MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM IN VITRO TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

Chuyên đề được thực hiện với sự tìm hiểu chi tiết, kỳ công, có cơ sở khoa học chắc chắn từ các nghiên cứu trong nước và ngoài nước mô tả về các mô hình thực nghiệm invitro trong việc đánh giá tác dụng của thuốcdược liệu có hay không tác dụng hạ đường huyết để ứng dụng trong điều trị Đái tháo đường.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ ĐƠNG MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM IN VITRO TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ HÀ NỘI, NĂM 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ ĐÔNG MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM IN VITRO TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC Mã số: 62 72 04 08 HÀ NỘI, NĂM 2016 MỤC LỤC TRANG DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2-DE F1,6BPase Two2-dimensional electrophoresis Enzyme Fructose-1,6-biphosphatase 2DnanoLC Sắc ký lỏng nano đa chiều AMPK Adenosine monophosphat activated protein kinase AMPv-PKA Adenosine monophosphat – protein kinase A CTLA-4 Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 DM Dung môi DMEM DMSO Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Môi trường nuôi cấy tế bào ) Dimethyl sulfoxide 10 DPP4 Dipeptidyl-peptidase-4) 11 ĐTĐ Đái tháo đường 12 EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid 13 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay 14 ESI-MS/MS ElectroSpray Ionization 15 FFA Free fatty acid (acid béo tự do) 16 GHSR Ghrelin receptor 17 GK Glucokinase 18 GLP Glucagon like peptide 19 GLP1 Glucagon-like peptide-1 20 GLUT Glucose transporter (yếu tố vận chuyển glucose) 21 GP Glycogen phosphorylase 22 GSK3 Glycogen synthase kinase-3 23 HbA1c Hemoglobin A1C 24 HPLC High-performance liquid chromatography 25 IR Insulin receptor 26 IRS Insulin receptor substrate 27 LHA 28 MALDI-TOF Human leucocyte antigen (kháng nguyên bạch cầu người) Matrix-assisted laser desorption ionization 29 MS Mass spectrometry (phổ khối) 30 PCR Polymerase Chain Reaction 31 PEPCK Phosphoenol pyruvate carboxykinase 32 PFK-1 Phosphofructokinase-1 33 pHPS Para hydroxybenzen sulfonic acid 34 PPAR Peroxisome proliferator activator receptor 35 PTP1B Protein tyrosine phosphatase 1B 36 RT-PCR Realtime polymerase chain reaction 37 SDS-PAGE 38 SGLT1 Sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis Sodium-glucose linked transporter 39 STZ Streptozocin 40 TNF Tumor necrosis factor 41 UCP2 Uncoupling protein TT DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 tiêu hóa hấp thu glucid Hình 1.2 Mơ hình nghiên cứu hấp thu glucose in vitro ruột non Hình 1.3 Các enzym tham gia tiêu hóa hấp thu glucid Hình 1.4 Sự tiết insulin từ tế bào be ta Hình 1.5 Sự tiết insulin thơng qua việc tăng nồng độ calci nội bào Hình 1.6 Sự giò rỉ điện tử thơng qua UCP2 Hình 1.8.Vai trò enzym gan việc điều hòa glucose máu Hình 1.7 Vai trò tế bào mơ mỡ chuyển hoá glucose TRANG 10 12 16 21 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ, bệnh đái tháo đường một tập hợp những rối loạn chuyển hóa mạn tính đặc trưng bởi tăng glucose máu suy giảm sản xuất insulin và/ hoặc không đáp ứng với insulin mô Sự tăng glucose máu mạn tính bệnh đái tháo đường có liên quan mật thiết với những tổn thương lâu dài, rối loạn suy giảm chức của nhiều quan khác nhau, đặc