MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM IN VIVO TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

Chuyên đề được thực hiện với sự tìm hiểu chi tiết, kỳ công, có cơ sở khoa học chắc chắn từ các nghiên cứu trong nước và ngoài nước mô tả về các mô hình thực nghiệm invivo trong việc đánh giá tác dụng của thuốc dược liệu có hay không tác dụng hạ đường huyết để ứng dụng trong điều trị Đái tháo đường.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ ĐƠNG MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM IN VIVO TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ HÀ NỘI, NĂM 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ ĐÔNG MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM IN VIVO TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC Mã số: 62 72 04 08 HÀ NỘI, NĂM 2016 MỤC LỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT TRANG CÁC CHỮ VIẾT TẮT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Akt Db/db ĐTĐ ECLIA FDA GDH GIP GLP-1 GOD GUT HbA1c HOMA IR IRS ISI JNK MAPK NOD NOS OB/OB PI3 POD PTP1B QUICKI STZ TLR6 The serine/threonine kinase Diabetes Đái tháo đường Electro Chemiluminessance Immuno Assay), Food and Drug Administration Glucose dehydrogenase Glucose-dependent insulinotropic polypeptide Glucagon-like peptide Glucose oxidase Glucose - transorter hemoglobin A1c Homeostasis Model Assessment Insulin receptor insulin receptor substrate (insulin sensitivity index Jun N-terminal kinase Mitogen –activated protein kinase nonobese diabetic nitric oxide synthase Obese Phosphatidylinositol Peroxydase protein-tyrosine phosphatase 1B Quantitative Insulin Sensitivity Check Index Streptozocin Toll-like receptor-6 ĐẶT VẤN ĐỀ “Thế kỷ 21 là thế kỷ của bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa” Dự báo này của chuyên gia y tế từ những năm 90 của thế kỷ trước đã trở thành hiện thực [1] Trong số bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa thì đái tháo đường (ĐTĐ), nhất là đái tháo đường typ đã và là mối quan tâm của không chỉ những người làm công tác y tế mà còn cả những nhà quản lý xã hội Bệnh là gánh nặng về kinh tế xã hội tại nước phát triển và đặc biệt nặng nề là ở những nước phát triển [11] Nhu cầu sử dụng thuốc điều trị đái tháo đường ngày càng gia tăng Việc nghiên cứu tìm kiếm thuốc mới có tác dụng hạ glucose máu hiệu quả, an toàn, giá thành hợp lý là vấn đề đặt cấp thiết Tất cả loại thuốc mới nói chung và thuốc điều trị đái tháo đường nói riêng đều phải thử nghiệm tiền lâm sàng động vật Việc sử dụng mô hình động vật cho phép nhà khoa học nghiên cứu thử nghiệm tiền lâm sàng, bảo đảm hiệu quả, an toàn cho nghiên cứu lâm sàng tiếp theo người Mô hình động vật thường sử dụng nghiên cứu y sinh học với mục đích nghiên cứu về dược lực học, dược đợng học, chế tác dụng của thuốc, nguyên nhân gây bệnh, đợc tính Các mơ hình bệnh lý động vật có thể có bản chất tự nhiên hoặc gây tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học… Trong nghiên cứu thuốc chữa ĐTĐ, ngày càng có nhiều mô hình ĐTĐ thực nghiệm phát triển Tùy từng mục đích nghiên cứu và điều kiện thí nghiệm mà có thể lựa chọn mơ hình thực nghiệm khác Xuất phát từ lý nêu trên, chun đề: “Mơ hình thực nghiệm in vivo nghiên cứu thuốc điều trị đái tháo đường” thực hiện với mục tiêu: Tìm hiểu mơ hình thực nghiệm in vivo thường sử dụng nghiên cứu thuốc điều trị đái tháo đường MƠ HÌNH GÂY