Hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne spp. của vi khuẩn Bacillus velezensis EK7 ở vùng rễ cây hồ tiêu

Nghiên cứu cơ chế kháng tuyến trùng của chủng EK7 được thực hiện bằng đánh giá ảnh hưởng của enzyme đến tỷ lệ tử vong tuyến trùng. Kết quả cho thấy, chitinase thu nhận từ chủng EK7 có thể tác động lên tỷ lệ tử vong của tuyến trùng tại thời điểm 24h và tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng vào các thời điểm khảo sát 24h, 48h, 72h. Enzyme protease chỉ tác động tỷ lệ nở của trứng tuyến trùng vào thời điểm 72h.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HTKH 2019 HOẠT TÍNH KHÁNG TUYẾN TRÙNG Meloidogyne spp CỦA VI KHUẨN Bacillus velezensis EK7 Ở VÙNG RỄ CÂY HỒ TIÊU TRỊNH THỊ HUYỀN TRANG1,*, LÊ KHÁNH LINH NGUYỄN ANH DŨNG2,**, LÊ THỊ ÁNH HỒNG3,*** Khoa KHTN&CN, Trường Đại học Tây Nguyên Viện CNSH&MT, Trường Đại học Tây Nguyên Viện Sinh học nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh * Email: tthtrang@ttn.edu.vn ** Email: nazdungtaynguyenuni@gmail.com *** Email: anhhongbi@yahoo.com Tóm tắt: Tuyến trùng nốt rễ Meloidogyne spp nhóm đối tượng gây hại phổ biến hồ tiêu (Piper nigrum) Nghiên cứu tiến hành nhằm tuyển chọn, định danh đánh giá hoạt tính kháng tuyến trùng chủng vi khuẩn vùng rễ ứng dụng phòng trừ tuyến trùng gây bệnh hồ tiêu Kết nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn EK7 có khả kháng tuyến trùng cao điều kiện in vitro với tỷ lệ tử vong 99% Chủng định danh giải trình tự gen 16S rRNA với tên khoa học Bacillus velezensis EK7 Nghiên cứu chế kháng tuyến trùng chủng EK7 thực đánh giá ảnh hưởng enzyme đến tỷ lệ tử vong tuyến trùng Kết cho thấy, chitinase thu nhận từ chủng EK7 tác động lên tỷ lệ tử vong tuyến trùng thời điểm 24h tỷ lệ nở trứng tuyến trùng vào thời điểm khảo sát 24h, 48h, 72h Enzyme protease tác động tỷ lệ nở trứng tuyến trùng vào thời điểm 72h Từ khóa: Tuyến trùng, vi khuẩn vùng rễ, protease, chitinase, Bacillus velezensis MỞ ĐẦU Hồ tiêu (Piper nigrum L.) cơng nghiệp có giá trị kinh tế xuất cao Việt Nam Hiện nay, diện tích hồ tiêu tiếp tục tăng, tính đến tháng 12/2018, nước trồng 150.000 (Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn) Ở nước ta, vùng trồng tiêu lớn tập trung tỉnh Đơng Nam Bộ (Bình Phước, Bà Rịa - Vũng Tàu Đồng Nai), Tây Nguyên (Đắk Nông, Đắk Lắk Gia Lai) Tuy nhiên, lợi nhuận kinh tế cao từ tiêu đem lại nên gây tình trạng phát triển hồ tiêu ạt không theo quy hoạch Cả nước đối mặt với nhiều thách thức phát triển thiếu bền vững, diện tích hồ tiêu phát triển nhanh, vườn đầu tư thâm canh cao độ, nhiều vườn tiêu bị hủy diệt phá hại sâu bệnh… gây thiệt hại lớn cho bà nơng dân (Hồng Thanh Tiệm cộng sự, 2007) Trong đó, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp nhóm đối tượng gây hại phổ biến hồ tiêu gọi tác nhân gây bệnh vàng lá, chết chậm (Trần Thị Thu Hà cộng sự, 2011) Theo Cục Bảo vệ Thực vật, tháng 4/2019 nước tổng diện tích hồ tiêu bị nhiễm bệnh chết chậm 6,759 (tăng 87 so với kỳ trước, tăng 1,675 so với kỳ năm trước), nhiễm nặng 1.815 Các biện pháp kiểm soát tuyến trùng chủ yếu bao gồm biện pháp hóa học, sinh học, vật lý sử dụng giống trồng kháng bệnh Việc sử dụng thuốc hóa học tiêu diệt tuyến trùng thường gây nhiễm mơi trường tồn dư độc tính Vì vậy, biện pháp sinh học xem giải pháp tối ưu với tác nhân phịng trừ có vi khuẩn (Cetintas cộng sự, 2018) Vi khuẩn vùng rễ sử dụng làm tác nhân kiểm sốt