biệt mắt, thận, thần kinh, tim mạch máu Ở Việt Nam, năm 2015, số người độ tuổi từ 20 đến 79 mắc ĐTĐ vào khoảng 3.509.100, chiếm 6,0 % dân số độ tuổi {IDF, 2015 #2339} Đặc biệt ti lệ mắc ĐTĐ ở nhóm đối tượng có yếu tố nguy cơ, tuổi từ 30 đến 64 chiếm ti lệ cao {Iliya I A., 2016 #2476} Ngày nay, với công cuộc phát triển kinh tế việc chăm sóc sức khỏe ban đầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng trở nên cấp thiết đối với quốc gia giới Do vậy, nhu cầu sử dụng thuốc để phòng ngừa điều trị bệnh tật ngày tăng cao {Iliya I A., 2016 #2476} Hướng nghiên cứu của nhà khoa học giới hiện mong muốn tìm những loại thuốc điều trị đái tháo đường tác dụng đích Để nghiên cứu tác dụng chế tác dụng hạ glucose máu của thuốc pha tiền lâm sàng hiện có nhiều mơ hình nghiên cứu Các mơ hình nghiên cứu chia thành hai loại: Nghiên cứu invivo nghiên cứu in vitro Các mơ hình in vivo có những hạn chế nhiều thời gian, thường cần dùng nhiều động vật cần lượng mẫu thử lớn Các mô hình nghiên cứu ex vitro, in vitro có thể khắc phục hạn chế này, đặc biệt mơ hình đánh giá ảnh hưởng cụ thể của thuốc ở mức tế bào, phân tử giúp tìm hiểu sâu chế tác dụng của thuốc Các mơ hình nghiên cứu in vitro hữu ích nghiên cứu sàng lọc ban đầu cần sàng lọc một số lượng lớn mẫu Xuất phát từ lý chúng tơi thực hiện tìm hiểu chun đề: “Các mơ hình thực nghiệm in vitro nghiên cứu thuốc điều trị đái tháo đường” với mục tiêu: Tìm hiểu mơ hình thực nghiệm in vitro thường sử dụng nghiên cứu thuốc điều trị đái tháo đường Tìm hiểu phương pháp đánh giá kết mơ hình thực nghiệm in vitro MƠ HÌNH LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TIÊU HĨA VÀ HẤP THU GLUCID 1.1 Sự tiêu hóa hấp thu glucid Tế bào Hình 1.1 Sự tiêu hóa hấp thu glucid Sự tiêu hố tinh bợt được bắt đầu từ tác động của α-amylase nước bọt, chủ yếu tiêu hóa được tiến hành ở đoạn của ṛt non (hình 1.1) Ở vùng ruột non bản niêm mạc ruột hồn thành việc hấp thu chủ đợng đối với monosaccharid, đó một loại chất truyền tải của tế bào biểu bì niêm mạc ṛt chọn lọc glucose galactose để chuyển đến tế bào, đưa vào máu Sau đó glucose được đưa đến tế bào nhờ tác đợng của insulin Trong tình trạng thể bình thường, ngồi việc làm nguồn lượng để sử dụng, hầu hết glucose được tổng hợp thành glycogen chuyển thành lipid dự trữ mô mỡ Ở bệnh nhân đái tháo đường (thiếu hụt insulin hoặc đề kháng insulin) nên việc vận chuyển glucose từ máu vào tế bào bị hạn chế Khi đưa một lượng carbohydrat lớn vào thể, nồng đợ glucose máu tăng cao, khó kiểm sốt Vì việc ức chế tiêu hóa glucid hấp thu glucose ruột non góp phần giảm nồng độ glucose máu, đặc biệt sau ăn {Thirpathy K P S, 2014 #642} Trong nghiên cứu thuốc điều trị đái tháo đường hiện việc thử nghiệm tác dụng ức chế glucose máu sau bữa ăn được đặc biệt quan tâm bởi kiểm soát glucose máu sau ăn mục tiêu thiết yếu quản lý bệnh đái tháo đường {WHO, 2016 #533} Các mơ hình thực nghiệm in vitro bước đầu đánh giá tác dụng ức chế hấp thu glucose ruột non được nhiều tác giả thực hiện {Thirpathy K P S, 2014 #642}, {Brenelli S.L, 1997 #641}, {Chanida P, 2009 #657} Các tác giả thường sử dụng hai mơ hình in vitro mơ tương tự việc hấp thu glucose niêm mạc ruột non hoặc ức chế enzyme tham gia tiêu hóa hấp thu glucid {Trương Thị Tố Chinh, 2016 #668}, {Mutiu Idowu K & Anofi Omotayo Tom A, 2016 #2367}, {Rizna Triana D, 2015 #667} 1.2 Mơ hình ức chế hấp thu glucose ruột non 1.2.1 Ức chế hấp