TĂNG GLUCOSE THỰC NGHIỆM Có nhiều nguyên nhân tăng glucose máu thực nghiệm sử dụng một lượng đường nhiều một thời gian ngắn hoặc sử dụng một hormon gây tăng glucose máu như: Adrenalin…Mô hình này đơn giản chỉ đơn là gây tăng glucose máu thực nghiệm chưa thể hiện rõ là đái tháo đường typ hay typ 1.1 Tăng glucose máu glucose ngoại sinh Mô hình tăng glucose máu cách cho chuột đã nhịn đói, sau uống dung dịch chế phẩm thử 3-4 cho uống dung dịch glucose Định lượng glucose máu vào thời điểm trước và sau uống dung dịch glucose 30 hoặc 60 phút [] Mục đích là xác định tác dụng của chế phẩm thử sự tăng glucose máu ngắn hạn glucose ngoại sinh Với ưu điểm là dễ thực hiện, đơn giản rẻ tiền hạn chế của mô hình này chưa xác định tác dụng hạ glucose máu động vật bị đái tháo đường Hiện nay, mô hình này không còn áp dụng nữa mà thử nghiệm test dung nạp glucsoe đường uống thay thế [39], [10], [54] 1.2 Tăng glucose máu tiêm Adrenalin Adrenalin có tác động lên gan, mô mỡ và với chế tác dụng thông qua AMPv glucagon Do đó, bên cạnh những tác động tương tự glucagon gan tăng cường thối hóa đồng thời ức chế tổng hợp glycogen, kích thích tân tạo glucose ở gan, tăng cường huy đợng acid béo từ mơ mỡ… Adrenalin còn kích thích q trình đường phân yếm khí ở để cung cấp lượng cho co [73] Ngoài ra, để củng cố thêm những tác động chuyển hóa nói trên, Adrenalin ức chế bài tiết insulin và kích thích bài tiết glucagon ở tuyến tụy [73] Mô hình gây đái tháo đường thực nghiệm Adrenalin thực hiện để đánh giá tác dụng ban đầu của chế phẩm thử Với liều 0,6 - 0,8mg/kg tùy vào loài động vật thí nghiệm Sau đợng vật đã sử dụng chế phẩm thử 3-4 và định lượng glucose máu trước và sau tiêm Adrenalin 1-2 [74] Nghiên cứu gần của Vijayalaxmi và cộng sự (2016) với mục đích đánh giá tác dụng hạ glucose máu của Gluconarc (Ayu-Dia), tác giả đã sử dụng liều Adrenalin 0,8mg/kg để gây đái tháo đường cho chuột cống Vista Sau tiêm Adrenalin, nồng độ glucose máu của chuột tăng lên 232,7mmol/dL [74] Mô hình này có ưu điểm là dễ thực hiện, nồng độ glucose máu tăng nhanh và cao sau tiêm Adrenalin 10-15 phút Do đặc tính của Adrenalin tác đợng kích thích thần kinh trung ương nên sử dụng những động vật này thường có biểu hiện run rẩy, sợ sệt nhiều có phản ứng thái chống lại lấy máu đo nồng độ glucose máu Hạn chế tiếp theo của mô hình này là nghiên cứu chỉ đánh giá tác dụng hạ glucose máu tức thời của chế phẩm thử [74] MƠ HÌNH GÂY ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYP Đái tháo đường typ là sự tổn thương của tế bào beta đảo tụy (thường tự miễn) Do mô hình ĐTĐ typ phát triển dựa nguyên tắc gây suy giảm về cấu trúc và/ hoặc chức của tụy Mô hình ĐTĐ typ xây dựng nhiều phương pháp khác bản có phương pháp phổ biến nghiên cứu [11] 2.1 Đái tháo đường di truyền Có thể gây ĐTĐ typ hoặc ĐTĐ typ di truyền cho động vật nghiên cứu phương pháp lai tạo và chọn giống Động vật ĐTĐ typ di truyền hay sử dụng nhiều nhất là chuột cống BB và chuột nhắt NOD [32] Trên mô hình này nhà khoa học đã tìm nhiều loại gen liên quan đến việc phá hủy tế bào bê ta (Idd1, Idd5, Idd chuột NOD, Ins2 chuột Akita hay Iddm1 chuột BB…) [78] Cùng với phát hiện về chế phân tử của insulin, đã có nhiều phương pháp gây ĐTĐ cho động vật cách chuyển gen hoặc đột biến gen [32] Xiaotian Lin và cộng sự (2015) đã sử dụng phương pháp cấy chuyển gen để gây ĐTĐ typ cho chuột nhắt (NOD) biến thể alen PTPN22 Kết quả một