sinh học chúng nhóm vi khuẩn sống vùng rễ dạng vi sinh vật đất có vai trị quan trọng việc đối kháng vi sinh vật gây bệnh hại ký chủ kích thích sinh trưởng trồng (Kloepper cộng sự, 1992) 368 HỘI THẢO KHOA HỌC QUỐC GIA CÁC NHÀ NGHIÊN CỨU TRẺ | 11/2019 Trên giới ghi nhận nhiều chủng vi khuẩn vùng rễ thuộc chi Bacillus Pseudomonas có khả kích thích sinh trưởng, kiểm sốt bệnh tuyến trùng gây Pseudomonas putida Pseudomonas alcaligenes tác động lên tuyến trùng Meloidogyne javanica kích thích sinh trưởng đậu (Siddiqui cộng sự, 2009), Bacillus cereus Bacillus pumilus tác động lên tuyến trùng Meloidogyne incognita (Gao cộng sự, 2016; Cetintas cộng sự, 2018) kích thích sinh trưởng cà chua, chủng Bacillus amyloliquefaciens, B mojavensis, B safensis B subtilis tác động lên tuyến trùng Meloidogyne incognita gây hại (Xiang cộng sự, 2014) Mục tiêu nghiên cứu nhằm tuyển chọn, định danh đánh giá hoạt tính kháng tuyến trùng chủng vi khuẩn vùng rễ ứng dụng phòng trừ tuyến trùng gây bệnh hồ tiêu địa bàn tỉnh Đắk Lắk NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn chủng vi khuẩn vùng rễ có khả kháng tuyến trùng Meloidogyne spp điều kiện in vitro Định danh chủng vi khuẩn vùng rễ có hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne spp cao điều kiện in vitro phương pháp sinh học phân tử Ảnh hưởng enzyme protease chintinase đến tỷ lệ tử vong tuyến trùng tỷ lệ nở trứng tuyến trùng Meloidogyne spp theo thời gian 2.2 Đối tượng vật liệu nghiên cứu Các chủng vi khuẩn vùng rễ hồ tiêu phân lập tỉnh Đắk Lắk lưu trữ Phịng Thí nghiệm Vi sinh, Bộ môn Sinh học, Trường Đại học Tây Nguyên Tuyến trùng trứng Meloidogyne spp gây u sung rễ Hồ tiêu Hóa chất sử dụng bao gồm: Thuốc thử DNS, dung dịch huyền phù chitin 1%, dung dịch N-acetylglucosamin, đệm tris HCl 0.05M pH 8, dung dịch casein 1%, dung dịch TCA 5%, dung dịch NaOH 0,5N; HCl 0,2N, thuốc thử Folin, dung dịch Tyrosin Một số môi trường dinh dưỡng sử dụng nghiên cứu: LB, LB-chitin 1%, LB-casein 1% 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn vùng rễ có khả kháng tuyến trùng Meloidogyne spp điều kiện in vitro Thu nhận tuyến trùng từ trứng: Thu nhận rễ tiêu bị u sưng (khi thu nhận sử dụng kéo cắt sát, không để vết thương hở tiếp xúc với đất), đựng túi nilon Rửa rễ thu nhận, dùng dao lam dao rọc giấy, cắt phần vỏ, lấy bọc trứng chuyển vào đĩa petri, bổ sung nước cất vô trùng, đậy nắp đĩa petri, để tối, ủ nhiệt độ phòng từ 24 - 48h Đếm xác định mật độ tuyến trùng Xác định hoạt tính kháng tuyến trùng vi khuẩn vùng rễ điều kiện in vitro thực theo hai bước: Bước 1: Sàng lọc sơ hoạt tính kháng tuyến trùng chủng vi sinh vật vùng rễ hồ tiêu nhằm thu hẹp tổng số chủng vi khuẩn phải tập trung nghiên cứu, sử dụng phương pháp Aravind cải tiến Cách tiến hành: nhân nuôi vi khuẩn vùng rễ môi trường LB lỏng, lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ thường 12 Hút 0,4ml huyền phù vi khuẩn pha loãng đạt OD 610nm khoảng 0,2 -0,3, ly tâm lạnh 8.000 vòng/phút 10 phút, thu cặn Bổ 369 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HTKH 2019 sung vào giếng chứa 0,1ml nước cất vô trùng chứa khoảng 30 tuyến trùng Giếng ủ nhiệt độ thường 24 Đối chứng nước cất Đếm số tuyến trùng chết giếng kính hiển vi soi Tuyến trùng cho chết kiểm tra thấy thể chúng nằm bất động, duỗi thẳng, nội tạng bị phá hủy Bước 2: Tuyển chọn chủng vi khuẩn vùng rễ hồ tiêu có hoạt tính kháng tuyến trùng thực theo phương pháp Aravind (2010) Chen (2000) Các bước tiến hành: Xây dựng đường chuẩn vi khuẩn vùng rễ thể hoạt tính kháng tuyến trùng bước Sau đó, nhân ni vi khuẩn mơi trường LB lỏng, lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ thường 24 Hút 0,4 ml huyền phù vi khuẩn vùng rễ, mật độ 107 CFU/ml cho vào giếng, ly tâm lạnh 8.000 vòng/phút 10 phút, bỏ dịch, thu cặn Bổ sung 0,1ml nước cất vô trùng chứa khoảng 30 tuyến trùng Giếng ủ nhiệt độ phòng 24h Đếm số tuyến trùng chết giếng Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng tuyến trùng chết lô thí nghiệm so với lơ đối chứng Tỷ lệ tuyến trùng chết tính theo cơng thức: Tỷ lệ tử vong % = Số tuyến trùng chết × 100% Tổng số tuyến trùng Đánh giá hoạt tính kháng tuyến trùng vi khuẩn sau: - Hoạt tính cao (+++): Tỷ lệ tuyến trùng bị chết 80% - Hoạt trung bình (++): Tỷ lệ tuyến trùng bị chết từ 60 – 80% - Hoạt tính yếu (+): Tỷ lệ tuyến trùng bị chết 60% - Khơng có hoạt tính (-): Tỷ lệ tuyến trùng chết 0% 2.3.2 Định danh sinh học phân tử chủng vi khuẩn vùng rễ hồ tiêu có hoạt tính kháng tuyến trùng cao Chủng vi khuẩn có hoạt tính cao gửi định danh Công ty Cổ phần Công nghệ TBR (553 Hương Lộ 2, phường Bình Trị Đơng, quận Bình Tân, TP Hồ Chí Minh) thơng qua giải trình tự gen 16S rRNA với cặp mồi 27F 1492R Cây phát sinh loài xây dựng phần mềm MEGA version 6.0 2.3.3 Phương pháp xác định ảnh hưởng enzyme protease chitinase đến tỷ lệ tử vong tuyến trùng theo thời gian Thu nhận enzyme chitinase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn bổ sung chitin 1%: Nuôi cấy vi khuẩn mơi trường thích hợp có bổ sung chitin 1% khơng có agar 300C, tốc độ lắc 150 vịng/phút, ni cấy ngày, sau ly tâm dịch ni cấy (8.000 vịng/10 phút) 4oC để loại bỏ vi khuẩn, thu dịch Một phần dịch sử dụng để xác định hoạt tính enzyme chitinase phương pháp định lượng đường khử dựa sản phẩm thủy phân chitin chitinase N - acetyl - glucosamine Thu enzyme protase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn bổ sung casein 1%: Nuôi cấy vi khuẩn mơi trường thích hợp có bổ sung casein 1% khơng có agar 300C, tốc độ lắc 150 vịng/phút, ni cấy ngày, sau ly tâm dịch ni cấy (8.000 vịng/10 phút) 4oC để loại bỏ vi khuẩn, thu dịch Xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Anson cải biên dựa sản phẩm thủy phân casein protease tyrosin 370 HỘI THẢO KHOA HỌC QUỐC GIA CÁC NHÀ NGHIÊN CỨU TRẺ | 11/2019 Thu dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng: Vi khuẩn nuôi môi trường LB lỏng, chuyển 1ml dịch vi khuẩn với nồng độ đạt 108cfu/ml vào môi trường LB bổ sung tuyến trùng làm chất, lắc 150 vòng/phút nhiệt độ phòng Sau ngày ly tâm 8.000 vòng/10 phút 4oC, thu dịch Một phần dịch sử dụng để xác định hoạt tính enzyme chitinase protease Xác định ảnh hưởng dịch ni cấy vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, enzyme protease chintinase đến tỷ lệ chết tuyến trùng theo thời gian tiến hành theo phương pháp Gao (2016) cải tiến: Hút 200μl dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, chitin, casein sau thu nhận vào ống eppendorf 1,5ml chứa 100μl nước cất vô trùng có khoảng 30 tuyến trùng, bổ sung 100 μg/ml steptomycine, 100 μg/ml chloramphenicol, lắc Ủ 20oC, theo dõi số tuyến trùng chết ống eppendorf thời điểm 12h , 24h, 48h Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Thí nghiệm tiến hành tương tự với dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, chitin, casein