thu glucose ruột non thay đổi độ nhớt dịch ruột Mơ hình đánh giá hấp thu glucose in vitro ṛt non được mơ theo hình 1.2 Hình 1.2 Mơ hình nghiên cứu hấp thu glucose in vitro ruột non Trước hết chuẩn bị dung dịch có đặc điểm tương tự ruột non (pH, độ nhớt ), sau đó cho dung dịch glucose 20% với chế phẩm thử/thuốc Tiếp theo cho vào một dụng cụ (thường ống thẩm tách có cấu tạo màng giống màng tế bào niêm mạc ruột non Lắp kín đầu ống cố định nắp ống sau đó nhúng tồn bợ ống vào mợt bình đựng dung dịch NaCl 0,9%.ở nhiệt đợ 370C đặt máy lắc có độ rung động tương tự những co thắt xảy ruột non Nồng độ glucose hấp thu thời điểm 30,45, 60,90,120 phút cách xác định độ dung dịch glucose bên ống thẩm tách {Thirpathy K P S, 2014 #642} Ưu điểm của mơ hình thực hiện nhanh chóng, kỹ thuật đơn giản dễ thực hiện Nhưng nhược điểm ống thẩm tách đắt tiền, việc tạo môi trường chi gần giống ruột non Sự hấp thu glucose ṛt non bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố sinh lý khác enzym, hormone, thần kinh… Brenelli (1997) với mục đích đánh giá hấp thu của glucose in vitro của ba chất có độ nhớt khác guar gum (G), pectin (P) carboxymethylcellulose (CMC) Kết quả của nghiên cứu chi thay đổi độ nhớt ống nghiệm có ảnh hưởng đến hấp thu glucose từ đó tác giả có kết luận việc trì đợ nhớt cao ruột non làm giảm hấp thu glucose máu sau ăn {Brenelli S.L, 1997 #641} Nghiên cứu khả ức chế hấp thu glucose in vitro mơ hình giống hấp thu ṛt non của loại dược liệu có độ nhớt khác là: Phần mặt đất của mồng tơi (Basella alba Linn), quả của đậu bắp (Hibiscus esculentus L), của nhớt mèo (Litsea glutinosa Lour), hạt sen (Ocimum canum Sims), hạt mã đề (Plantago ovata Forssk), Quả bế thin (Scaphium scaphigerum), Hạt của Hồ lô bá (Trigonella foenum-graecum) Bằng mơ hình thực nghiệm in vitro được mơ tả ở Chanida cộng (2009) chứng minh được phần mặt đất của mùng tơi có tác dụng ức chế hấp thu glucose in vitro tốt so với dược liệu lại {Chanida P, 2009 #657} Trong nghiên cứu của Thirpathy (2014) tiến hành đánh ức chế hấp thu glucose ruột non của phân đoạn dịch chiết Nhàu Tác giả sử dụng ống thẩm tách (6cm*15mm) cho vào đó dịch chiết phân đoạn nhàu, CMC, natri clorua 0.22 Mol D-glucose) Ống thẩm tách được đặt một ống ly tâm có chứa 45ml NaCl 0,9% được đặt máy lắc Kết quả dịch chiết phân đoạn methanol của nhàu có tác dụng ức chế hấp thu glucose in vitro tốt {Thirpathy K P S, 2014 #642} Một nghiên cứu mới của Barnabé cộng (2016) sử dụng mơ để đánh giá hấp thu glucose ở ruột của vỏ thuộc chi Hoa sữa (Alstonia boonei De Wild) Kết quả cho thấy dịch chiết nước của vỏ Hoa sữa ở nồng độ 5mg/ml ức chế hấp thu glucose in vtro ruột non {Barnabé L, 2016 #656} 1.2.2 Ức chế hấp thu glucose đoạn ruột non cô lập Nghiên cứu Ex-vivo đoạn ruột non cô lập được tiến hành sau: Động vật được cho nhịn ăn qua đêm (12 giờ) Sau đó gây mê với halothan, bộc lộ đường tiêu hóa, lộ nhung mao sau đó ủ đoạn ruột bị cô lập với đệm Kreb (NaCl, KCl, CaCl KH2PO4, MgSO4 NaHCO3) có chứa dung dịch glucose 200mg/dL mẫu thử môi trường có không khí 5% CO2 95% O2, nhiệt độ 370C Sự hấp thu glucose được tính toán theo chiều dài (cm) ruột non với kết quả đo nồng độ glucose trước sau ủ để đánh giá mức độ ức chế hấp thu glucose của mẫu thử {Zhiqiang L, 2013 #4}, {Chika Ifeanyi C& Mohammed Auwal I, 2016 #3} Ưu điểm của mơ hình có thể đánh giá được yếu tố ảnh hưởng đến sinh khả dụng của loại thuốc