sự gia tăng đáng kể tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường typ ở chuột NOD mang gen có alen PTPN22R619W là một dị hợp tử [78] Chuột Akita đột biến gen Ins2C96Y/+ dẫn đến suy giảm tế bào bê ta và tăng glucose máu kéo dài Một nghiên cứu so sánh những chuột đực Akita (các chủng khác C57BL/6, 129/SvEv, DBA/2, FVB/NJ, F1(D2:B6) đột biến gen Ins2C96Y/+ với những chuột Akita không đột biến gen Ins2C96Y/+ sử dụng STZ Kết quả cho thấy chuột Akita đột biến gen có glucose máu tăng cao, ổn định 33,2 mmol/dl chuột gây đái tháo đường bởi STZ thì glucose máu chỉ ở mức >22,0mmol/l Mặt khác, chuột Akita đột biến gen có biến chứng của bệnh đái tháo đường mà người mắc phải, đó những chuột Akita gây đái tháo đường STZ thì không thấy dấu hiệu này [32] Động vật ĐTĐ di truyền có biểu hiện tương đối giống ở người loại động vật này không đại diện cho chế bệnh sinh ĐTĐ ở người những gen đợt biến này rất gặp Hơn nữa, ĐTĐ ở người thường sự thay đổi của nhiều gen và thường kết hợp với nguyên nhân khác [32] Mô hình này còn có những hạn chế nhất định quy trình gây bệnh phức tạp và khả thành công giữa cá thể là không ổn định phụ thuộc vào khả miễn dịch của từng cá thể Mặt khác, thời gian gây bệnh kéo dài 18-20 tuần, chi phí tớn [32] Việt Nam đã có tác giả công bố nghiên cứu cḥt cớng GK [5] Tuy nhiên, thí nghiệm này đều tiến hành tại nước ngoài Hiện nay, chưa thấy có giống chuột ĐTĐ di truyền 2.2 Đái tháo đường cắt bỏ tuyến tụy Đây là phương pháp kinh điển gây ĐTĐ typ ở một số loài động vật với triệu chứng tương tự đái tháo đường typ 1ở người Mức độ trầm trọng của bệnh phụ thuộc vào mức độ phá hủy tụy (một phần hay hoàn toàn) Động vật cắt bỏ 85-90% tuyến tụy Điểm hạn chế của mô hình này là sự tái sinh của tuyến tụy còn lại Do đó mơ hình này chỉ thích hợp cho nghiên cứu về chế thích nghi của tế bào beta tuyến tụy [32] Cắt bỏ một phần tuyến tụy là yêu cầu kỹ thuật cao, phải sử dụng thuốc mê và kháng sinh phòng nhiễm khuẩn Vì có thể gây ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu [32] Sau cắt bỏ phần lớn tụy, động vật đáp ứng với tác đợng nhằm hạ glucose máu Hơn nữa, trình làm thí nghiệm cần phải thường xuyên bổ xung enzym tụy cho động vật [75] Gần đây, không ghi nhận nghiên cứu nào sử dụng phương pháp này gây để gây bệnh đái tháo đường typ 2.3 Đái tháo đường nhiễm virus Sở dĩ nhiễm virus coi là nhân tố quan trọng nguyên nhân gây ĐTĐ typ ở người vì tỉ lệ phát bệnh tăng theo mùa, đặc biệt mùa có dịch cúm Trong mợt phân tích gần của Anita Kondrashova cho thấy virus cúm A gây bệnh đái tháo đường, đặc biệt với trẻ em [13] Mặt khác, nhà khoa học đã phân lập virus Coxsacki loại B4 từ tiểu đảo tụy của một số bệnh nhân ĐTĐ typ tử vong nhiễm toan ceton Khi tiến hành gây nhiễm với virus Coxsacki ở đợng vật thí nhiệm cho thấy tế bào beta bị nhiễm virus và xuất hiện ĐTĐ ở những động vật này Từ những năm 80 Kilham đã khám phá việc nhiễm virus chuột BBDR là một những nguyên nhân gây bệnh đái tháo đường typ [32] Có thể gây bệnh đái tháo đường cho chuột cách cho nhiễm loại virus khác như: quai bị, rubella, rota, parvo, herpes, entero viêm gan B, C [32] Michael đã gây mô hình đái tháo đường typ cách cho chuột nhiễm virus herpes, xác định nồng độ interleukin 10 (IL-10) và theo dõi trình tự phá hủy của tế bào tại mạch bạch huyết Trong 12-14 đầu sự phá hủy tế bào diễn hàng loạt đó có tế bào beta và nồng độ glucose máu của chuột tăng