang Hadisutrisno, and S Suryanti, 2017 The roles of arbuscular mycorrhizal fungi in the intensity of the foot rot disease on pepper plant from the infected soil Journal of Degraded and Mining Lands Management 4: 937 – 943 Shirlley F M da Luz, Laiany de A Reis, Oriel F de Lemos, José Guilherme S Maia, Andréa H de Mello, Alessandra R Ramos, and Joyce Kelly R da Silva, 2016 Effect of arbuscular mycorrhizal fungi on the essential oil composition and antioxidant activity of black pepper (Piper nigrum L.) International Journal of Applied Research in Natural Products 9:10-17 Thanuja T.V., Ramakrishna V Hegde, and M.N Sreenivasa, 2002 Induction of rooting and root growth in black pepper cuttings (Piper nigrum L.) with the inoculation of arbuscular mycorrhizae Scientia Horticulturae 92: 339-346 Phản biện: TS Ngô Vĩnh Viễn ... hiển vi để xác định diện nấm cộng sinh Tổng số đoạn rễ diện AMF Tỷ lệ rễ có cộng sinh = x 100 Tổng số đoạn rễ quan sát) KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Xác định diện nấm cộng sinh AMF đất rễ hồ tiêu Căn... đất vùng rễ hồ tiêu Glomus cần tuần để thiết lập quan hệ cộng sinh với hồ tiêu, với tỉ lệ rễ có nấm cộng sinh liên quan đến nguồn chủng ban đầu Đề nghị Sử dụng chế phẩm chứa nấm rễ cộng sinh AMF... Scutellospora Tỉ lệ rễ cộng sinh không liên quan với mật số bào tử AMF đất, tuổi hồ tiêu, loại diện vườn hồ tiêu (bảng 1), tỉ lệ rễ có nấm cộng sinh thấp (0%) cho dù bào tử nấm diện đất vùng rễ tiêu, với