uống Hiệu suất sinh học có thể thu được nhanh chóng đáng tin cậy sử dụng những kỹ thuật Nhưng nhược điểm của mô hình mơi trường hấp thu có khác với môi trường thể sống thiếu enzym tác đợng vào q trình hấp thu glucose {Zhiqiang L, 2013 #4} Để đánh giá khả ức chế hấp thu glucose ruột non của Myoinositol , Chika Ifeanyi cộng (2016) tiến hành cô lập ruột của chuột đực Sprague-Dawley trưởng thành Các kỹ thuật được thực hiện trên, kết quả Myoinositol có tác dụng ức chế hấp thu glucose đoạn ruột non bị cô lập với IC50= 28.23% Nghiên cứu cho thấy sử dụng Myo-inositol đường uống ức chế glucose ở tá tràng, ruột non giảm glucose máu {Chika Ifeanyi C& Mohammed Auwal I, 2016 #3} 1.3 Ức chế enzym tiêu hóa glucid Tinh bợt Saccharose (Glucose - Fructose) Lactose Amylase β-Galactosidase Maltose (Glucose + Glucose) α-glucosidase Glucose Glucose Glucose Fructose Glucose Galactose Tăng glucose máu Hình 1.3 Các enzym tham gia tiêu hóa hấp thu glucid 1.3.1 Alpha-glucosidase α -glucosidase (α-glucosidase) hay có tên khác maltase một enzym phân bố nhiều ở diềm bàn chải, màng ngồi tế bào thành ṛt non Enzym có hoạt tính xúc tác phản ứng thủy phân maltose thành D-glucose (hình 1.3) Carbohydrat chi được hấp thu qua màng ruột non dưới dạng monosaccharid, đó việc thủy phân disaccharid thành monosaccharid đóng vai trò quan trọng hấp thu Như vậy, ức chế αglucosidase có thể làm chậm hấp thu carbohydrat ở ruột non, làm hạn chế tăng glucose máu sau ăn {Mutiu Idowu K & Anofi Omotayo Tom A, 2016 #2367} Mơ hình thực nghiệm in vitro để khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase cách sử dụng chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid (PNP-G) chất ban đầu bị α-glucosidase thủy phân sinh α-D-glucose p-nitrophenol (PNP) Phương pháp nghiên cứu ức chế enzym α-glucosidase điều trị đái tháo đường typ phương pháp được ưu tiên sử dụng có chế đơn giản, an tồn, chi xảy bợ phận tiêu hóa chứ khơng tham gia vào q trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức của insulin hoặc kích thích sản sinh insulin của tế bào beta tuyến tụy… phương pháp khác {Trương Thị Tố Chinh, 2016 #668}, {Rizna Triana D, 2015 #667} Rizna cộng nghiên cứu tác dụng ức chế α-glucosidase của quercetin được chiết xuất từ một loại nấm (Aspergillus terreus) Mơ hình in vitro được thực hiện với kết quả tác dụng ức chế α-glucosidase của quercetin với IC50 10.92 µM {Rizna Triana D, 2015 #667} Trương Thị Tố Chinh cộng (2016) thực hiện vối với IC50 10 Một báo cáo tổng quan của Li cộng (2016) chất có tác dụng ức chế PTP1B thông qua ức chế chọn lọc TCPTP (T-cell protein tyrosin phosphatase), nghiên cứu chứng minh được ức chế chọn lọc TCPTP có một tương đồng tới ức chế PTP1B {Li X, 2016 #2457} Hiện nay, nhà khoa học tìm được công thức cấu tạo IC50 của 44 chất có tác dụng ức chế TCPTP PTP1B có IC50 từ 0,003 đến 164 (μM) {Li X, 2016 #2457} Việc tìm kiếm chất có tác dụng ức chế PTP1B có nguồn gốc từ dược liệu được tác giả Việt Nam thực hiện {Quế, 2013 #95}, {Phi-Hung N, 2015 #554} 3.3 Glycogen synthase kinase (GSK-3 ) Glycogen synthase kinase (GSK-3 ) enzym quan trọng trình tổng hợp glycogen GSK-3 gây bất hoạt ức chế GS, giảm tổng hợp glycogen, tăng nồng độ glucose máu Mặt khác có nghiên cứu chứng minh giảm nồng độ của GSK-3 có thể làm giảm phá hủy tế bào beta {Miranda N & Dietbert N, 2016 #2462} Do vậy, nghiên cứu in vitro với mục tiêu đánh giá tác dụng của