cao [49] Mặc dù, có những nghiên cứu sâu xác định tầm quan trọng của yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự khởi phát của bệnh đái tháo đường typ Tuy nhiên, chế nhiễm virus có thể tham gia vào sự phát triển của đái tháo đường typ khó giải thích [32] Mơ hình này cho tới chưa áp dụng tại Việt Nam 2.4 Đái tháo đường hóa chất Hiện nay, mơ hình gây bệnh đái tháo đường týp 1thường tạo một số tác nhân phá hủy tế bào beta tuyến tụy đó có Streptozptocin (STZ) và Alloxan Việc xây dựng mô hình bệnh lý đái tháo đường đã thực hiện loài động vật chó, mèo, thỏ, và động vật thuộc bộ gặm nhấm là thông dụng cả 2.4.1 Alloxan - Alloxan liều cao 150mg/kg Alloxan, một hợp chất pyrimidin triceton có cấu trúc tương tự glucose và acid uric, tích lũy gây đợc trực tiếp và chọn lọc tế bào beta của tuyến tụy, thông qua hệ thống vận chuyển glucose GLUT2 Alloxan tương tác với nhóm SH nội bào, đặc biệt là glutathione, sinh acid dialuric có khả oxi hóa Quá trình tự oxi hóa của chất này sản sinh gốc superoxide: hydrogen, peroxide và gốc hydroxyl Gốc hydroxyl là tác nhân cuối gây phá hủy tế bào Beta tế bào này có khả chống lại sự oxi hóa vì gây tình trạng ĐTĐ phụ thuộc insulin Alloxan có tác dụng ức chế glucokinase đó ức chế bài tiết insulin Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh alloxan là hợp chất thích hợp gây ĐTĐ đợng vật thực nghiệm Động vật gây ĐTĐ alloxan có những biểu hiện lâm sàng giống biểu hiện ĐTĐ lâm sàng người: sút cân, uống nhiều nước, đái nhiều, có đường nước tiểu, xeton niệu, glucose máu và xeton máu [28] Ở hầu hết loài, sau dùng alloxan đều có biểu hiện tăng glucose máu sau đó glucose máu giảm, có lẽ insulin giải phóng nhiều từ tiểu đảo tụy tiểu đảo tụy tổn thương mất dịch, tiếp theo là giai đoạn tăng glucose máu ổn định và kéo dài Liều dùng để gây ĐTĐ động vật thực nghiệm tùy thuộc vào từng giai đoạn và từng nghiên cứu Nghiên cứu của Diptanu Biswas (2016) đã sử dụng alloxan pha dung dịch nước muối 2% với liều 150mg/kg tiêm màng bụng cho chuột cống chủng Wistar albino Sau 48 lô chuột đầu có glucose máu tăng cao > 22,5mmol/L [28] Một công bố khác của Sarbashri Bank đã sử dụng alloxan tiêm màng bụng với liều 150mg/kg cân nặng cho chuột Swiss albino trưởng thành (25-30g) Sau tiêm 10 liều STZ 65mg/kg và sau 15 phút tiêm nicotinamid 130mg/kg, sau 72 giờ, nồng độ glucose tăng cao 300mg/dL [7] Một hướng tiếp cận tương tự sử dụng STZ và nicotinamid với liều 60 và 120 mg/kg để gây mô hình đái tháo đường typ chuột Wistar albino [57] Mô hình kết hợp STZ và nicotinamid thích hợp cho việc nghiên cứu tác dụng của thuốc điều trị đái tháo đường typ cho trường hợp không béo phì và tác dụng chống oxy hóa của chế phẩm bệnh nhân đái tháo đường typ Các nghiên cứu đều có điểm hạn chế là chưa đánh giá nồng độ insulin huyết chuột bị đái tháo đường để xác định mức độ kháng insulin Để khắc phục nhược điểm Samuel và cộng sự sử dụng STZ và nicotinamid kết hợp với chế độ ăn giàu chất béo chủng chuột C57BL/6J Sau 12 tuần có sự kháng insulin, tăng glucose máu và giảm dung nạp glucose [60] Bằng cách tiếp cận tương tự, mô hình khác phát triển bởi chuột đực C57BL/6J ở 5-6 tuần tuổi.STZ tiêm hai lần với liều 100 mg / kg ở ngày và của thí nghiệm 15 phút sau tiêm nicotinamide 240 mg/kg thể trọng trường hợp Để kết hợp này tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của một chế độ ăn uống HF (34% calo chủ yếu từ mỡ lợn) vào mô hình này Sau tuần, mô hình này đã thể hiện sự tăng đáng kể khác biệt về trọng lượng chuột, không dung nạp glucose, kháng insulin, tăng cholesterol toàn phần, triglycerid [32] Mô hình gây đái tháo đường typ bởi STZ và nicotinamid với liều khác cho thấy sự tăng glucose máu tương đối ổn định và hạn chế sự phá hủy tế bào gan, thận, bê ta của tuyến tụy Mô hình này đơn giản và có thể thực hiện tại Việt Nam 3.5.6 Chế độ ăn giàu chất béo kết hợp streptozocin liều thấp Phương pháp sử dụng phổ biến nghiên cứu là gây ĐTĐ thể béo phì ở loài gặm nhấm chế độ ăn giàu chất béo, đó chuột cống Wistar, C57BL / 6J, KK-ay và Sprague Dawley là số loài phù hợp để thực hiện 26 mô hình này Chế độ ăn nhiều chất béo bao gồm 50- 60% calo cung cấp từ chất béo, 20-25% calo từ protein, 15-20% hỗn hợp carbohydrate và 5-10% calo từ đường đơn Chuột ăn thời gian từ 1,5-2 tháng để gây kháng insulin và gây tổn thương tế bảo beta đảo tụy, gây tình trạng đái tháo đường [32], [61] Chế độ ăn giàu chất béo để gây béo phì áp dụng một cách rộng rãi Chuột gây béo phì phương pháp này có rất nhiều đặc điểm giống với béo phì ở người, tăng kháng insulin, làm mất biểu hiện của adipokin (đặc biệt adiponectin và resistin) Trong một nghiên cứu chuột đực C57BL/6J tuần tuổi ăn nhiều chất béo (60% calo) sự kháng insulin xuất hiện vào tuần thứ 13 [19] Tương tự chế độ ăn chất béo cao (60%) cho chuột trưởng thành C57BL/6J6 sự xuất hiện kháng insulin chậm nghiên cứu trước (16 tuần) [31] Chuột C57BL/6J6 và chuột KK-ay béo phì cho ăn một chế độ ăn nhiều chất béo kết hợp gây mộ trạng thái căng thẳng stress chuột Stress oxy hóa mỡ chất béo tích tụ gây stress oxy hóa toàn bộ thể của chuột dẫn đến hoạt hóa JNK tế bào mỡ và bắp tăng đề kháng insulin [80] Một nghiên cứu khác cứu của Abbas và cộng sự (2016) với mục đích đánh giá tác dụng hạ glucose máu, cholesterol, giảm kháng insulin của Tầm ma Tác giả đã sử dụng chuột cống Vista nuôi béo phì tuần trước tiêm STZ liều 50mg/kg chuột bị nhịn đói 14 Sau 72 tiêm STZ kết quả chuột đã tăng glucose máu 250mg/dL Đi kèm với tăng glucose máu nồng độ cholesterol, triglycerid và LDL tăng cao [6] Matthew và cộng sự (2016) đã sử dụng STZ liều 30mg/kg cân nặng tiêm cho chuột nuôi béo phì tuần 96 sau tiêm STZ nồng độ glucose máu của chuột đều tăng 250mg/dL [47] Tại Việt Nam, một số tác giả đã áp dụng mô hình gây ĐTĐ typ cho chuột thực nghiệm chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với tiêm STZ liều thấp [ 3],[2],[4] Chuột cho ăn theo chế độ ăn giàu chất béo theo nhu cầu Khẩu phần ăn có thành phần bao gồm thức ăn viên, tổng giá trị lượng là 5000-6000 kcal/kg, đó 60% lượng là từ chất béo Sau -8 tuần cho ăn thì tiêm màng bụng 27 streptozotocin liều từ 30 -50 mg/kg pha đệm natri citrate, pH 4,5 [47], [2] Sau tiêm 3- 14 ngày, cho chuột nhịn đói 12-16 giờ, lấy máu đuôi chuột kiểm tra nồng độ glucose máu Chuột có nồng độ glucose máu lúc đói >11,0 mmol/l coi là bị đái tháo đường [12] Nhóm nghiên cứu Đoàn Việt Bình đã sử dụng hình gây bệnh đái tháo đường typ cách nuôi chuột béo phì và tiêm STZ liều thấp Không chỉ dừng lại ở đó, nhóm nghiên cứu còn khảo sát mức độ biến chứng của mô hình gây bệnh ĐTĐ typ này với cách tiến hành sau: tiêm STZ (35mg/kg) ngày nếu nồng độ glucose máu của cḥt ≥ 16,7mmol/L śt thời kỳ thí nghiệm thì không cần tiêm nhắc lại và xếp vào nhóm chuột chỉ tiêm streptozotocin một lần Chuột có nồng độ glucose máu