bất hoạt nhiệt độ Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Đối chứng môi trường: 200μl môi trường nuôi vi khuẩn+0,1ml nước cất vô trùng chứa khoảng 30 tuyến trùng + 100 μg/ml steptomycine+ 100 μg/ml chloramphenicol, lặp lại lần Đối chứng nước: 0,1ml nước cất vô trùng chứa 30 tuyến trùng + 200μl nước cất vô trùng, lặp lại lần 2.3.4 Phương pháp xác định ảnh hưởng enzyme protease chitinase đến tỷ lệ nở trứng tuyến trùng theo thời gian Hút 200 μl dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, chitin, casein sau thu nhận vào ống eppendorf 1.5ml chứa 100μl nước cất vơ trùng có khoảng 30 trứng tuyến trùng (trứng thu nhận cách bóc trực tiếp từ rễ tiêu bị u sưng), bổ sung 100μg/ml steptomycine, 100μg/ml chloramphenicol, lắc Ủ 20oC, theo dõi số tuyến trùng chết ống eppendorf thời điểm 12h, 24h, 48h 72h Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Thí nghiệm tiến hành tương tự với dịch vi khuẩn có bổ sung tuyến trùng, chitin, casein bất hoạt nhiệt độ Đối chứng môi trường: 200𝜇l môi trường nuôi vi khuẩn+0,1ml nước cất vô trùng chứa khoảng 30 trứng tuyến trùng + 100𝜇g/ml steptomycine+ 100𝜇g/ml chloramphenicol, lặp lại lần Đối chứng nước: 0,1ml nước cất vô trùng chứa 30 tuyến trùng + 200𝜇l nước cất vô trùng, lặp lại lần 2.4 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu xử lý thống kê chương trình SAS (Statistical Analysis Systems) phiên 9.1 dùng cho Windows Sự khác biệt có ý nghĩa mức 0,01 giá trị biểu mẫu tự khác KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn vùng rễ có khả kháng tuyến trùng Meloidogyne spp điều kiện in vitro Từ 44 chủng vi khuẩn vùng rễ phân lập tỉnh Đắk Lắk, sau sàng lọc sơ chủng vi khuẩn vùng rễ có khả kháng tuyến trùng bước mục 2.3.1 thu nhận 21 chủng Các chủng tiếp tục tuyển chọn bước mục 2.3.1 kết ghi nhận bảng Khả đối kháng tuyến trùng chủng với tỷ lệ tử vong cao so với đối chứng, chủng vi khuẩn vùng rễ có hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne spp với tỷ lệ tuyến trùng chết >95% bao gồm EK2, EK7, BH3, BH11, KN3 Trong đó, chủng EK7 có tỷ lệ tử vong tuyến trùng cao 99% lựa chọn cho nghiên cứu Mekete cs (2009) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng dịch lọc từ vi khuẩn vùng rễ cà phê kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita Kết nghi nhận 43 chủng vi khuẩn thử nghiệm có 14 chủng có khả ức chế tuyến trùng M incognita J2 từ 38-98% sau ngày Khả 371 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HTKH 2019 ức chế tuyến trùng M incognita J2 cao B megaterium, A radiobacter C davisae đạt 98,3%, 97,3% 94,6% Như vậy, chủng vi khuẩn vùng rễ hồ tiêu tuyển chọn EK7 có hoạt tính kháng tuyến trùng nghiên cứu tương đương với kết nhóm tác giả Bảng Khả kháng tuyến trùng chủng vi khuẩn vùng rễ hồ tiêu phân lập Đắk Lắk Tỷ lệ tử vong (%)* 73,0gh Hoạt tính kháng ** 98,0ab 90,7abcde +++ +++ 99,0a 88,3abcde 78,7defgh 96,0abc 74,7fgh 87,0abcdef +++ +++ ++ +++ ++ +++ 77,3abcdefg 83,7cdefg ++ +++ 78,7defgh 85,0bcdefg ++ +++ 68,3h ++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ +++ - STT Chủng EK1 EK2 EK4 10 11 12 13 EK7 EK10 EK12 KN3 KN5 KN6 KN7 KN8 KN10 KN11 14 15 16 17 18 19 KN12 BH3 BH6 BH7 BH8 BH11 96,7abc 91,3abcd 86,0abcdef 78,3defgh 95,7abc 20 21 BH13 BH14 79,0defgh 80,3defgh 22 ĐC LSD0,01 13,3i 15,38 CV% 8,37 ++ - Ghi chú: * Các chữ a, b, c, d, e, f, g, h cột khác biệt có ý nghĩa thống kê với trắc nghiệm Duncan với P