thuốc/chế phẩm thử ức chế GSK-3 tế bào {Ciara M and Mariann B, 2011 #5} Mơ hình được tiến hành sau: Thu nhận tế bào, ly giải, rửa chất tẩy rửa Triton X-100 để lại nguyên vẹn cho bào quan túi nội bào Sau đó ủ tế bào với thuốc/chế phẩm thử Nồng độ GSK-3 được xác định cách gắn kháng thể kháng GSK-3và nồng độ glycogen được xác định cách đánh dấu phóng xạ kết quả được soi dưới kính hiển vi điện tử {D, 2016 #306}, {Shin D, 2007 #6} Mơ hình có ưu điểm giữ lại được nguyên vẹn của bào quan túi nợi bào để q trình thí nghiệm in vitro được diễn tương tự thể sống nhiên tương tác khó bảo quản trình ly giải tế bào sử dụng chất tẩy rửa Shin D cộng (2007) nghiên cứu tác dụng ức chế GSK-3 của benzimidazole 7-hydroxy để so sánh với dẫn chất cho kết quả IC 50 từ 15-25 nM, benzyl hoặc propyl benzen, IC 50 870 nM 580 nM {Shin D, 2007 #6}.Tương tự Lithium một những chất được Jorge cộng nghiên cứu (2016) chứng minh có tác dụng ức chế GSK-3 với IC50 10mM Ức chế GSK-3 bởi lithium làm giảm phosphoryl hóa Serin từ 30-50%, làm tăng cường sử dụng glucose, tăng tổng hợp glycogen ở ruồi giấm {Jorge Iva´n C-Q , 2016 #2463} Nhiều chất ức chế GSK-3 hiện được nghiên cứu thử nghiệm tiền lâm sàng, lâm sàng giai đoạn nghiên cứu {D, 2016 #306} MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM IN VITRO LIÊN QUAN ĐẾN CÁC ENZYM THAM GIA CHUYỂN HĨA GLUCID 4.1 Vai trò gan enzym tham gia chuyển hóa glucid Glucid từ ṛt theo tĩnh mạch cửa gan chủ yếu glucose, lại galactose fructose Fructose galactose được gan chuyển thành glucose trước sử dụng 25 Ngoài ra, gan có thể tạo glucose từ acid amin sinh đường, acid béo, glycerol acid lactic Các chất được chuyển thành acid pyruvic hoặc phosphopyruvic thành glucose-6-phosphat trước chuyển thành glucose Chuyển hóa glucid gan thơng qua q trình tổng hợp glycogen dự trữ cho thể tăng phân giải glycogen cung cấp lượng cho thể nhờ một hệ thống enzyme (hình 1.8) Chuyển hóa glucose Nồng đợ cao glucose gan Màng ty thể Hình 1.8.Vai trò enzym gan việc điều hòa glucose máu Ngồi ra, gan có vai trò điều hòa glucose máu của thể Khi lượng glucose máu tăng cao, gan tổng hợp glycogen để dự trữ giảm giải phóng glucose Ngược lại, glucose hạ, gan tăng phân giải glycogen sinh đường mới, giải phóng glucose vào máu Đảm bảo cho chức của gan được hoạt động bình thường chính vai trò của enzyme có mặt gan {Essam Abdel.S, 2016 #666} 4.2 Các enzym tham gia chuyển hóa glucose 4.2.1 Enzym tổng hợp glucose Việc ức chế enzyme tham gia thoái hóa glycogen tạo glucose hoạt hóa enzyme tham gia tổng hợp glycogen gan góp phần làm giảm glucose máu lúc đói của bệnh nhân đái tháo đường Như vậy, mơ hình thực nghiệm in vitro được nhà khoa học thực hiện enzym tham gia chuyển hóa glucose tế bào gan với mục đích nghiên cứu thuốc mới làm giảm glucose máu bệnh nhân đái tháo đường {Mary J, 2016 #699}, {Hui T, 2016 #2469}, {, 2016 #2470} 4.2.1.1 Enzym glucose phosphatase (G6Pase) Glucose-6-phosphatase (G6Pase) một phức hệ enzym xúc tác phản ứng phân cắt glucose-6-phosphat (G6P) thành glucose gốc phosphat vô cơ, khâu cuối cả hai q trình thối hóa glycogen tân tạo glucose 26 Hoạt độ của G6Pase được tính lượng phospho vô sinh phút 1mg protein gan ở điều kiện nhiệt độ 37 0C, pH 6,5 Hàm lượng protein gan được định lượng phương pháp khác {Mary J, 2016 #699}, {Paul K, 1962 #7}, {Maier RH, 2012 Dec`;58(4):376-84 #704}, {Di L, 2016 #662} Tiến hành: Lấy gan chuột, cắt thành miếng nhỏ, sau đó cho vào ống nghiệm đồng thể có sẵn dung dịch đệm lạnh (đệm citrat pH=6,5) Nghiền gan điều kiện lạnh (nhiệt độ dưới 40C) đến thu được dung dịch đồng thể, sau đó thêm đệm lạnh để được ti lệ 1: Dịch nghiền thu được đem ly tâm lạnh ở 0C với tốc đợ 3.000 vòng/phút 10 phút, lấy dịch tiếp tục ly tâm lạnh tốc đợ 10.000 vòng/phút vòng 30 phút Phần dịch thu được sau ly tâm được dùng để xác định hoạt độ enzym cách đánh giá thay đổi hoạt tính hay mức độ biểu hiện gen của enzym Phản ứng được tiến hành ống nghiệm 5mL gồm: đệm citrate,nước cất, chất Dung dịch enzym dung dịch chất được ủ ở 37 0C 10 phút Tiếp tục thêm enzym Tiếp tục ủ 10 phút ở 37 0C Dừng phản ứng acid tricloacetic, lắc kỹ, để yên phút, ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút, thu được dịch làm thí nghiệm xác định phospho vô hoặc mức độ biểu hiện protein {Paul K, 1962 #7}, {Maier RH, 2012 Dec`;58(4):376-84 #704}, {Di L, 2016 #662} Mơ hình có ưu điểm tốn ít thời gian, kết quả lặp lại Có thể áp dụng sàng lọc một lượng mẫu lớn thời gian ngắn, chi phí thấp Enzym những chất xúc tác sinh học có bản chất protein Trong những điều kiện bất lợi chúng không bền, có thể dễ ràng bị biến tính bị hoạt độ của nó Do đó làm việc với enzyme phải ý tránh những điều kiện dễ làm hoạt độ của enzyme Đặc biệt lưu ý pH tinh enzyme cần tiến hành ở nhiệt độ thấp Nghiên cứu của Hemmerle cộng với mục đích đánh giá khả ức chế enzyme G6Pase của kodaistatin được chiết tách từ nấm Aspergillus terreus, tác giả sử dụng mơ hình in vitro kết quả cho thấy Kodaistatin A có khả ức chế cạnh tranh với G6Pase với IC50 = 80,0 nM {Vertesy, 2000 #277} Madsen chi dẫn chất tetrahydrothienopyridin có khả ức chế cạnh tranh với G6Pase giá trị IC50 vào khoảng 0,61 μM {Madsen, 2000 #279} dẫn chất N,N-dibenzyl-N’benzylidenhydrazin có khả ức chế cạnh tranh với G6PT1 có IC 50 khoảng 0,17 μM {Madsen, 2001 #280} Các chất ức chế G6Pase có nguồn gốc từ Dược liệu được tiếp tục tìm kiếm Nghiên cứu của Subramani Srinivasan (2014) chứng minh uegenol sử dụng cho chuột đái tháo đường typ 2, sau đó lấy gan chuột để xác định hoạt độ G6Pase Kết quả cho thấy hoạt độ enzyme G6pase giảm {Subramani S, 2014 #2468} Một nghiên cứu của Hui Teng cộng (2016) phân lập chất từ long Nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb) thử tác dụng dòng tế bào C57BL/KsJ của cḥt béo phì ĐTĐ typ Kết quả chất ức chế G6Pase với IC50 của từ 2,2 đến 25,6 nM {Hui T, 2016 #2469} 27 4.2.1.2 Enzyme Fructose-1,6-biphosphatase (F1,6BPase) F1,6BPase F1,6BPase xúc tác chuyển F1,6BP thành F6P đường tân tạo glucose Nhiều nghiên cứu sàng lọc chất ức chế F1,6Bpase được tiến hành nghiên cứu in vitro gan chuột đái tháo đường thực nghiệm Cơ chất dùng cho thí nghiệm Fructose-1,6-biphosphatas {Hui T, 2016 #2469} Một hợp chất có hoạt độ mạnh với độ an toàn cao được xác định CS-917 Với tác dụng ức chế F1,6Bpase được Yoshida cộng thực hiện tiến hành thử nghiệm in vitro tế bào gan của chuột đái tháo đường được điều trị CS-917 Kết quả nồng độ F1,6Bpase giảm kèm với tác dụng làm hạn chế tăng glucose máu sau bữa ăn hạn chế tăng glucose máu lúc đói của chuột thí nghiệm {Yoshida, 2008 #281} Nồng độ F1,6BP nghiên cứu của Subramani (2014) với hợp chất uegenol giảm gan của chuột đái tháo đường typ thực nghiệm {Subramani S, 2014 #2468} 4.2.2 Các enzym enzyme thối hóa glucose Có enzym xúc tác phản ứng không thuận nghịch của đường đường phân gồm glucokinase (GK), phosphofructokinase-1 (PFK-1) pyruvat kinase {Hui T, 2016 #2469} Đây enzym định tốc độ của đường đường phân Một những chất hoạt hóa GK được Grimsby J cộng (2003) công bố WO0058293 với tác dụng giảm sản xuất glucose ở gan cḥt bình thường cḥt đái tháo đường {Grimsby, 2003 #284} Theo một báo cáo tổng hợp chất hoạt hóa GK được công bố bao gồm chất sau: WO2004072931 (OSI -2014), một những chất hoạt hóa GK có tác dụng mạnh chống tình trạng glucose huyết cao Tác dụng hoạt hóa GK của chất thể hiện rõ in vitro, biểu hiện ở kích thích tiết insulin, tăng tổng hợp glycogen ở gan, giảm tân tạo glucose Chất được ghi nhận có đợ an tồn cao WO2005044801(Astra Zeneca-2005), một dẫn chất của acid benzoylaminonicotinic có tác dụng hoạt hóa GK mạnh, làm thay đổi những thông số động học của GK Trong những nghiên cứu tiền lâm sàng, GKA-50 làm hạ glucose huyết rõ rệt {Matschinsky, 2009 #283} Các chất hoạt hóa GK có nguồn gốc từ dược diệu được tiếp tục tìm kiếm Nghiên cứu của Hui Teng với chất được phân lập từ long Nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb) thử tác dụng dòng tế bào C57BL/KsJ của cḥt béo phì ĐTĐ typ Với nồng đợ khác Các kết quả hoạt hóa GK có khác biệt với nhóm chứng {Hui T, 2016 #2469} 4.3 Enzym chuyển hóa glycogen 4.3.1 Enzym tham gia thối hóa glycogen Bên cạnh đường thoái hóa tổng hợp glucose, nồng đợ glucose máu chịu ảnh hưởng bởi chuyển hóa của glycogen Q trình thối hóa glycogen giải phóng glucose tự một nguyên nhân quan trọng làm tăng glucose máu 28 Enzym chủ chốt q trình thối hóa glycogen glycogen phosphorylase (GP), GP định tốc đợ của q trình thoái hóa glycogen {, 2016 #2470} Ức chế GP làm giảm đáng kể q trình thối hóa glycogen, giảm nguy tăng glucose máu Do đó, nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm chất ức chế GP để điều trị đái tháo đường {, 2016 #2470} Mơ hình đánh giá khả ức chế GP của thuốc/chế phẩm thử được thực hiện tương tự thay với chất glycogen David Goyard cộng năm 2016 nghiên cứu khả ức chế GP của dẫn xuất carbohydrat spiro-anomeric Mơ hình thực nghiệm in vitro được tiến hành tương tự kết quả IC50 tế bào gan của Thỏ của dẫn xuất carbohydrat spiro-anomeric từ 0,16 – 59,7µM {David G, 2016 #2470} Cũng nghiên cứu kết quả IC 50 tế bào gan chuột tế bào gan người của dẫn chất acethyl spiro-isoxazolin 2-Naphthyl 2-Naphthyl-6-OH với IC50 tế bào gan người 2,5 22,16 µM tương ứng tế bào gan cḥt 13,58 30,07µM Mợt báo cáo tổng hợp của Marion được sử dụng mơ hình in vtro để nghiên cứu 23 chất có tác dụng ức chế GP với IC50 từ 0,02 đến 625 µM {S, 2016 #2471} 4.3.2 Enzym tham gia tổng hợp glycogen Có enzym xúc tác phản ứng không thuận nghịch của đường đường phân gồm glucokinase (GK), phosphofructokinase-1 (PFK-1) pyruvat kinase {Hui T, 2016 #2469} Trong đó, GK enzym quan trọng nhất, định tốc độ của đường đường phân Tăng cường hoạt động của GK làm tăng tốc độ đường phân, đó làm giảm glucose máu Hiện GK được nhiều nhà khoa học công ty dược phẩm ý nhằm tìm những chất hoạt hóa GK để điều trị đái tháo đường Mô hình thực nghiệm in vitro được tiến hành với chất glucose {Hui T, 2016 #2469} Hoffman-La Roche người thử nghiệm in vitro khả hoạt hóa GK của WO0058293 gan chuột bình thường cḥt đái tháo đường sử dụng WO0058293 {Grimsby, 2003 #284} Theo một báo cáo tổng hợp chất hoạt hóa GK được công bố bao gồm chất sau: WO2004072931 (OSI -2014), một những chất hoạt hóa GK có tác dụng mạnh chống tình trạng glucose máu cao Tác dụng hoạt hóa GK của chất thể hiện rõ in vitro, biểu hiện ở kích thích tiết insulin, tăng tổng hợp glycogen ở gan, giảm tân tạo glucose {Matschinsky, 2009 #283} Các chất hoạt hóa GK có nguồn gốc từ dược diệu được tiếp tục tìm kiếm Nghiên cứu của Hui Teng với chất được phân lập từ long Nha thảo (Agrimonia pilosa Ledeb) thử tác dụng dòng tế bào C57BL/KsJ của cḥt béo phì ĐTĐ typ Với nồng khác Các kết quả hoạt hóa GK có khác biệt với nhóm chứng {Hui T, 2016 #2469} Contents 29 MỘT SỐ KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG TRONG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM IN VITRO Matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI-TOF-MS) MALDI thuật ngữ chi phương pháp ion hóa mẫu hấp thụ dựa hỗ trợ của chất lượng laser Nguồn MALDI sử dụng chất hỗ trợ để ion hóa mẫu dưới tác dụng của lượng laser lớn Ban đầu, mẫu được xử lý, làm tinh nhiều phương pháp khác Sau đó mẫu phân tích được trộn với chất (các axit yếu sinapinic) chứa phân tử hữu nhỏ có khả hấp thụ lượng ánh sáng ở những bước sóng định Hỗn hợp mẫu chất được đưa lên khay bay tạo thành hạt tinh thể bám với peptid Dưới tác dụng của nguồn lượng laser cực lớn chiếu vào làm cho chất (axit yếu) hấp thụ lượng bật photon Mẫu được hấp thụ photon lượng được vào hệ thống khối phổ TOF Các ion dương thường được tạo đối với mẫu dạng peptid/protein Mỗi peptid có xu hướng hấp thụ một photon kết quả ion peptid tích điện dương +1 Phương pháp thường được sử dụng cho mẫu protein đơn giản, tinh [4] Karthik cộng (2012) nghiên cứu thay đổi nồng độ protein gan của chuột đái tháo đường bởi aloxan sử dụng dịch chiết ethanol của cỏ gà (Cynodon dactylon) liều 450mg/kg Kỹ thuật MALDI-TOF-MS được sử dụng để đánh giá mức độ biểu hiện protein gan chuột Vistar sau 15 ngày dùng mẫu thử Kết quả cho thấy gan của lô chuột được điều trị dịch chiết cỏ gà (C dactylon) có ba loại protein tăng so với quy định đó nucleophosmin, l reductase -xylulose carbonic anhydrase III Các protein có vai trò chủ yếu việc tăng sinh tế bào, ức chế khối u chuyển hóa glucose Kết quả minh họa chế phân tử kết nối với chức gan insulin kết hợp điều trị đái tháo đường của cỏ gà [4] Nghiên cứu của Dhanaraj cộng (2014) tiến hành thử tác dụng của dịch chiết ethanol của cỏ gà tế bào tim của chuột Vistar đái tháo đường bởi aloxan Tác giả sử dụng kỹ thuật MALDI-TOF-MS để xác định số lượng protein bị thay đổi sử dụng dịch chiết ethanol cỏ gà Kết nghieenc ứu tim hai protein có thay đổi neurotrophins (NTF4) flavoprotein beta tiểu đơn vị (ETFB) Các protein có vai trò quan trọng việc chuyển hóa glucose tim chức của tim Những kết quả cho thấy chức tim có thể được cải thiện bệnh đái tháo đường typ I sử dụng dịch chiết ethanol của cỏ gà {Dhanaraj K, 2014 #9} 4.2 High-performance liquid chromatography (HPLC ) Nguyên tắc: dựa vào phân bố khác của chất cần định lượng giữa hai pha động tĩnh Các chất khác có lực khác với pha động pha tĩnh Hệ 30 quả chất có lực lớn với pha tĩnh chuyện động chậm qua hệ thống sắc ký so với chất tương tác yếu pha Nhờ đặc điểm mà người ta có thể tách chất qua trình sắc ký {Shyamala, 2013`, #706} Áp dụng phân tích protein HPLC: Các protein được chạy qua cột nhồi hạt aganose hoặc polyacrylamit nhỏ được cải biến phù hợp Có phương pháp khác việc sử dụng cột tách chiết tinh protein Ưu điểm của HPLC: Tốc độ nhanh (nhiều phân tích